تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

Summary

يوضح هذا البروتوكول الكشف المتزامن لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والخلايا الحية والخلايا الميتة في الثقافات الأولية الحية من خلايا سطح العين الماوس. 2', 7'-Dichloroforesindiacetate, يتم استخدام يوديد البروبيديوم, وتلطيخ Hoechst لتقييم ROS, الخلايا الميتة, والخلايا الحية, على التوالي, تليها التصوير والتحليل.

Abstract

يتعرض سطح العين للبلى العادية بسبب عوامل بيئية مختلفة. ويشكل التعرض للأشعة فوق البنفسجية - C خطرا على الصحة المهنية. هنا، نُظهر تعرض الخلايا الجذعية الأولية من سطح العين للفأر ة إلى الأشعة فوق البنفسجية-C. أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تشكيل هو قراءة مدى الإجهاد التأكسدي / الضرر. في الإعداد التجريبي في المختبر ، من الضروري أيضًا تقييم النسبة المئوية للخلايا الميتة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي. في هذه المقالة، سوف نبرهن على 2',7'-Dichloroforesindiacetate (DCFDA) تلطيخ الأشعة فوق البنفسجية-C يتعرض الخلايا الجذعية الرئيسية سطح العين الماوس وقياسها على أساس الصور الفلورية من تلطيخ DCFDA. DCFDA تلطيخ يتوافق مباشرة مع جيل ROS. كما نبرهن على القياس الكمي للخلايا الميتة والحية عن طريق تلطيخ متزامن مع يوديد البروبيديوم (PI) وهويشت 3332 على التوالي والنسبة المئوية لخلايا DCFDA (ROS إيجابية) وPI الإيجابية.

Introduction

سطح العين (OS) هو وحدة وظيفية تتكون أساسا من الطبقة الخارجية والظهارة الغدية للقرنية، الغدة lachrymal، الغدة meibomian، الملتحمة، جزء من هوامش غطاء العين والداخلية التي تشير عبر الترانسدوس¹. تركز طبقة القرنية الشفافة على شكل قبة الضوء على شبكية العين. يتكون هذا النسيج اللاوعي من مكونات خلوية مثل الخلايا الظهارية والخلايا القرنية والخلايا الانائية والمكونات الخلوية مثل الكولاجين وجليكوزامينوجليكان2. يتم استنزاف المنطقة من الدموع التي توفر أيضا معظم المواد الغذائية. الموقع التشريحي لنظام التشغيل يجبرها على أن تكون على اتصال مباشر مع البيئة الخارجية، وغالبا ما يعرضها لمختلف المكونات القاسية مثل الضوء الساطع والميكروبات وجزيئات الغبار والمواد الكيميائية. هذا العامل يهيئ نظام التشغيل للإصابات الجسدية ويجعلها عرضة لمختلف الأمراض.

يحدث الإجهاد التأكسدي بسبب اختلال التوازن بين إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وآليات الدفاعات المضادة للأكسدة الذاتية^3. يتم تصنيف ROS إلى جزيئات تفاعلية وجذور حرة ، وكلاهما مشتق من الأكسجين الجزيئي (O₂₎من خلال فوسفوريل الأكسدة الميتوكوندريا^4. تتكون المجموعة السابقة من أنواع غير جذرية مثل بيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂₎، الأكسجين المنفرد⁽¹O₂₎، ويشمل هذا الأخير أنواعًا مثل أنيونات أكسيد فائق (O₂^-) ، وجذور الهيدروكسيل^(•OH) ، من بين أمور أخرى. هذه الجزيئات هي المنتجات الثانوية للعمليات الخلوية العادية وأدوارها قد تورطت في وظائف فسيولوجية هامة مثل نقل الإشارة ، والتعبير الجيني ، والدفاع المضيف^5. ومن المعروف أن إنتاج معزز من ROS يتم إنشاؤه استجابة لعوامل مثل غزو مسببات الأمراض ، xenobiotics ، والتعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV)^4. هذا الإفراط في إنتاج ROS يؤدي إلى الإجهاد التأكسدي الذي يؤدي إلى تلف الجزيئات مثل الأحماض النووية والبروتينات والدهون^6.

تتكون أشعة الشمس الطبيعية، المصدر الأكثر انتشارًا للأشعة فوق البنفسجية، من الأشعة فوق البنفسجية (400-320 نانومتر)، والأشعة فوق البنفسجية-B (320-290 نانومتر)، والأشعة فوق البنفسجية-C (290-200 نانومتر)⁷. وقد أبلغ عن وجود ارتباط عكسي بين الطول الموجي والطاقات الطيفية. وعلى الرغم من أن الغلاف الجوي يمتص الأشعة فوق البنفسجية - C الطبيعية، فإن المصادر الاصطناعية مثل مصابيح الزئبق وأدوات اللحام تنبعث منها، وبالتالي تشكل خطراً مهنياً. أعراض التعرض للعيون تشمل التهاب الكرات الضوئية والتهاب الكظر الملتحمة⁸. إنتاج ROS هي واحدة من الآليات الرئيسية لإلحاق الأشعة فوق البنفسجية الناجمة عن الضرر الخلوي^9. في الدراسة الحالية، ونحن نبرهن على الكشف عن روس باستخدام 2',7'-ديكلوروديهيدروفلورسين diacetate (DCFDA) طريقة تلطيخ في خلايا سطح العين الأولية الماوس / الخلايا الجذعية المعرضة للأشعة فوق البنفسجية-C. تم التقاط الفلورية الخضراء باستخدام المجهر الفلوري. وكانت الخلايا ملطخة بصبغتين، هما Hoechst 33342 ويوديد البروبيديوم الأحمر، لتلطيخ الخلايا الحية والميتة، على التوالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

أجريت التجربة على خلايا العين الأولية / الخلايا الجذعية المستمدة من عين الفأر ة المهق السويسرية. تمت الموافقة على استخدام الحيوانات لحصاد العيون لهذه التجربة من قبل اللجنة الأخلاقية الحيوانية المؤسسية، ينبويا (تعتبر جامعة) (رقم موافقة IEAC، 6a/19.10.2016).

1. الاستعدادات من الكواشف

ملاحظة: اشتقاق الخلايا الأولية/الخلايا الجذعية من سطح العين الماوس خارج نطاق هذا البروتوكول. وبالتالي، فإننا نظهر جرعات التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C، وإعداد الكاشف لتقييم ROS والخلايا الحية والميتة وقياسها الكمي. يرجى الرجوع إلى الجدول 1 للاطلاع على المجلدات ذات الصلة من الكواشف (10٪ مصل الأبقار الجنينية، DCFDA، Hoechst وحلول مخزون يوديد البروبيديوم لإضافتها للحصول على محلول تلطيخ النهائي).

1. إعداد حل الأسهم من 10 m DCFDA عن طريق إذابة 25 ملغ من مسحوق DCFDA في 5.13 مل من DMSO. Aliquot 250 μL كل في العنبر الملونة 1.5 أنابيب مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
2. إعداد محلول مخزون من 10 ملغ / مل (16.23 م م الحل) Hoechst 33342 عن طريق حل محتويات كامل قارورة 25 ملغ في 2.5 مل من الماء المغوني. جعل aliquots من 100 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الملونة العنبر وتخزينها في 2-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. للتخزين على المدى الطويل، قم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
3. إعداد محلول مخزون من 1 ملغ / مل يوديد البروبيديوم في الماء المؤين، aliquot 1 مل لكل من الأنابيب الملونة 1.5 مل العنبر، وتخزينها في 4 درجة مئوية.

2. طلاء الخلايا والعلاج بالأشعة فوق البنفسجية-C

1. قبل الطلاء ، فصل خلايا سطح العين الأولية الماوس معزولة في مختبرنا (النتائج غير المنشورة ؛ هذه الخلايا هي مزيج من الظهارة القرنية والخلايا المترفية والخلايا القرنية) باستخدام عامل انفصال الخلية لطيف(جدول المواد).
2. لوحة 0.2 × 10⁶ خلايا سطح العين الماوس الابتدائية في 35 ملم 0.2٪ غشاء الطابق السفلي مصفوفة المغلفة أطباق ثقافة الخلايا في 2.5 مل من وسائل الإعلام كاملة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪_CO2 وحاضنة رطبة.
   ملاحظة: تتكون الوسائط الكاملة لاستزراع الخلايا الأولية من سطح العين الماوس من الجلوكوز العالي DMEM الذي يحتوي على 20٪ FBS، 1٪ Pen-العقدية، 1٪ Glutamax، 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 1٪ بيروفات الصوديوم، و 0.1٪ α-mercaptoethanol.
3. قبل تعريض الخلايا لجرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية C، تجاهل الحجم الأقصى من وسائل الإعلام والسماح فقط طبقة رقيقة من وسائل الإعلام (~ 500 ميكرولتر) للبقاء على اتصال مع الخلايا، فقط ما يكفي لتغطيتها.
4. خذ الأطباق ، واحدًا تلو الآخر إلى مصدر / غرفة UV-C (الغرفة السفلية لفرن التهجين / رابط عبر الأشعة فوق البنفسجية ؛ جدول المواد). وضع الطبق في الغرفة وإزالة غطاء الطبق. يضمن وضع الغطاء المفتوح للطبق أن تتلقى الخلايا الحد الأقصى لجرعة الأشعة فوق البنفسجية-C أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C.
5. تعريض الخلايا لدرجات/جرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية-C: 1 J/m^2،100J/m^2،1000 J/m² و 10،000 J/m^2.
6. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية- C، استبدل غطاء كل من الأطباق على الفور وأزلها من غرفة مصدر الأشعة فوق البنفسجية-C.
7. جلب كل من الأطباق إلى غطاء محرك الهواء تدفق الهواء laminar وأعلى حتى كل من الأطباق مع 2 مل من وسائل الإعلام الكاملة الطازجة.
8. احتضان الخلايا لمدة 3 ساعة في حاضنة CO₂ 37 درجة مئوية. ثلاث ساعات من احتضان بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C هو الأمثل لتصور وتحديد الآثار في وقت مبكر.

3. إعداد وسائط تلطيخ الخلايا الحية

1. إعداد وسائل الإعلام تلطيخ جديدة خلال آخر 15 دقيقة من 3 ح حضانة الخلية بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية- C.
2. قبل الحارة 10 مل من وسائط تلطيخ تحتوي على 10٪ FBS-DMEM تكملها مع 1٪ القلم العقدية إلى 37 درجة مئوية.
3. إضافة 5 ميكرولتر من 10 مم DCFDA؛ 5 ميكرولتر من محلول Hoechst 10 ملغ/مل و200 ميكرولتر من 1 ملغم/مل يوديد يوم بروبيديوم. التركيزات النهائية للDCFDA، Hoechst و PI هي 5 ميكرومتر، 5 ميكروغرام/مل و 20 ميكروغرام/مل، على التوالي، في 10 مل من وسائط تلطيخ.

4. DCFDA تلطيخ الأشعة فوق البنفسجية - C يتعرض خلايا العين الماوس الأولية

1. بعد 3 ساعة من حضانة الأشعة فوق البنفسجية -C تعرض خلايا العين الأولية الماوس بجرعات مختلفة، يستنشق وسائل الإعلام من الأطباق 35 ملم.
2. تجديد مع 2 مل من إعداد هابا جديدة DCFDA تلطيخ وسائل الإعلام إلى كل من الأطباق بلطف من الجانبين.
3. احتضان الخلايا مع وسائط تلطيخ لمدة 15 دقيقة في الظلام في حاضنة 37 درجة مئوية CO₂ لتلطيخ الخلية الحية.

5. عرض DCFDA (ROS) ، Hoechst وPI الخلايا الملطخة

1. بعد الانتهاء من الحضانة، تجاهل وسائل الإعلام تلطيخ.
2. إضافة وسائط كاملة جديدة إلى الخلايا ومراقبة الخلايا تحت المجهر الفلورسنت مقلوب / صور الخلية(جدول المواد). تصوير الحقول المطلوبة: مشرق الميدان، الفلورية الزرقاء، الفلورية الحمراء، الفلورسينس الأخضر.
   ملاحظة: الخلايا الزرقاء الملطخة الفلورية هي النوى، والفلورسينس الأخضر هو لخلايا توليد ROS والفلورية الحمراء يشير إلى الخلايا الميتة إيجابية PI.

6. القياس الكمي للخلايا الملطخة (Hoechst-Blue و PI-Dead و Green-ROS) باستخدام تقنيات التصوير

1. تصدير الصور التي تم التقاطها تحت المجهر الفلوري المقلوب / صور الخلية إلى ImageJ للقياس الكمي.
2. افتح كل صورة من الصور مرة واحدة، باستخدام كل قناة (أي زرقاء (نواة/هويشت)، خضراء (ROS)، حمراء (ميتة/إيجابية PI)) بالتتابع، للعد. ابدأ من عنصر التحكم غير المكشوف والانتقال بالتتابع إلى 1 و100 و1000 و1000 000^J/m-2.
3. عد الخلايا باستخدام أداة عد الخلايا التي تم وضع علامة عليها كصليب في قائمة البرامج لكل حقل من الحقول [موجب أزرق (إيجابي Hoechst ؛ النوى) ، إيجابي أحمر (PI إيجابي ؛ خلايا ميتة) ، موجب أخضر (ROS)] في كل من الصور المقابلة لكل من العلاجات.
4. عد من خلال النقر على كل من إشارات محددة في كل من الحقول. على سبيل المثال، النقر على النوى الملونة الزرقاء / Hoechst سيعطي العدد الإجمالي للنواة في حقل معين.
5. حساب النتائج كنسبة مئوية من وفيات الخلايا عن طريق تلف الأشعة فوق البنفسجية (عدد الخلايا الإيجابية PI × 100 مقسومة على عدد الخلايا الإيجابية Hoechst) والنسبة المئوية لإنتاج ROS عن طريق تلف الأشعة فوق البنفسجية (عدد الخلايا الإيجابية DCFDA × 100 مقسومًا على عدد الخلايا الإيجابية Hoechst).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

DCFDA هو صبغة عديم اللون التي هي شكل من أشكال الفلورسين المختزلكيميائي استعمل كمؤشر للكشف عن روس في الخلايا. هذه الصبغة يحصل المحاصرين داخل الخلايا وتتأكسد بسهولة إلى الفلورسنت ديكلورودي هيدروفلورسين (DCF), التي تنبعث منها الفلورسيس الأخضر. يمكن الكشف عن هذا الفلورية باستخدام المجهر الفلوري....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

طريقة تلطيخ DCFDA الموصوفة هنا تمكن من تصور ROS في خلايا حية العين الأولية الماوس تعامل مع الأشعة فوق البنفسجية-C. ميزة طريقة تلطيخ هذه هو أنه يسمح أيضا للباحثين لدراسة الآثار الفورية للأشعة فوق البنفسجية -C (3 ساعات بعد التعرض UVC) على الخلايا الحية وتعدادها في وقت واحد لنسبة إيجابية ROS، وكذلك، ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad