JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وتجمع الطريقة المعروضة بين التحليل الكمي لفواصل الحمض النووي المزدوج حبلا (DSBs)، وتوزيع دورة الخلية والمبرمج لتمكين تقييم دورة الخلية الخاصة للحث DSB وإصلاح، فضلا عن عواقب فشل الإصلاح.

Abstract

وقد وضعت طريقة المقدمة أو الإصدارات المعدلة قليلا لدراسة استجابات العلاج محددة والآثار الجانبية لمختلف العلاجات المضادة للسرطان كما تستخدم في الأورام السريرية. وهو يتيح إجراء تحليل كمي وطولي للاستجابة لأضرار الحمض النووي بعد الإجهاد السمية الجينية، كما يسببها العلاج الإشعاعي والعديد من الأدوية المضادة للسرطان. وتغطي هذه الطريقة جميع مراحل الاستجابة للتلف الحمض النووي، وتوفير نقاط النهاية للحث وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا (DSBs)، واعتقال دورة الخلية وموت الخلايا عن طريق المبرمج في حالة فشل الإصلاح. الجمع بين هذه القياسات يوفر معلومات عن آثار العلاج تعتمد على دورة الخلية، وبالتالي يسمح دراسة متعمقة للتفاعل بين الانتشار الخلوي وآليات المواجهة ضد تلف الحمض النووي. وبما أن تأثير العديد من علاجات السرطان بما في ذلك العوامل العلاجية الكيميائية والإشعاع المؤين يقتصر على مراحل دورة الخلايا المحددة أو يختلف بها بشدة، فإن التحليلات المترابطة تعتمد على طريقة قوية ومجدية لتقييم آثار العلاج على الحمض النووي بطريقة محددة دورة الخلية. هذا غير ممكن مع الاختبارات نقطة نهاية واحدة وميزة هامة من الأسلوب المقدم. لا تقتصر هذه الطريقة على أي خط خلية معين وقد تم اختبارها بدقة في العديد من خطوط الخلايا الورم ية وطبيعية الأنسجة. ويمكن تطبيقه على نطاق واسع كاختبار شامل للسمية الجينية في العديد من مجالات الأورام إلى جانب الأورام الإشعاعية، بما في ذلك تقييم عامل الخطر البيئي، وفحص الأدوية وتقييم عدم الاستقرار الوراثي في الخلايا السرطانية.

Introduction

الهدف من الأورام هو قتل أو تعطيل الخلايا السرطانية دون الإضرار بالخلايا الطبيعية. العديد من العلاجات إما بشكل مباشر أو غير مباشر الحث على الإجهاد السمية الجينية في الخلايا السرطانية، ولكن أيضا إلى بعض تمتد في الخلايا الطبيعية. وغالبا ما يتم الجمع بين العلاج الكيميائي أو الأدوية المستهدفة معالعلاج الإشعاعي لتعزيز حساسية الإشعاع للورم المشع 1،2،3،4،5،مما يسمح للحد من الجرعة الإشعاعية لتقليل تلف الأنسجة الطبيعية.

ويسبب الإشعاع المؤين وغيره من العوامل السامة جينيا أنواعا مختلفة من تلف الحمض النووي، بما في ذلك التعديلات الأساسية، ووصلات حبلا متقاطعة، وفواصل أحادية أو مزدوجة. فواصل الحمض النووي حبلا مزدوجة (DSBs) هي آفات الحمض النووي الأكثر خطورة وتحريضها هو المفتاح لتأثير قتل الخلية من الإشعاع المؤين ومختلف الأدوية الخلوية في العلاج الكيميائي الإشعاعي. DSBs لا تضر فقط سلامة الجينوم، ولكن أيضا تعزيز تشكيل الطفرات6،7. لذلك، تطورت مسارات إصلاح DSB مختلفة، وآليات للقضاء على الخلايا التالفة التي لا يمكن إصلاحها مثل المبرمج خلال التطور. يتم تنظيم الاستجابة الكاملة للتلف الحمض النووي (DDR) من قبل شبكة معقدة من مسارات الإشارات التي تصل من التعرف على تلف الحمض النووي والقبض على دورة الخلية للسماح لإصلاح الحمض النووي، إلى موت الخلايا المبرمجة أو التعطيل في حالة فشل الإصلاح8.

وقد تم تطوير طريقة قياس التدفق المقدمة للتحقيق في نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج بعد الإجهاد السمية الجينية في فحص شامل واحد يغطي الحث وإصلاح DSB، فضلا عن عواقب فشل الإصلاح. فهو يجمع بين قياس علامة DSB تطبيقها على نطاق واسع γH2AX مع تحليل دورة الخلية وتحريض المبرمج، وذلك باستخدام التحليل subG1 الكلاسيكية وتقييم أكثر تحديدا من تنشيط caspase-3.

الجمع بين هذه النقاط النهائية في فحص واحد ليس فقط يقلل من الوقت والعمالة ونفقات التكلفة، ولكن أيضا تمكن قياس دورة محددة الخلية من الحث DSB وإصلاح، فضلا عن تنشيط caspase-3. ولن تكون هذه التحليلات ممكنة من خلال الاختبارات التي أجريت بشكل مستقل، ولكنها ذات صلة وثيقة بالفهم الشامل للاستجابة لأضرار الحمض النووي بعد الإجهاد السمية الجينية. العديد من الأدوية المضادة للسرطان، مثل المركبات الخلوية، موجهة ضد انقسام الخلايا وكفاءتها تعتمد بشدة على مرحلة دورة الخلية. كما يعتمد توافر عمليات إصلاح DSB المختلفة على مرحلة دورة الخلية واختيار المسار وهو أمر بالغ الأهمية لدقة الإصلاح، وبدوره يحدد مصير الخلية9،10،11، 12. وبالإضافة إلى ذلك، فإن قياس مستويات DSB الخاص بدورة الخلايا أكثر دقة من التحليل المجمع، لأن مستويات DSB لا تعتمد فقط على جرعة مركب أو إشعاع سام جينياً، بل تعتمد أيضاً على محتوى الحمض النووي للخلية.

وقد استخدمت هذه الطريقة لمقارنة فعالية العلاجات الإشعاعية المختلفة للتغلب على آليات المقاومة في الورم الأرومي الدبقي13 وتشريح التفاعل بين الإشعاع المؤين والأدوية المستهدفة في الساركوما العظمية14،15 وسرطان الرعبدات غير النمطية التيرتويد16. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام الطريقة الموصوفة على نطاق واسع لتحليل الآثار الجانبية للراديو والعلاج الكيميائي على الخلايا الجذعية mesenchymal17،18،19،20،21، 22،23،24، والتي هي ضرورية لإصلاح تلف الأنسجة الطبيعية الناجمة عن العلاج ولها تطبيق محتمل في الطب التجديدي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1- الإعداد

  1. إعداد ≥ 1 × 105 الخلايا / عينة في أي نوع من وعاء الثقافة كمادة البداية.
    1. على سبيل المثال، إجراء تجربة دورة زمنية بعد تعرض خلايا الورم الأرومي الدبقي تحت 87 للإشعاع المؤين: خلايا U87 تحت اللمعة تحت المشعع في قوارير T25 في ثلاثة توائم لكل نقطة زمنية. اختر نقاط الوقت المبكر (15 دقيقة حتى 8 ساعة بعد التشعيع) لمتابعة حركية إصلاح DSB (مستوى γH2AX) ونقاط الوقت المتأخرة (24 ساعة حتى 96 ساعة) لتقييم مستويات DSB المتبقية، وتأثيرات دورة الخلية والمبرمج.
      ملاحظة: ولا يقتصر البروتوكول على تجارب التشعيع أو أي خط خليوي محدد. وقد تم اختباره مع العديد من خطوط الخلايا من جميع الأنواع، من أنواع مختلفة ولظروف العلاج المختلفة.
  2. إعداد الحلول التالية بما في ذلك حجم الزائدة 10٪.
    1. إعداد 2 مل لكل عينة من محلول التثبيت تتكون من 4.5٪ بارافورماليد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). إعداد الحل جديدة. تخفيف PFA في PBS عن طريق التدفئة إلى 80 درجة مئوية مع التحريك البطيء تحت غطاء الدخان. تغطية قارورة مع رقائق الألومنيوم لمنع فقدان الحرارة. دع الحل يبرد لدرجة حرارة الغرفة واضبط الحجم النهائي. تمرير الحل من خلال مرشح السليلوز مطوية، الصف 3hw (انظر جدولالمواد).
      تحذير: أبخرة PFA سامة. تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك السيارة الدخان والتخلص من النفايات PFA بشكل مناسب.
    2. إعداد 3 مل لكل عينة من محلول نفاذية تتكون من الإيثانول 70٪ في الجليد البارد H2O. مخزن في -20 درجة مئوية.
    3. إعداد 7 مل لكل عينة من محلول الغسيل تتكون من 0.5٪ ألبوم المصل البقري (BSA) في PBS.
    4. إعداد 100 درجة مئوية لكل عينة من BSA 3٪ في PBS كمثوية للجسم المضاد.
    5. إعداد 100-250 درجة مئوية لكل عينة من محلول تلطيخ الحمض النووي تتكون من 1 ميكروغرام / مل 4 '، 6-دياميدين-2-فينيليندول (DAPI) في PBS.
  3. تعيين الطرد المركزي لأنابيب 15 مل إلى 5 دقائق في 200 × ز و 7 درجة مئوية. دع الطرد المركزي يبرد واستخدم هذه الإعدادات لجميع خطوات الطرد المركزي.

2. جمع عينة

  1. إذا كانت معالجة الخلايا الملتصقة (على سبيل المثال، خلايا الورم الأرومي الدبقي U87 المزروعة في قوارير T25 مع 5 مل من وسيط النسر المعدل دولبكو المكمّل بمصل البقر الجنيني بنسبة 10% عند 37 درجة مئوية و5% من الغلاف الجوي لثاني أكسيد الكربون)، استمر مع الخطوات 2.1.1. و 2-1-2. لخلايا التعليق المضي قدما مباشرة إلى الخطوة 2.1.2.
    1. جمع المتوسطة في أنبوب الطرد المركزي. فصل الخلايا باستخدام طريقة زراعة الخلايا الروتينية، والتي قد تشمل استخدام التربسين، حمض إيثيلينديامينيتراسيتيك (EDTA) أو غيرها من وكلاء مفرزة الخلايا.
      1. لخلايا U87، PBS قبل الدفء والتربسين / EDTA (انظر جدولالمواد) إلى 37 درجة مئوية، وغسل طبقة الخلية مع 1 مل من PBS، واحتضان الخلايا لمدة 1-2 دقيقة مع 1 مل من التربسين / EDTA ومفرزة خلية الدعم عن طريق النقر على قارورة. جمع كل حل الغسيل وتعليق الخلية في الأنبوب مع المتوسطة.
    2. طرد مركزي الخلايا، وتجاهل المتوسطة وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من PBS.
  2. Pipet الخلايا صعودا وهبوطا عدة مرات لضمان تعليق خلية واحدة ونقل تعليق الخلية في أنبوب مع 2 مل من محلول التثبيت (4.5٪ PFA / PBS، 3٪ التركيز النهائي).
    تحذير: أبخرة PFA سامة. تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك السيارة الدخان والتخلص من النفايات PFA بشكل مناسب.
  3. حضانة الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. طرد مركزي الخلايا والتخلص من supernatant عن طريق decantation.
  5. تخفيف بيليه الخلية عن طريق النقر على الأنبوب وإعادة تعليق الخلايا في 3 مل من الإيثانول 70٪. المضي قدما مباشرة مع الخطوة التالية أو تخزين العينات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أسابيع.

3. الغسيل وتلطيخ

  1. طرد مركزي الخلايا والتخلص من supernatant عن طريق decantation.
  2. تخفيف بيليه الخلية عن طريق النقر على الأنبوب. إعادة تعليق الخلايا في 3 مل من محلول الغسيل (0.5٪ BSA / PBS)، والطرد المركزي وتجاهل supernatant.
  3. كرر خطوة الغسيل 1x مع 3 مل، ثم 1X مع 1 مل محلول الغسيل. في الخطوة الأخيرة، تجاهل supernatant بعناية عن طريق الأنابيب. الحرص على عدم ستنشق بيليه.
  4. تمييع الأجسام المضادة ضد γH2AX، فوسفو-هيستون H3 (Ser10) وcaspase-3 (انظر جدولالمواد) في 100 ميكرولتر / عينة مع مادة مخففة الأجسام المضادة (3٪ BSA / PBS).
  5. تخفيف بيليه الخلية عن طريق النقر على الأنبوب وإعادة تعليق الخلايا في 100 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة أعدت في الخطوة 3.4. إبقاء العينات في الظلام من هذه الخطوة فصاعدا.
  6. احتضان العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  7. طرد مركزي الخلايا وتجاهل supernatant بعناية عن طريق الأنابيب. الحرص على عدم ستنشق بيليه.
  8. تخفيف بيليه الخلية عن طريق النقر على الأنبوب وإعادة تعليق الخلايا في 100-250 درجة مئوية من الحمض النووي تلطيخ الحل (1 ميكروغرام / مل DAPI / PBS).
    1. استخدام 100 درجة مئوية إذا 1-2 × 105 خلايا موجودة وزيادة حجم لأرقام الخلايا أعلى (250 درجة مئوية ل ≥ 1 × 106 الخلايا). المضي قدما مباشرة مع الخطوة التالية أو تخزين العينات في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
      ملاحظة: بالنسبة لبعض أنواع الخلايا تحسين تركيز DAPI يمكن أن تساعد على تحسين فصل مراحل دورة الخلية.
  9. Pipet العينات من خلال غطاء مصفاة الخلية من أنبوب عينة مع حجم المسام شبكة من 35 م.

4- القياس

  1. ضع العينات على الجليد، وابدأ مقياس التدفق (راجع جدولالمواد) الذي تم تكوينه باستخدام إعداد بصري وفقًا للجدول 1 واضغط على الزر الرئيسي. إذا لزم الأمر، قم بتشغيل الليزر فوق البنفسجي (الطول الموجي 355 نانومتر) بشكل منفصل وتعيين الطاقة إلى 10 mW باستخدام البرنامج المناسب.
  2. افتح برنامج الاكتساب (راجع جدولالمواد) ، قم بتسجيل الدخول وإنشاء تجربة جديدة بالنقر فوق الزر تجربة جديدة على شريط أدوات المستعرض.
  3. استخدم نافذة المفتش لتخصيص اسم التجربة واختيار "5 عقود سجل" لعرض الرسم.
  4. انقر فوق الزر نموذج جديد في شريط أدوات المستعرض ثم قم بتوسيع الإدخال الجديد بالنقر فوق الرمز '+' في جانبه الأيسر لإظهار الأنبوبالأول . حدد الرمز والنوع المعنيين لإعادة تسمية العينة (على سبيل المثال، نوع الخلية) والأنبوب (معرّف العينة). انقر فوق مؤشر أنبوب الأنبوب الأول (رمز يشبه السهم على يساره) لتحويله إلى اللون الأخضر (نشط).
  5. افتح علامة التبويب معلمات في نافذة مقياس السيتومتر واختر المعلمات وفقًا للجدول 1. حذف كافة المعلمات غير الضرورية.
    ملاحظة: قد تختلف أسماء المعلمات استناداً إلى الإعدادات المسبقة المخصصة (على سبيل المثال، Cy3 بدلاً من Alexa555). تأكد من تطابق التحديد مع الفلاتر البصرية وأجهزة الكشف في الجدول 1. والمسارات الخفيفة لجميع الفلوروفوريات مستقلة تماماً في هذا الإعداد ولا يلزم التعويض عن التداخل الطيفي؛ ومع ذلك، قد يكون من الضروري إذا تم استخدام إعداد بصري آخر.
  6. افتح إطار ورقة العمل وأنشئ قطع أرض وفقًا للشكل 1. رسم 2 نقطة المؤامرات و 4 مخططات الرسوم البيانية باستخدام أزرار شريط الأدوات المقابلة وانقر فوق تسميات المحور لاختيار المعلمات المناسبة (مبعثر الجبهة (FSC-A) مقابل مبعثر الجانب (SSC-A)، DAPI-W مقابل DAPI-A والرسم البياني لDAPI-A وكل الأجسام المضادة المقترنة فلوروفور.
  7. قم بإرفاق عينة تحكم بمقياس السيتومتر ثم اضغط على الزر تشغيل على الأداة. حدد الأنبوب الأول في إطار المستعرض من البرنامج وانقر فوق الزر الحصول على بيانات في لوحة معلومات الاكتساب. ضبط حجم حقن العينة باستخدام أزرار منخفضةأو متوسطة أو عالية وعجلة ضبط غرامة على الصك. يفضل العمل في إعداد منخفض، ولكن حاول الحصول على ما لا يقل عن 100 حدث/ثانية (راجع لوحة معلومات الاكتساب).
  8. ضبط الفولتية للكشف عن FSC، SSC وDAPI في علامة التبويب المعلمات من نافذة المفتش باستخدام المؤامرات نقطة في الشكل 1 كمبدأ توجيهي. قم بالتبديل إلى مقياس لوغاريتمي لمعلمات FSC وSSC إذا كان عدد الخلايا يظهر مشتتاً جداً على مقياس خطي.
  9. اضغط على زر الاستعداد على مقياس السيتومتر ومتابعة إعداد ورقة العمل في البرنامج.
    1. استخدم أداة بوابة المضلع لتعريف السكان الخلايا في مؤامرة FSC-A مقابل SSC-A وأداة "بوابة مستطيل" لتعريف السكان SingleCells في DAPI-W مقابل DAPI-A مؤامرة. اضغط على Ctrl + G مفاتيح لإظهار التسلسل الهرمي للسكان وانقر على أسماء البوابات الافتراضية لإعادة تسميتها.
    2. في وقت لاحق انقر بزر الماوس الأيمن على جميع الرسوم البيانية واختيار إظهار السكان | SingleCells من قائمة السياق.
  10. تحسين الجهد للكشف عن الفلوروفورات المقترنة بالأجسام المضادة لتغطية النطاق الديناميكي الكامل عن طريق الحصول في وقت لاحق على السيطرة والعينات المعالجة. تعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء وتجنب تشبع كاشف. تأكد من أن الذروة Alexa488 في السكان SingleCells لا يتم اقتطاع في عنصر التحكم ولا العينة المعالجة.
  11. اضغط على زر الاستعداد على مقياس السيتومتر ثم بشكل اختياري تنفيذ الخطوات 4.11.1-4.11.3 في إطار ورقة العمل من البرنامج للحصول على تقدير تقريبي لآثار العلاج أثناء الحصول على عينة.
    1. حدد SingleCells في التسلسل الهرمي للسكان واستخدم أداة "بوابة المستطيل" لتعريف السكان G1 في رسم DAPI-W مقابل DAPI-A. انقر بزر الماوس الأيمن على الرسم البياني Alexa488 واختر إظهار السكان | G1 من قائمة السياق.
    2. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الرسم البياني Alexa488 واختر إنشاء "عرض إحصائيات" من قائمة السياق. انقر بزر الماوس الأيمن فوق طريقة عرض الإحصائيات واختر تحرير طريقة عرض الإحصائيات. انتقل إلى علامة التبويب إحصائيات وقم بتنشيط مربع الاختيار لمتوسط إشارة Alexa488 في مجموعة سكان G1 (إلغاء تنشيط كافة الخيارات الأخرى).
    3. حدد SingleCells في التسلسل الهرمي للسكان واستخدم أداة "بوابة الفاصل الزمني" لتعريف السكان subG1و M و Casp3+ في DAPI-A و Alexa555-A (Cy3-A في الشكل1) و Alexa647-A الرسوم البيانية.
  12. اضغط على الزر تشغيل على مقياس السيتومتر وقياس العينات باستخدام لوحة معلومات الاكتساب في البرنامج. تعيين بوابة التوقف إلى كافة الأحداث أو بوابة الخلايا (إذا كانت هناك العديد من الجسيمات الصغيرة موجودة) وعدد الأحداث لتسجيلإلى 10,000.
  13. انقر فوق التالي Tube لإنشاء نموذج جديد إعادة تسميته في إطار المستعرض انقر فوق الحصول على البيانات لبدء عملية الامتلاك وتسجيل البيانات لبدء التسجيل.
  14. اختر ملف | تصدير | التجارب من شريط القوائم واختر تصدير الدليل في مربع الحوار لحفظ البيانات كملفات '.fcs'. بشكل اختياري حفظ التجربة كملف مضغوط إضافي إذا لتمكين إعادة استيراد التجربة في نقطة زمنية لاحقة.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام إعداد التجارب الموجودة بسهولة مع تحرير | تكرار بدون بيانات.

5 - تقييم البيانات

  1. سحب وإسقاط ملفات '.fcs' في مستعرض عينة من برنامج تحليل التدفق cytometric (انظر جدول المواد). تطبيق استراتيجية التجشمع الموضحة في الشكل 2. تأكد من أن البوابات تناسب السكان المقابلة في جميع العينات قبل المضي قدما مع بوابة ابنة المقبل.
    1. لتطبيق التغييرات على جميع العينات، حدد البوابة التي تم تغييرها في نموذج المستعرض، ونسخها عن طريق الضغط على Ctrl +C، وحدد البوابة الأصل، واضغط على Ctrl + Shift + E لتحديد العقد المكافئة في جميع العينات واضغط على Ctrl + V للصق أو الكتابة فوق البوابة. لا تستخدم بوابات المجموعة.
    2. انقر نقراً مزدوجاً فوق العينة الأولى في المستعرض لفتح مؤامرة SSC-A مقابل FSC-A. استخدم أداة المضلع في شريط الأدوات لتعريف مجموعة الخلايا (الشكل2،الرسم 1)، باستثناء الحطام من التحليل. تأكد من أن البوابة واسعة بما فيه الكفاية نحو الزاوية اليمنى العليا لاستيعاب التحولات المتعلقة بالعلاج، ولكن تقييد الحدود التي تواجه الزاوية اليسرى السفلى من المؤامرة لاستبعاد الخلية بشكل موثوق.
    3. انقر نقراً مزدوجاً فوق بوابة الخلايا لفتح إطار رسم جديد وتغيير المحاور إلى DAPI-W (عمودي) مقابل DAPI-A (أفقي) بالنقر فوق تسميات المحور. استخدام أداة مستطيل لتعريف السكان SingleCells (الشكل 2، مؤامرة 2)، باستثناء doublets الخلية أو كتل من التحليل (doublets من خلايا G1 لها نفس كثافة DAPI-A كما G2 و M الخلايا، ولكن أعلى بكثير DAPI-W القيمة).
      ملاحظة: سوف يؤدي اختلاف عدد الخلايا في عينات مختلفة إلى حدوث تحولات في قوة إشارة DAPI-A الإجمالية بسبب ربط التوازن من DAPI بالحمض النووي. لن يؤثر هذا على تحليل دورة الخلية، ولكن قد يكون من الضروري ضبط الحد الأيمن للعينة بوابة الخلية الواحدة حسب العينة لحساب هذه التحولات.
    4. انقر نقراً مزدوجاً فوق بوابة SingleCells لفتح إطار مؤامرة جديدة وتغيير المحاور لإظهار الرسم البياني DAPI-A. استخدم أداة القطاعين لتمييز الخلايا المفردة مع محتوى الحمض النووي العادي (مجموعةCellCycle) من الخلايا المبرمجة ذات الحمض النووي المتدهور (السكانsubG1). في وقت لاحق حدد البوابات الجديدة في المتصفح واضغط على Ctrl + R لإعادة تسميتها وفقا لذلك (الشكل2،مؤامرة 3).
    5. حدد بوابة CellCycle في المتصفح واختر أداة | علم الأحياء | دورة الخلية... من شريط القوائم لفتح أداة نمذجة دورة الخلية. اختر دين جيت فوكس25،26 في قسم النموذج لتقدير تواتر الخلايا في G1 ، S و G2 / M المرحلة (الشكل2، مؤامرة 4). استخدام القيود فقط في حالة ضعف أداء النمذجة (تقليل الانحراف الجذر متوسط مربع بين النموذج والبيانات).
    6. إنشاء بوابات لG1 (أداةالقطع الناقص)، S (أداةالمضلع) وG2 + M (أداة القطعالناقص) المرحلة في DAPI-W مقابل DAPI-A مؤامرة من السكان CellCycle لتمكين قياس γH2AX دورة الخلية محددة ( الشكل 2، مؤامرة 5). لا تستخدم أداة النمذجة لدورة الخلايا التلقائية استناداً إلى الرسم البياني DAPI-A، لأن هذا يمكن أن يكون غير دقيق.
      ملاحظة: وقد يكون من الضروري نقل البوابات على طول عينة محور DAPI-A حسب العينة لمراعاة التحولات المذكورة أعلاه في قوة إشارة DAPI الإجمالية. فقط تحريك البوابات الثلاثة كمجموعة ولا تغير شكل البوابات الفردية لتجنب التحيز.
    7. استخدام أداة ثنائية القطاع للتمييز بين فوسفو-هيستون H3 إيجابية (M) وسلبية(M-) الخلايا في Alexa555-A الرسم البياني للسكان CellCycle (الشكل2،مؤامرة 6). عقد Ctrl وحدد البوابات G2 + M و M-. اضغط على Ctrl + Shift + A لإنشاء بوابة G2 (G2+M & M-).
    8. استخدم أداة Bisector للتمييز بين caspase-3-positive(Casp3+) والخلايا السلبية(Casp3-) في Alexa647-A الرسم البياني للسكان SingleCells (الشكل2، مؤامرة 7). تعيين العتبة بحيث يصل متوسط السكان Casp3+ في عناصر التحكم غير المعالجة إلى ~0.8% لضمان حساسية عالية وتقليل الاختلافات في إجراء نسبة من التبذير إلى.
    9. اضغط على Ctrl + T لفتح محرر الجدول وتكوينه وفقًا للشكل 3. اسحب وأسقط مجموعات مختلفة من نموذج المستعرض إلى محرر الجدول وانقر نقراً مزدوجاً فوق الصفوف لتغيير إعدادات الإحصاء والمعلمة والاسم. إزالة الصفوف غير الضرورية التي يتم إضافتها تلقائيا بعد السحب والإفلات من رمز النمذجة دورة الخلية عن طريق تحديد الصفوف والضغط على Del.
    10. اختر إلى ملف، التنسيق والوجهة في المقطع إخراج من شريط القائمة ثم انقر فوق إنشاء جدول لتصدير البيانات كملف '.xlsx'.
  2. استخدم برنامج حساب الجدول (انظر جدول المواد) لمزيد من التحليل للبيانات وفقًا للملف التكميلي 1 (FACS_Analysis_Template_(1).xlsx).
    1. تصحيح ترددات الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة بحيث يصل مجموعها إلى 100٪ عن طريق تطبيق الصيغة X ' = X * 100 / (جميع مراحل دورة الخلية)، مع X': القيمة المصححة، X: القيمة الخام، إلى كل مرحلة دورة الخلية.
      ملاحظة: تحدث الانحرافات عن مبلغ 100% بسبب عدم الدقة في نمذجة دورة الخلايا، ولكنها عادة ما تكون صغيرة (<5%)..
    2. تطبيع كثافة γH2AX الوسيطة لمحتوى الحمض النووي في مراحل دورة الخلية المختلفة عن طريق تقسيم القيم في المرحلة S بنسبة 1.5 وفي G2 و M المرحلة بنسبة 2.0.
    3. لحساب مستوى γH2AX تطبيع مجتمعة في مجموع السكان الخلية، واستخدام الصيغةI A = IG1 * G1 + IS * S + IG2 * G2 + IM * M، حيث أناA،IG1،IS،IG2،IM يتم تطبيع كثافة γH2AX الوسيطة للجميع، G1، S، G2، M الخلايا على التوالي وG1، S، G2، M يتم تصحيح تردد الخلايا في مرحلة دورة الخلية المعنية.
    4. بالنسبة لمستويات γH2AX العادية وتواتر الخلايا الفرعية 1 وcaspase-3 الإيجابية، طرح متوسط قيمة عناصر التحكم غير المعالجة من كل عينة.
    5. حساب الانحراف المتوسط والمعياري لكل معلمة من كافة العينات المتماثلة ورسم النتائج في الرسومات التخطيطية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم تشعيع خلايا الورم الأرومي الدبقي البشرية U87 أو LN229 مع 4 غراي من الفوتون أو الإشعاع الأيون الكربوني. تم قياس مستويات γH2AX الخاصة بدورة الخلية والمبرمج في نقاط زمنية مختلفة تصل إلى 48 ساعة بعد التشعيع باستخدام طريقة قياس التدفق المعروضة هنا (الشكل 3). وفي كلا الخطين الخلويين، ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

طريقة مميزة سهلة الاستخدام، ويقدم قياس سريع ودقيق واستنساخ استجابة الضرر الحمض النووي بما في ذلك كسر حبلا مزدوجة (DSB) التعريفي وإصلاح، وآثار دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج. ويوفر الجمع بين نقاط النهاية هذه صورة أكمل لعلاقاتها المتبادلة من الاختبارات الفردية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر فريق مرفق قياس التدفق في المركز الألماني لبحوث السرطان (DKFZ) على دعمهم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,000 µL filter tipsNerbe plus07-693-8300
100-1,000 µL pipetteEppendorf3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore sizeBD Falcon352235
15 mL tubesBD Falcon352096
200 µL filter tipsNerbe plus07-662-8300
20-200 µL pipetteEppendorf3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011BioLegend613406Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414BD Pharmingen560626Dilute 1:20
BD FACSClean solutionBD Biosciences340345For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solutionBD Biosciences340346For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)BiochromL 182Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutaminBiochromFG 0415Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absoluteVWR20821.330
Excel softwareMicrosoft
FBS Superior (fetal bovine serum)BiochromS 0615Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 softwareLLConline order
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hwNeoLab11416
LSRII or LSRFortessa cytometerBD Biosciences
MG132Calbiochem474787optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+Heraeus
ParaformaldehydeAppliChemA3813Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639Cell Signaling Technology#3475Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2Integra Biosciences155 016
Serological pipettes, 10 mLCorning4488
Serological pipettes, 25 mLCorning4489
Serological pipettes, 5 mLCorning4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand)BiomolAG-40T-0002-C020optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasksGreiner bio-one690160Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTAPAN BiotechP10-025500Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cellsATCCATCC-HTB-14Example cell line used in the protocol

References

  1. Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122(2006).
  2. Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
  3. Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
  4. Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
  5. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  6. Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
  7. Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
  8. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  9. Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
  10. Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  11. Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
  12. Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
  13. Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
  14. Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).
  15. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  16. Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).
  17. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
  18. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
  19. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
  20. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035(2016).
  21. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645(2016).
  22. Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
  23. Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).
  24. Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
  25. Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
  26. Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
  27. Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
  28. Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  29. Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
  30. Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
  31. Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
  32. Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161(2017).
  33. Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).
  34. Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
  35. Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved