JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

القوى الميكانيكية مهمة للسيطرة على هجرة الخلايا. يوضح هذا البروتوكول استخدام هيدروجيلات مرنة يمكن تشويهها باستخدام ميكرومازيت زجاجي وميكرومنبولاتور لتحفيز الخلايا ذات التدرج المحلي للتصلب لإحداث تغييرات في بنية الخلايا والهجرة.

Abstract

Durotaxis هي العملية التي الخلايا الشعور والاستجابة لدرجات التوتر. من أجل دراسة هذه العملية في المختبر ، يجب التلاعب بصلابة الركيزة الكامنة وراء الخلية. في حين أن المواد المائية مع صلابة متدرجة والاختبارات الهجرة على المدى الطويل أثبتت فائدتها في الدراسات durotaxis، والاستجابات الفورية والحادة للتغيرات المحلية في التوتر الركيزة تسمح دراسة مركزة لحركات الخلايا الفردية والأحداث الإشارات دون الخلوية. لاختبار تكرار قدرة الخلايا على الشعور والاستجابة لصلابة الركيزة الكامنة، يتم استخدام طريقة معدلة لتطبيق التدرجات الحادة من زيادة التوتر على الخلايا الفردية المستزرعة على هيدروجيلات مشوهة مما يسمح في الوقت الحقيقي التلاعب في قوة واتجاه تصلب التدرجات المنقولة على الخلايا المعنية. بالإضافة إلى ذلك، من خلال ضبط تفاصيل ومعلمات الفحص، مثل شكل وأبعاد micropipette أو الموقف النسبي، ووضع، واتجاه التدرج المطبق، يمكن تحسين الفحص لدراسة أي ميكانيكيا نوع الخلية الحساسة والنظام. ويمكن تغيير هذه المعلمات لتغيير موثوق الحوافز المطبقة وتوسيع وظيفة وبراعة الفحص. تسمح هذه الطريقة بفحص كل من الحركة الجوروتيكعلى المدى الطويل، فضلا عن تغييرات فورية أكثر في الإشارات الخلوية والديناميات المورفولوجية استجابة لتغير صلابة.

Introduction

على مدى العقود القليلة الماضية، وقد حصلت أهمية الخصائص الميكانيكية لبيئة الخلية على اعتراف متزايد في بيولوجيا الخلايا. الأنسجة المختلفة والمصفوفات خارج الخلية لها تصلب نسبي مختلف، وكما تهاجر الخلايا في جميع أنحاءالجسم، فإنها تنقل هذه التغييرات، وذلك باستخدام هذه الخصائص الميكانيكية لتوجيهها 1،2،3 , 4 , 5 , 6 , 7.تستخدم الخلايا صلابة أنسجة معينة لإعلام سلوكها الميتيلي أثناء عمليات مثل التنمية، والتئام الجروح، وورم السرطان. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية التي تسمح الإحساس والاستجابة لهذه المدخلات الميكانيكية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير1،2،3،4،5، 6 , 7.

من أجل دراسة الآليات التي من خلالها الخلايا تستجيب للإشارات البيئية المادية، يجب التلاعب صلابة أو صلابة الركيزة الكامنة وراء الخلايا الملتصقة. في عام 2000، وضعت تشون مين لو، يو لي وانغ وزملاؤه اختبار8 حيث استجابة الخلية الفردية motile لتغيير العظة الميكانيكية يمكن اختبارها مباشرة عن طريق تمتد مصفوفة خارج الخلية مشوهة (ECM) المغلفة بولياكريلاميد هيدروجيلات التي كانت مطلية الخلايا. تظهر الخلايا تفضيلًا كبيرًا للهجرة نحو ركائز أكثر صلابة، وهي ظاهرة أطلقوا عليها اسم "durotaxis".

ومنذ التقرير الأصلي في عام 2000، استخدمت تقنيات أخرى كثيرة لدراسة الدوتاكسيات. وقد تم تصنيع التدرجات صلابة حاد من قبل صب المواد الهلامية على ميزات جامدة مثل حبات البوليسترين9 أو وظائف البوليمر قاسية10 أو عن طريق البلمرة الركيزة حول حواف الأغطية الزجاجية11 لخلق الميكانيكية ' خطوة الحدود". بدلا من ذلك، تم تصنيع هيدروجيلات مع التدرجات تصلب الضحلة ولكن ثابتة من قبل مجموعة متنوعة من الأساليب مثل التدرجات من كروسلينكر التي أنشأتها أجهزة microfluidic12،13 أو جنبا إلى جنب قطرات محلول هيدروجيل من صلابةمختلفة 8، أو هيدروجيلمع كروسلينكر رد الفعل الضوئي تعامل مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية متدرجة لخلق التدرج صلابة خطي14،15. وقد استخدمت هذه التقنيات إلى تأثير كبير للتحقيق في الحركة الخلوية الجوروتيك بشكل جماعي مع مرور الوقت. ومع ذلك، عادة ما يتم تصنيع هذه الميزات مقدما من طلاء الخلايا وخصائصها لا تزال متسقة على مدى التجربة، والاعتماد على حركة الخلايا العشوائية لأخذ العينات من التدرجات الميكانيكية. لا يمكن لأي من هذه التقنيات مراقبة التغيرات السريعة في السلوك الخلوي استجابة للمحفزات الميكانيكية الحادة.

من أجل مراقبة الاستجابات الخلوية للتغيرات الحادة في البيئة الميكانيكية، والاختبارات durotaxis خلية واحدة تقدم العديد من المزايا. في هذه الاختبارات، يتم إعطاء الخلايا الفردية التحفيز الحاد والميكانيكي عن طريق سحب الركيزة الكامنة بعيدا عن الخلية مع micropipette الزجاج، وبالتالي إدخال التدرج الاتجاهي من التوتر مصفوفة الخلية. ثم يتم ملاحظة التغيرات في سلوك motile، مثل سرعة أو اتجاه الهجرة، بواسطة مجهرية تباين مرحلة الخلية الحية. وييسر هذا النهج المراقبة المباشرة للعلاقات السببية والفعالة بين المحفزات الميكانيكية وهجرة الخلايا، حيث أنه يسمح بالتلاعب السريع والمتكرر في اتجاه وحجم تدرج التوتر وتقييم ما يترتب عليه من ذلك الردود الخلوية في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحفيز ميكانيكيا الخلايا التي تعبر عن البروتينات الانصهار الفلورسنت أو أجهزة الاستشعار الحيويلتصور التغيرات في كمية، نشاط، أو توطين تحت الخلية من البروتينات يشتبه في أن تشارك في المكننة و الدوروسات.

وقد استخدمت هذه التقنية من قبل المجموعات التي تدرس durotaxis8،16 ويوصف هنا كما تم تكييفها من قبل مختبر هاو لدراسة السلوك الجوروتيك من الخلايا السرطانية SKOV-3 والآليات الجزيئية التي تحت [دوروتاكسيس]17. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف طريقة معدلة لتصنيع هيدروجيلمع طبقة واحدة، حتى من ميكروسفيرز الفلورسنت بالقرب من سطح ثقافة الخلية. وهذا يسهل التصور والاستفادة المثلى من التدرجات سلالة micropipette ولدت ويمكن أن تسمح بتقييم انقباض الخلايا عن طريق الفحص المجهري قوة الجر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تصنيع هيدروجيلات بولياكريلاميد مشوهة مع ميكروسفيرس الفلورسنت جزءا لا يتجزأ

ملاحظة: تصف الاتجاهات البلمرة من هيدروجيل 25 كيلوباسكال الذي هو 22 ميكرومتر في القطر وحوالي 66 ميكرومتر سميكة. ويمكن تعديل كل من هذه المعلمات أو كلها ويمكن العثور على الاتجاهات للقيام بذلك في الجدول 1 وفي الملاحظات17.

  1. تفعيل الأطباق الزجاجية أو الأغطية
    1. قم بإعداد حل عمل الربط silane لتنشيط طبق التصوير ذو القاع الزجاجي أو غطاء الغطاء الذي يناسب غرفة التصوير بالخلايا الحية. مزيج 950 درجة مئوية من الإيثانول 95٪، 50 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي، و 5 ميكرولتر من ربط سيلين (y-ميثاكريلبروبيلتريميثوسيلين).
      ملاحظة: استخدام غطاء أسفل أكبر مقارنة مع غطاء أعلى سيعطي مساحة إضافية للعمل عند إعداد هلام، وسوف تسهل وضع micropipette الزجاج في خطوات لاحقة. أيضا، إذا كنت تستخدم غطاء بدلا من طبق التصوير الزجاج القاع، وتنظيف غطاء كما هو موضح في القسم التالي.
    2. تنشيط سطح الزجاج لمدة 20 ثانية مع عصا الإكليل وتراكب على الفور 50 درجة مئوية من حل العمل سيلين ربط. السماح للحل لتجف لمدة 10 دقيقة.
    3. شطف مرتين مع الإيثانول 95٪، ثم مرتين مع isopropanol ومن ثم السماح للأغطية لairdry لمدة 20 دقيقة تقريبا.
      ملاحظة:يمكن تخزين الزجاج المنشط لمدة تصل إلى أسبوع واحد في المجفف.
  2. تنظيف الأغطية العلوية
    1. تنظيف الأغطية أعلى 22 ملم عن طريق الحضانة في 2٪ حمض الهيدروكلوريك في 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم يغسل في ddH2O لمدة 10 دقيقة مرتين.
    2. احتضان الأغطية في حل من 2٪ كوفيت تنظيف التركيز في ddH2O في 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم يغسل في ddH2O لمدة 10 دقيقة مرتين.
    3. احتضان الأغطية في ddH2O في 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم في 70٪ الإيثانول في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم الهواء الجاف في 60 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأغطية النظيفة إلى أجل غير مسمى في المجفف النظيف.
  3. ميكروسفير الفلورسنت / حبة الترسيب على الأغطية العلوية
    1. Sonicate حل الأسهم من microspheres الفلورسنت لمدة 1 ساعة في حمام المياه بالموجات فوق الصوتية. جعل حل حبة العمل عن طريق تخفيف الأوراق المالية حبة 1:200 في الإيثانول 100٪ وsonicate مرة أخرى لمدة 1 ساعة.
    2. 15 دقيقة قبل الانتهاء من حل حبة sonicating، وتنظيف شامل الأغطية عن طريق وضعها عموديا في حامل غطاء السيراميك وعلاج مع البلازما غرفة الهواء لمدة 3 دقائق في منظف البلازما منضدية.
    3. لتسهيل التعامل مع ومنع انزلاق الغلاف خلال الخطوات اللاحقة، ضع قطعة من parafilm في غطاء طبق بيتري 60 مم أو حاوية مماثلة. ضع غطاء في المثبت والاستفادة بخفة إلى أسفل، وضمان اتصال جيد بين parafilm وغطاء.
    4. للحصول على غطاء 22 مم، أضف 150 درجة مئوية من محلول حبة العمل إلى الجزء العلوي من غطاء الغلاف. يستنشق على الفور محلول الإيثانول من جانب غطاء، وترك الخرز على غطاء. السماح للغطاء لairdry.
      ملاحظة:يجب أن تكون كمية الحل حبة العمل المضافة ~ 4 μL/cm2 ويمكن تحجيمها لاستيعاب أي غطاء حجم.
  4. صب هيدروجيلز مع الخرز الفلورسنت جزءا لا يتجزأ
    1. إعداد محلول هيدروجيل من الأكريلاميد وبيس أكريلاميد. خلط الحل وفقا للجدول 1، ثم إضافة 2.5 ميكرولتر من 10٪ APS و 0.5 ميكرولتر من TEMED. اخلطي جيداً. الانتقال فورا إلى الخطوة التالية.
      ملاحظة:يمكن تغيير خليط محلول هيدروجيل ليختلف معامل الشباب، أو تصلب، من هيدروجيل عن طريق تغيير نسبة الأكريلاميد إلى البيس-أكريلاميد كما هو مبين في الجدول 1. وقد تم التحقق من هذه القيم لاستخدامها في مختبر هاو باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية ولكن ينبغي تأكيدها داخل مؤسسة واحدة.
    2. مباشرة بعد صنع محلول هيدروجيل، إضافة قطرة 25 درجة مئوية إلى الجانب المنشط من طبق الزجاج القاع أو غطاء أسفل، ثم على الفور وضع غطاء المغلفة حبة على الحل، حبة الجانب إلى أسفل. الاتصال قطرة مع الجانب البعيد من غطاء تليها خفض بطيء يساعد على تجنب محاصرة فقاعات الهواء داخل هيدروجيل.
      ملاحظة:يجب أن يكون ارتفاع هيدروجيل جيدا ضمن مسافة العمل من العدسة الموضوعية لاستخدامها في التجربة في وقت لاحق. ارتفاع هيدروجيل من 66 درجة مئوية يعمل بشكل جيد لمعظم النظم. يمكن قياس حجم هيدروجيل عن طريق إضافة أكثر أو أقل محلول هيدروجيل اعتمادا على حجم غطاء. لحساب الحجم المناسب من محلول هيدروجيل، استخدم المعادلة لحجم الاسطوانة، V =2 ساعةحيث r هو نصف قطر غطاء وh هو ارتفاع هيدروجيل المطلوب. عادة، يتوقع هذا الحساب بدقة عادلة الارتفاع الفعلي للهيدروجيل، كما تقاس بإعداد هلام مع غطاء المغلفة حبة على كل من أعلى وأسفل واستخدام المجهر البؤري لقياس المسافة بين الطائرتين حبة. ومع ذلك، فقد لوحظ أن الارتفاع الفعلي للهيدروجيل يمكن أن ينحرف عن هذا الحساب بـ ± 20 ميكرومتر (علىسبيل المثال، اعتمادا على سمك والشركة المصنعة للغطاء الزجاجي العلوي). ينصح بالقياس المباشر لارتفاع الجل باستخدام الطريقة الموضحة أعلاه.
    3. السماح للجل للبلمرة لمدة 30 دقيقة، ثم إزالة غطاء أعلى بلطف مع ملقط. إضافة 50 m HEPES الحموضة 8.5 إلى الطبق يمكن أن تسهل إزالة. غسل لمدة 5 دقائق في 50 mM HEPES الحموضة 8.5 ثلاث مرات.
  5. تنشيط هيدروجيل وطلاء المصفوفة خارج الخلية
    1. تنشيط سطح هيدروجيل عن طريق احتضان في 0.4 m Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate) في 50 mM HEPES الرقم الهيدروجيني 8.5. تعرض على الفور إلى مصباح قوس الأشعة فوق البنفسجية في منطقة مغلقة.
      ملاحظة:حماية Sulfo-SANPAH من الضوء قبل التنشيط. للحصول على مصباح بقوة 400 واط، ضع الجل على بعد 10 سم من المصباح داخل صندوق الضوء وإضاءة لـ 100 واط. سيتغير حل Sulfo-SANPAH من اللون البرتقالي الساطع إلى البني الداكن.
    2. غسل لمدة 5 دقائق في 50 mM HEPES الحموضة 8.5 ثلاث مرات.
      ملاحظة:قد يتم تخزين المواد الهلامية المرطبة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
    3. احتضان هيدروجيل المنشط في 20 ميكروغرام / مل فيبرونيكتين في 50 MM HEPES درجة الحموضة 8.5 لمدة ساعة 1 عند 37 درجة مئوية.
    4. قم بإستقدال محلول الفيبرونكتين واغسل لمدة 5 دقائق في محلول ملحي مُسحّز بالفوسفات (PBS) ثلاث مرات. تعقيم هيدروجيل وغطاء الطبق لمدة 15 دقيقة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة مع انخفاض حجم PBS. يغسل مرة واحدة في PBS معقمة.
      ملاحظة:أنواع أخرى من البروتين ECM يمكن استخدامها لمعطف هيدروجيل بما في ذلك الكولاجين واللامينين.

2. خلايا الطلاء

  1. إضافة 3 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على 21،000 خلية لملء طبق 60 ملم لكثافة الخلية النهائية من ~ 1000 خلية / سم2. ضبط كثافة البذر حسب الحاجة لمنع الازدحام والسماح بحرية حركة الخلايا الفردية.
  2. السماح للخلايا بالتعافي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة على الأقل ولمدة تصل إلى 18 ساعة قبل التصوير. الاستعداد للتصوير عن طريق الغسل مع وسائل التصوير مرتين قبل إضافة وسائل التصوير. السماح للخلايا بمعادلة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير.
    ملاحظة:فحص ظروف الوسائط مسبقاً لتحديد الشروط التي من شأنها تحسين الترحيل في سطر الخلية المستخدمة. بالنسبة لخلايا SKOV-3، فإن DMEM بدون الفينول الأحمر، الذي يحتوي على HEPES بـ 20 مم وعامل نمو البشرة 12.5 نانوغرام/مل يحفز معظم الهجرة. الظروف المثلى لخلايا Ref52 هي العازلة رينجر مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 25 نانوغرام / مل عامل النمو المستمدة من الصفائح الدموية.

3. إعداد micropipette الزجاج: سحب ماصة وتزوير

  1. سحب 100 مم البورسليكات الزجاج 40 م micropipettes مع 1.0 مم الخارجي و 0.58 مم القطر الداخلي في عملية من خطوتين للحصول على تفتق أكثر من 2 ملم أن يقلل إلى ~ 50 ميكرومتر في المليمتر الأول ويمتد إلى أنبوب طويل، موازية قطرها 10 ميكرومتر في الملليمتر الماضي.
  2. تحميل سحب الأنابيب في microforge. شكل pipet أن يكون 15 μm تلميح حادة التي هي محاطة في نهاية جدا من قسم 250 ميكرومتر عازمة في زاوية ~ 35 درجة من بقية pipet. يجب أن يكون القطر التقريبي عند المنحنى حوالي 30 درجة مئوية لإضفاء القوة على الطرف.
    ملاحظة:يمكن تعديل أبعاد تفتق وتلميح لتطبيق القوة المطلوبة بشكل صحيح (انظر الخطوة 5). سحب micropipettes في 65 درجة مئوية للخطوة الأولى ل3 ملم، و 60 درجة مئوية للخطوة الثانية تنتج الأبعاد الموصوفة في الخطوة 3.1. قد تختلف النتائج باستخدام سحب pipet مختلفة.
  3. تعقيم micropipette في الإيثانول 70٪ قبل الاستخدام.

4. وضع المتلاعب الدقيق والميكرومابيت

  1. إزالة غطاء الطبق وتحميل الطبق على مرحلة المجهر ومركز. استخدم هدف تكبير منخفض 10 مرات أو مماثل منخفض. تغطية وسائل الإعلام مع الزيوت المعدنية لمنع تبخر وسائل الإعلام.
  2. إدراج الأنابيب المسحوبة
    1. إدراج pipet سحبت في غمد micropipette، مشيرا إلى هوك أسفل نحو الطبق. غيض من هوك سيكون أدنى نقطة عندما خفضت إلى هلام.
    2. أدخل غمد في micromanipulator وضبط حتى يتم توسيط طرف pipet على العدسة الموضوعية في كل من الاتجاهات X و Y.
    3. خفض pipet باستخدام المتلاعب الخشنة حتى يلامس فقط سطح السائل.
  3. باستخدام تباين المرحلة أو brightfield، ركز المجهر على طبقة الخرزة في الجزء العلوي من الجل. هذه ستكون الطائرة المرجعية
  4. ضمان أن الهدف ليس في خطر من ضرب العينة أو المرحلة، وجلب التركيز فوق هلام للعثور على غيض من micropipette، وذلك باستخدام تعديلات صغيرة من المتلاعب الخشنة في الاتجاهات X و Y لإلقاء الظلال على المستوى البؤري. فقط خفض micropipette عندما تأكد من أن غيض جدا من pipet هو في مجال الرؤية.
  5. تأكد من أن طرف حاد من micropipette يشير إلى أسفل عن طريق تدوير الأنابيب في غمد أو تدوير غمد في micromanipulator حتى غيض هو عمودي على المستوى البؤري. كرر الخطوتين 4.4 و 4.5 حسب الحاجة. التركيز على غيض من pipet.
  6. التركيز مرة أخرى وصولا الى الطبقة أعلى حبة من هلام لقياس مدى pipet هو من سطح هلام. التركيز مرة أخرى إلى الطائرة التي هي جزء من الطريق بين هلام وغيض من pipet. خفض ببطء pipet للوصول إلى مستوى التركيز المتوسط.
  7. كرر الخطوة 4.6 حتى يمكن تقدير الظلال خافت جدا من طرف micropipette عند التركيز على هيدروجيل. قم بالزيادة إلى أعلى تكبير التالي.
  8. خفض micromanipulator حتى الظلال والانكسارات من غيض جدا من micropipette يمكن أن يكون موضع تقدير داخل مستوى التركيز طبقة حبة.
  9. زيادة التكبير إلى تلك التي سيتم استخدامها في التجربة. خفض الأنابيب حتى تحوم فقط فوق سطح هيدروجيل.

5 - معايرة المتلاعب الدقيق وتوليد القوة

  1. في المرحلة أو برايتفيلد، وانخفاض micropipette تحوم للمس سطح هيدروجيل. لاحظ كيف تبدو الأنابيب عند ملامسة هيدروجيل. الاستمرار في خفض micropipette في Z حتى التعديلات في X و Y تسبب سحب وانحراف هيدروجيل في تلك الاتجاهات. استخدام الميكروسفيرات أو الخلايا القريبة كعلامات ائتمانية.
    ملاحظة:إذا تم إرفاق micromanipulator إلى مرحلة ذراع مكثف أو مقاعد البدلاء وليس مرحلة العينة نفسها، دائما فك الارتباط هلام قبل تحريك المرحلة لتجنب كسر pipet أو الخلايا المزعجة. إذا انكسر pipet، ارجع إلى الخطوة 3 والخطوة 4.
  2. العثور على منطقة خالية من الخلايا لإشراك هلام. سحبها في جميع الاتجاهات والحصول على راحة مع الطريقة micromanipulation يترجم إلى تشوه من هلام.
  3. التقاط صور الفلورسنت من حقل حبة مع عدم وجود تلاعب، مع pipet إشراك هلام، ومع pipet تشارك سحب هلام. كرر هذا عدة مرات أخذ ملاحظات جيدة فيما يتعلق علامات القراد على micromanipulator، والطريقة التي تبدو طرف pipet في مرحلة أو brightfield في كل مرحلة من مراحل السحب، والمسافة التي يتحرك طرف باستخدام هذا التلاعب.
  4. استخدام ImageJ كما هو موضح سابقا16،17 لحساب الإزاحة حبة النسبية والقوة المطبقة على الخرز عن طريق مقارنة حقل حبة فارغة إلى حقل حبة دون مشاركة pipet، وحقل حبة مع هلام تشارك، و سحبت هلام.
  5. لضبط التحفيز التوتري، قارن تطبيق القوة باستخدام أبعاد طرف micropipette المختلفة، أو المسافات من الخلية، أو المسافة التي يسحبها المتلاعب المجهري من نقطة الهبوط الأولية. تأثير البعد تلميح micropipette على تطبيق القوة يعطي مرونة كبيرة للمستخدم ولكن أيضا يدل على الحاجة إلى توليد خرائط القوة لmicropipettes جديدة، حتى عندما أبعاد وشكل تشبه إلى حد كبير نصائح معايرة سابقا.

6. إجراء فحص durotaxis

  1. قبل إجراء التجربة، ممارسة إشراك هلام بالقرب من خلية ومراقبة تشوه الخلية عندما يتم تغيير موضع micromanipulator.
  2. مراقبة مجموعة من الخلايا التي لديها قطبية واضحة ويبدو أنها تتحرك لمدة 30 دقيقة لتحديد الخلايا التي تتحرك بطريقة موجهة.
  3. اختر خلية تتحرك في اتجاه واحد واضح وراقبها بمعدل الإطار المطلوب لمدة 30 دقيقة إضافية.
  4. إذا كان من المرغوب فيه تحديد القوى التي تمارس على الخلية أو التوتر الذي تمارسه الخلية، والتقاط الصور الميدانية حبة في كل اكتساب. إذا كانت الخلية تغير مسار اتجاهها أثناء المراقبة، اختر خلية مختلفة لمراقبة لأن هذا سيجعل من الصعب تحديد تأثير التحفيز.
  5. إشراك هيدروجيل ما يقرب من 50 ميكرومتر بعيدا عن الخلية. وضع pipet أمام الجانب القريب من الحافة الرائدة وتحريك micromanipulator بحيث يتم تشويه هلام orthogonally إلى اتجاه الخلية من السفر. مراقبة الخلية مع مرور الوقت لأنها تستجيب للتدرج الحاد والمحلي من صلابة.
    ملاحظة:التوقيت المقدم هنا فعال عند مراقبة SKOV3 أو Ref52 الخلايا الليفية، ومع ذلك، ينبغي تعديل الفاصل الزمني والمسار الزمني العام لتتناسب مع نوع الخلية والحدث البيولوجي التي لوحظت. إذا كان الاقتران مع المجهرية الفلورية، وقفة اكتساب الفلورسنت مباشرة قبل الخطوة 6.5.، واستخدام التباين المرحلة أو brightfield لوضع micropipette وسحب، وإعادة تشغيل اكتساب الفلورسنت مباشرة بعد.
  6. إذا كان الإنزلاقات pipet أو إذا كان التدرج هو استرخاء أو تحريرها، ابحث عن خلية جديدة عن طريق تكرار الخطوتين 6.2 و 6.3.

7 - تحديد الاستجابة للهجرة الدوّافية

  1. باستخدام ImageJ19 أو برنامج آخر لتحليل الصور، قم بحساب زاوية الانعطاف عن طريق رسم خط بين منتصف الحافة الرائدة للخلية في الساعة 0 دقيقة و30 دقيقة من شاشة آخر (تعكس المسار الأصلي للخلية) وخط آخر بين منتصف الحافة الرائدة قبل و 80 دقيقة بعد التحفيز وقياس الزاوية بين هذين الخطين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

من خلال إعداد micropipettes (الشكل 1) وتطبيع توليد قوة السحب (الشكل2 والشكل 3) كما هو موضح أعلاه ، تم تحديد الظروف الجوروتيك الأمثل لخطوط الخلايا المتعددة. باستخدام هذه التقنية، كما هو مبين في الشكل4، كل من SKOV-3 خلايا سرطان المبيض

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يظهر هنا هو تكرار، فحص durotaxis خلية واحدة التي تسمح بتقييم قدرة الخلية على تغيير سلوكها الهجرة استجابة للإشارات الميكانيكية الحادة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية في تركيبة مع المجهرية الفلورية والبروتينات الانصهار المناسبة أو أجهزة الاستشعار الحيوية لفحص الإشارات دون الخلوية والأحداث ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

اي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylamide 40 % National DiagnosticEC-810
Ammonium Persulfate FisherBP179-25
BD20A High frequency generatorElectro Technic Products12011A115 V - Handheld Corona Wand
Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (Sigma AldrichM6514
Bis-acrylamide 2% National DiagnosticEC-820
Borosilicate glass capillariesWorld Precision Instruments1B100-4
Branson 2510 Ultrasonic CleanerBransonic40 kHz frequency
Coarse ManipulatorNarshigeMC35A
DMEMCorning10-013-CV
DMEM without phenol redSigma AldrichD5030
Dual-Stage Glass Micropipette PullerNarshigePC-10
Epidermal Growth FactorPeprotechAF-100-15
EthanolPharmco-aaper111000200
Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)GibcoA31606-02
Fibronectin EMD MilliporeFC010
Fluospheres Carboxylate 0.2 um InvitrogenF8810, F8807, F8811
Fugene 6Roche18150911.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish
Glacial Acetic AcidFisher ChemicalA38SI-212
Glass Bottom DishCellVisD60-60-1.5-N
Glass CoverslipElectron Microscopy Sciences72224-0122 mm, #1.5
HClJT Baker9535-03
Hellmanex III Special cleaning concentrateSigma AldrichZ805939Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips
HEPES powderSigma AldrichH3375Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5
Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood LightUviton InternationalUV0338
IsopropanolFisher ChemicalA417-4
MicroforgeNarshigeMF900
MicromanipulatorNarshigeMHW3
Mineral OilSigma AldrichM5904
Nanopure Life Science UV/UF SystemBarnsteadD11931ddH2O
Nikon Eclipse TiNikon
OptiMEMInvitrogen31985062
Parafilm MBemis Company, IncPM-992
PBS139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4
Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)Sigma AldrichP4056
Ref52Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS
Ringer's Buffer134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4
SKOV-3American Type Culture CollectionCulture in DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH Covachem 12414-1
Tabletop Plasma CleanerHarrick PlasmaPDC-32G
TEMED Sigma AldrichT9281-50

References

  1. Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
  2. Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  4. Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
  5. Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
  6. Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
  7. Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
  8. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  9. Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
  10. Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
  11. Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949(2015).
  12. Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
  13. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  14. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107(2012).
  15. Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. 3rd Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
  16. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
  17. McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228(2018).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  20. McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552(2011).
  21. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
  22. Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
  23. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150 durotaxis mechanotransduction

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved