تقنية آفة طفيفة التوغل للعضلات المتأصلة في Odontophore من كاليفورنيكا Aplysia

Summary

هنا نقدم بروتوكول للآفات الجراحية طفيفة التوغل من العضلات المتأصلة في جهاز تغذية الرخويات البحرية Aplysia كاليفورنيكا لفهم أدوار هذه العضلات أثناء سلوك التغذية.

Abstract

Aplysia californica هو نظام نموذجي لدراسة السيطرة العصبية للتعلم والسلوك. هذا الحيوان لديه نظام الدورة الدموية شبه مفتوحة، مما يجعل من الممكن الوصول إلى العديد من هياكلها الداخلية دون التسبب في أي ضرر كبير. يمكن إجراء العديد من التلاعبات بسهولة في كل من الجسم الحي وفي المختبر، مما يجعلها نموذجا ً قابلاً للجهاز للغاية لتحليل السلوك والدوائر العصبية. لفهم وظائف العضلات داخل ممسك التغذية بشكل أفضل، قمنا بتطوير تقنية لآفات لهم دون فتح تجويف الجسم الرئيسي للحيواني أو إتلاف الطبقات الخارجية من جهاز التغذية (أي كتلة الشدق). في هذه التقنية، يتم قطع الممسك جزئيا، مما يسمح بالوصول المباشر إلى العضلات. يسمح هذا الإجراء للالحيوانات بالتعافي بسرعة وموثوقية. وقد جعل هذا من الممكن لآفة العضلات I7 والألياف تحت الرادولار, مما يسمح لنا لإظهار أن كلا العضلات تسهم بشكل كبير في افتتاح في الجسم الحي.

Introduction

نظام التغذية من كاليفورنيكا Aplysia لديها تاريخ طويل من الاستخدام كنظام نموذجي لفهم التعلم والذاكرة¹، والسلوكيات دوافع^2،3، والتفاعل بين السلوك والميكانيكا الحيوية و السيطرة العصبية أثناء التغذية⁴. لديها الدوائر العصبية التي يمكن الوصول إليها للغاية، مع عدد صغير نسبيا من الخلايا العصبية الكبيرة، يمكن التعرف عليها. يحتوي الحيوان على نظام الدورة الدموية شبه المفتوح، مما يجعل من الممكن الوصول إلى العديد من هياكله الداخلية دون التسبب في أضرار كبيرة. كما أنها قوية لكثير من التلاعب على حد سواء في الجسم الحي وفي المختبر، مما يجعلها نموذجا للقدرة على المسالك العالية لتحليل السلوك والدوائر العصبية.

لفهم الأنماط العصبية التي تؤدي إلى سلوكيات التغذية، من المهم وصف الميكانيكا الكامنة في البنية الناعمة التي تشكل الجهاز التغذية، كتلة الشدق⁴. في حين كان هناك عمل تم القيام به لتوصيف العضلات الخارجية التي تشكل كتلة الشدق^5،6، والعضلات الداخلية للهيكل الأساسي داخل كتلة الشدك التي تسيطر على سطح الممسك ، وodontophore ، وقد تم لا يمكن الوصول إليها إلى حد كبير في التجريب في الجسم الحي. على الرغم من أن هناك دراسات في المختبر على وظائف بعض هذه العضلات^7،8، وعدم الوصول المباشر إلى هذه العضلات جعلت من الصعب دراسة دورها في الحيوانات سليمة ، وتتصرف.

معظم تقنيات زرع القطب الكهربائي أو الآفات في Aplysia أو الأنواع الرخويةالمماثلة تتطلب أن يتم فتح جدار الجسم 9،^10،11،12. يؤدي فتح جدار الجسم إلى إصابة ظهارية، ويجب إغلاق الشق بشكل آمن لمنع هروب الهيمولمفي. حتى يتم طرح صعوبات أكثر خطورة عند محاولة الوصول إلى العضلات الداخلية من قبض من Aplysia (العضلات الكامنة وراء سطح رادولار أو داخل odontophore): بعد أن دخلت من خلال تجويف الجسم الرئيسي، يجب على المرء ثم تذهب من خلال بعض جزء من الجدار العضلي من كتلة الشدق للوصول إلى الهياكل الداخلية (الشكل1A). هذه الإصابة المتراكمة وصعوبة الوصول جعلت النهج من خلال الوسائل التقليدية إشكالية لأن الحيوانات لا تتعافى بشكل جيد من هذه العمليات الجراحية (من الحيوانات مع النفور الكامل، فقط 17٪ استعادت أي قدرة التغذية، N = 12. حوالي 85٪ من الحيوانات غير المتبوّلة استعادت القدرة على الأعلاف، N = 84).

العضلات I7, التي تم وصفها بأنها فتاحة رادولار⁸, هو عميق داخل odontophore نفسها, زيادة تعقيد الوصول. وهو يمتد بين قاعدة ساق الرادولار (الشكل1C)والجانب السفلي من سطح الرادولار، من خلال التجويف في odontophore (الشكل1C). على ثلاثة جوانب من عضلات I7 هي جدران العضلات، والجدار الرابع يتكون من ساق الرادولار. ولأغراض دراسة ميكانيكية حيوية، فإن الإضعاف الكبير لأي من هذه الهياكل من شأنه أن يعرض للخطر الوظيفة العادية لجهاز التغذية. قمنا بتطوير نهج جديد للعمل odontophore من خلال الفكين، وإجراء الجراحة من خلال شق إلى رقيقة، سطح الرادولات الغضروفي، التي جعلت من الممكن لآفة العضلات I7، فضلا عن ألياف العضلات الجميلة الموصوفة حديثا أن تشغيل فقط تحت سطح الرادولار، والتي نشير إليها باسم الألياف الفرعية (الشكل1C).

الشكل 1: نظرة عامة تشريحية. (أ) موقع كتلة الشدق داخل Aplysia. (ب) التشريح الخارجي للأودونوفور. سطح الرادولا والكيس الرادولاصفر. وتظهر العضلات التي تتكون من odontophore باللون الأحمر، استنادا إلى ألوانها الفعلية. (C) قسم Sagittal من odontophore، تبين موقع الألياف تحت الرادولار (خط وردي منحني) وI7 العضلات (خط وردي مستقيم). يظهر المقطع العرضي من عضلة I6 باللون الأحمر الداكن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

اللافليسية هي اللافقاريات وبالتالي لا تخضع لموافقة IAUC. لتقليل عدم الراحة للالحيوانات، تأكد من أن يتم التخدير الكامل لهم قبل تطبيق التقنيات الجراحية الموضحة أدناه.

1. اختيار الحيوان والتخدير

1. حدد الحيوان النشط من خلال تقديمه الأعشاب البحرية والتأكد من أن فترات لدغة ليست أكبر من بين 3 و 5 ثانية.
2. التخدير الحيوان مع 0.333 كلوريد المغنيسيوم الأضراس (انظر الجدول 1) عن طريق الحقن بالقرب من الرأس مع إبرة 18 G على حقنة 60 مل بحيث أعلى تركيز التخدير سيكون حول كتلة الشدق.
   1. الحرص على اختراق كل من ظهارة الخارجي وطبقة الأنسجة الداخلية مع الإبرة. تأكد من أن الحقن هو تقريبا تحت وحيد القرن، في منتصف الطريق بين وحيد القرن والقدم، وينبغي أن تدخل الإبرة بشكل غير مباشر، مشيرا في اتجاه الفكين.
3. بعد 10 دقائق، حاول بلطف إدراج دبوس في الخيشوم ووحيد القرن، والتحقق من أن هذه لا تتراجع، لضمان التخدير كافية.
4. تأكد من أن الشفاه والفك من سبيكة استرخاء بحيث يمكن أن يتعرض odontophore.
   ملاحظة: يشير التجاعيد على شفاه الشكل 2A إلى أن شفاه الحيوان وفكه غير مسترخيين بما فيه الكفاية لإجراء العملية الجراحية دون ضرر. الشفاه على نحو سلس، واسترخاء من الشكل 2B تشير إلى أن الفكين هي استرخاء تماما.

الشكل 2: التوتر والاسترخاء في أفواه Aplysia التخدير. (أ) Aplysia تظهر درجة عالية من التوتر العضلي حول الشفاه. هذا يرتبط مع توتر الفك وموانع المضي قدما في الجراحة. (B) Aplysia مع الشفاه استرخاء، وتظهر داخل الفكين (رمادي فاتح). الألوان تتوافق مرة أخرى مع تلك التي لوحظت في الحيوان. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. إذا لم يتم استرخاء شفاه الحيوان، حقن 30 مل إضافية من كلوريد المغنيسيوم والانتظار 5 دقائق أخرى. إذا كان هذا لا يؤدي إلى استرخاء الشفاه، إعادتها إلى حاوية معزولة مع تدفق المياه جيدة للسماح لهم لاسترداد (انظر الخطوة 4) والمضي قدما مع حيواني مختلف.

2. تعريض سطح رادولار

1. وضع سبيكة بحيث يعلق الرأس إلى أسفل، مما يسمح للكتلة الشدق لتسوية ضد الفكين.
2. تطبيق الضغط مع الإبهام والسبابة لدفع كتلة الشدك نحو الفكين، وعقد كتلة الشدك في مكان.
3. تدوير الفكين بحيث تكون مرئية. في الوقت نفسه، والحفاظ على الضغط على كتلة الشدق بحيث يكون prow من كتلة الشدق مرئية من خلال الفكين. (الشكل3).

الشكل 3: دعم كتلة الشدق ضد داخل الفكين. الأصابع دعم كتلة الشدك التي تم دفعها حتى ضد الحافة الداخلية من الفكين حتى يمكن رؤية غيض من prow. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. العمل بلطف نصائح ملقط حادة في شق odontophore واستخدامها لرافعة السطح رادولار من خلال الفكين. إذا لم يتم استرخاء الفكين بما فيه الكفاية، استخدم الملقط لفهم حافة شق بلطف للمساعدة في هذه العملية.
   تحذير: هذا الضغط لا خطر ضرر أكبر للحيواني.
5. بمجرد أن يتعرض السطح، والعمل الفكين واضحة من الجزء الأمامي من السطح رادولار على طول الطريق حول محيط. وهذا يجعل odontophore أقل عرضةللتراجع (الشكل 4). تأكد من أن ما لا يزيد عن نصف جدران odontophore يتعرض.

الشكل 4: النفور الجزئي من Odontophore. يتم الكشف عن سطح الرادولار بشكل كامل، ولكن لم يتم الكشف عن جانبي odontophore، مما يجعل هذا فقط نفور جزئي. ومن المرجح أن يؤدي المزيد من النفور إلى إلحاق أضرار بالحيوان. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: سوف النفور الكامل من odontophore يسبب تلف العضلات الرئيسية التي الحيوانات بطيئة جدا لاسترداد.

3. الشقوق الجراحية

1. بمجرد أن يتعرض سطح الرادولار بشكل كامل، قم بترتيب الرصاصة تحت نطاق تشريح للجراحة.
   1. بدلا من ذلك، استخدم شريط مطاطي واسع ويد ثالثة لتثبيت الفكين وسطح الرادولار للجراحة، وخاصة أثناء التعلم. هذا, ومع ذلك, يضيف الوقت وزيادة تلف الأنسجة لهذا الإجراء, مما يجعلها أقل مثالية على المدى الطويل.
2. ضع السطح الرادولالي بحيث يواجه الجانب المشقوق المحقق.
3. فهم بلطف سطح الرادولا، بالقرب من قاعدة الرادولار، بحيث يتم تشكيل أضعاف أفقي عمودي على تجعد التشريحية. استخدام مقص غرامة لقطع من خلال هذا أضعاف، مما يجعلشق على طول تجعد التشريحية (الشكل 5).

الشكل 5: موقع الشق إلى سطح الرادولار. (أ) سطح رادولار، مع شق. (ب) سطح رادولار مع دوائر تبين حيث خيوط من العضلات I7 الثنائية نعلق؛ خطوط منقط تظهر موقع العضلات تنازلي تحت سطح رادولار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. قم بتوسيع هذا الشق الأولي إلى 3-5 سم للسماح بالوصول إلى الجزء الداخلي من كتلة الشدق.
5. ضبط الضوء بحيث يشير مباشرة مرة أخرى من خلال هذا الشق.
6. جزء حواف الشق بحيث الجزء الخلفي من تجويف odontophore وخيوط عمودية رقيقة من العضلات I7 مرئية. (الشكل6)

الشكل 6: موقع I7 من خلال شق سطح الرادولار. النظر من خلال شق، ويمكن رؤية كلا فروع I7 بين الأسطح الداخلية من I4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. الوصول إلى خلال شق، واستيعاب كل من فروع I7، وسحبها حتى من خلال شق، حيثبقدر ما يمكن قطع العضلات بعيدا كما هو عملي (الشكل 7).

الشكل 7: سحب حبلا العضلات I7 من خلال الشق. العضلات I7 مرنة للغاية ويمكن سحبها من خلال شق لإزالة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: مع الممارسة، وعادة ما يكون أكثر فعالية لتحديد موقع I7 من قبل يشعر من قبل البصر.

4. الرعاية بعد العملية الجراحية

1. بعد أن يتم تنفيذ الآفات، فهم مخالب الأمامي، ودفع إلى أسفل على سطح الرادولار لإعادة سبيكة إلى تكوينها الأصلي.
2. وضع الحيوانات بعد الجراحة في بيئة محمية مع تدفق المياه جيدة. زيادة الأوكسجين يسرع الانتعاش. تأكد من أن الحيوانات في حالة تأهب واستجابة في اليوم التالي للجراحة. وإذا لم يكن الأمر كذلك، يمكن افتراض أنهم لن يتعافوا.
   ملاحظة: عادة ما تبدأ الحيوانات في التغذية في اليوم الأول أو الثاني بعد الجراحة. حتى الحيوانات التي تواجه صعوبة في العض ينبغي أن تقدم الأعشاب البحرية، كما هو ملاحظتنا القصصية أن يتم تحسين انتعاش الحيوان من خلال محاولاته لتناول الطعام.

5. لآفة الألياف الفرعية

1. اتبع الخطوات من 1.1 إلى 3.5
2. أدخل طرف شفرة مشرط مستقيمة صغيرة (#11 أو ما شابه) من خلال الشق مع الحافة الحادة الزاوية إلى الأعلى. كشط بلطف الألياف العضلية الجميلة من الجانب السفلي من السطح رادولار. (الشكل8).

الشكل 8: آفات الألياف تحت الرادة. حافة شفرة مشرط هو زاوية صعودا من خلال شق إلى الجانب السفلي من سطح الرادولار بحيث يمكن كشط بلطف بعيدا الألياف تحت الرادولار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. العودة إلى الخطوة 4.1.

النتائج

وكان العمل السابق اقترح أن العضلات I7 ساهمت في افتتاح الممسك⁸. وقد أشارت دراساتنا التشريحية الخاصة إلى أن الألياف الفرعية قد تسهم أيضاً في فتح المنضدين. لاختبار هذه الفرضيات، تم حث الحيوانات لتوليد لدغات قبل وبعد تلقي إجراء جراحي. تعرضت الحيوانات الشام لجميع الخطوات الجراحية، بما في ذلك الشق في سطح الرادولار، ولكن لم تتم إزالة أي عضلات داخلية. الحيوانات التي تعرضت لآفة I7 قد تم إزالة كل من عضلات I7. الحيوانات التي تعرضت لآفة الألياف الفرعية كان ~ 25٪ من الألياف تحت الرادولار إزالتها مباشرة تحت الشق. لم يكن لآفات الشام أي تأثير كبير على عرض الفتحة في ذروة العض، في حين أن آفات الأليافاللاصدية I7 والألياف الفرعية لم تقلل بشكل كبير من عرض العضة (الشكل 9).

الشكل 9: نتائج الآفات على العرض الافتتاحي أثناء ذروة العض. البيانات المعروضة هي الاختلافات بين متوسط العرض افتتاح تطبيع من الرادولا قبل وبعد العملية الجراحية ل 5 الحيوانات في كل من 3 مجموعات (الشام، آفة I7، أو آفة SRF)، مع كل الحيوانات بمثابة السيطرة الخاصة بها. تم أخذ المتوسطات من 5 لدغات من قبل، و 5 لدغات بعد العملية الجراحية لتحديد متوسط الفرق الطبيعي. وكان عرض الافتتاح المسافة من مركز رادولا إلى الحافة الرادولاية في ذروة الطرح، تطبيع من قبل المسافة من السطح الداخلي للقاعدة رادولار إلى حواف الجانب المشقوق من سطح الرادولار. وتظهر الاختلافات كوسيلة زائد أو ناقص الانحراف المعياري. بعد التأكد من أن بيانات الفرق يتم توزيعها عادة، تم تحديد احتمال أن الآفة لم يكن لها تأثير (أي، تم اختبار فرضية فارغة أن آثار الإجراءات الجراحية ستكون صفرا، في المتوسط) عن طريق تطبيق الاقتران t-اختبار لكل مجموعة مستقلة. وتظهر البيانات أن الآفة الشامية لم يكن لها تأثير كبير، في حين أن آفة عضلات I7 أو آفة من الألياف الفرعية الرادولار كان لها تأثير كبير على فتح الرادولار (ص < 0.031 لمجموعة الآفات I7، المشار إليها مع نجمية واحدة ، أو p < 0.002 لمجموعة آفات SRF، المشار إليها بعلامة نجمية مزدوجة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وزن الجسم	جرعة كلوريد المغنيسيوم
<200 غرام	- وزن الجسم
200-350 غ	1/3 وزن الجسم
350-450 غ	1/4 وزن الجسم

الجدول 1: جرعة كلوريد المغنيسيوم عن طريق وزن الجسم.

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية داخل البروتوكول هي الحاجة إلى ضمان أن يتم التخدير تماما الحيوان، وأن النفور من كتلة الشدق يكفي فقط للوصول إلى العضلات الكامنة. قد يتطلب بعض الممارسة لإتقان هذه الخطوات، ولكن بمجرد إتقانها، من المرجح أن يكون العائد من العمليات الجراحية أكبر من 85٪ من جميع التجارب التي أجريت. الطريقة الأكثر أهمية لتعديل البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل صحيح هو قضاء بعض الوقت في القيام تشريح كتلة الشدق بحيث تكون مواقع العضلات الداخلية واضحة تماما للمحقق. نظرًا لأن الشق المقترح من خلال السطح الرادولالي يسبب حتماً بعض الضرر للألياف الفرعية الكامنة، فقد يكون من المناسب تعديل الموقع الدقيق للشق لتجنب مناطق محددة من هذه الألياف.

أحد قيود التقنية الجراحية هو أنه قد يكون لها آثار غير محددة على استجابات التغذية، مثل قوة الطرح. إحدى الطرق للتغلب على هذا القيد هي أن تكون الحيوانات بمثابة ضوابط خاصة بهم. وبالإضافة إلى ذلك، من الأهمية بمكان أن يكون لديك مجموعة آفة وهمية التي تخضع للبروتوكول الجراحي بأكمله باستثناء إزالة العضلات المحددة (أي I7 أو SRFs). باتباع هذه الاقتراحات، سوف المحقق الحد من آثار التباين بين الحيوانات ويكون لها قياس جوهري للآثار غير محددة من الجراحة.

وقد استخدمت العمل السابق النهج من خلال جدار الجسم للآفة أو تسجيل إما من الأعصاب^13،14، أو العضلات^15،16،17. في مختبرنا، لاحظنا الحكايات أن شقوق جدار الجسم غالبا ما تكون مصحوبة بفقدان كبير من الهيمولمف وبالتالي من حجم الجسم. الحيوانات غالبا ما تتطلب عدة أيام للتعافي من هذا، وإذا لم يتم خياطة آفة جدار الجسم بعناية، قد لا تتعافى الحيوانات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فحص الحيوانات بعد الوفاة يكشف عن ندبات كبيرة حول الشق واستجابة مناعية قوية (ملاحظات سردية). وعلى النقيض من ذلك، لا تظهر الحيوانات أي فقدان للهيمولمف أو تغيير في حجم الجسم بعد التعافي من البروتوكول الموصوف هنا (استنادا ً إلى ملاحظات في 96 الحيوانات).

التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية قد تمتد إلى عضلات أخرى داخل جهاز التغذية من Aplysia، وإلى الحيوانات الأخرى. لقد ركزنا على إزالة العضلات I7 والألياف الفرعية. هذه التقنيات الجراحية العامة نفسها تسمح أيضا الوصول إلى معظم العضلات الأخرى من odontophore. بعض هذه, مثل الجزء الداخلي من العضلات I5, يتم الوصول إليها أفضل من خلال سطح رادولار. البعض الآخر، مثل المنشورات الداخلية من I4، قد يكون من الأفضل الوصول إليها من خلال ظهارة الخارجي من odontophore. لقد قمنا بإجراء تجارب أولية حيث شق تحت شق رادولار من odontophore من everted جزئيا سمح الوصول إلى هوك شحذ لإدراجها التي يمكن بعد ذلك أن تستخدم لآفة عضلة أخرى داخل odontophore، العضلات I8⁸. لأن البروتوكول الجراحي الموضح هنا لا يفتح تجويف الجسم الرئيسي، لا يلزم خياطة.

وقد يكون البروتوكول الذي وصفناه ذا أهمية عامة للمحققين الآخرين الذين يعملون على هياكل الأنسجة الرخوة التي سيكون من الصعب التلاعب بها، على سبيل المثال، جهاز تغذية الرخويات الأخرى. وبشكل أعم، يمكن أن يقترح هذا البروتوكول نُهجاً جراحية جديدة أخرى لتحليل الهياكل اللينة مثل الألسنة أو الجذوع أو المخالب¹⁸.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt forceps	Fine Science Tools	11210-10	2 pair
Scalpel blade (#11)	Fine Science Tools	10011-00
Spring scissors	Fine Science Tools	15024-10
Webcam	Logitech	c920	for recording data