طريقة الكهربائي في الجسم الحيوي تسليم الحمض النووي بلازميد في Telencephalon حمار وحشي الكبار

Summary

المعروضة هنا هي طريقة الكهربائي لتسليم الحمض النووي بلازميد وتسمية الخلايا ependymoglial في telencephalon حمار وحشي الكبار. هذا البروتوكول هو وسيلة سريعة وفعالة لتصور وتتبع الخلايا الأيبندية الفردية ويفتح إمكانيات جديدة لتطبيق الكهربائي على مجموعة واسعة من التلاعبات الوراثية.

Abstract

الكهربائي هو طريقة التغوط التي يتم فيها تطبيق حقل كهربائي على الخلايا لخلق المسام المؤقتة في غشاء الخلية وزيادة نفاذية، مما يسمح لجزيئات مختلفة ليتم إدخالها إلى الخلية. في هذه الورقة، يتم استخدام الكهربائي لإدخال بلازميدات إلى الخلايا الاستئصالية، والتي خط المنطقة البطينية من الدماغ حمار وحشي الكبار. جزء من هذه الخلايا يظهر خصائص الخلايا الجذعية ويولد الخلايا العصبية الجديدة في الدماغ حمار وحشي. لذلك، دراسة سلوكهم أمر ضروري لتحديد أدوارهم في تكوين الأعصاب وتجديدها. إدخال بلازميدات عن طريق الكهربائي يتيح وضع العلامات على المدى الطويل وتتبع خلية واحدة ependymoglial. وعلاوة على ذلك، يمكن تسليم البلازميدات مثل Cre recombinase أو Cas9 إلى خلايا ependymoglial واحدة، والتي تمكن من إعادة تركيب الجينات أو تحرير الجينات ويوفر فرصة فريدة لتقييم وظيفة الجينات المستقلة للخلية في السيطرة عليها، الطبيعية البيئه. وأخيراً، يتم استخدام هذا البروتوكول الكهربائي المفصل خطوة بخطوة للحصول على إدخال ناجح للبلازميدات في عدد كبير من الخلايا الاستئصالية واحدة.

Introduction

حمار وحشي هي نماذج حيوانية ممتازة لفحص تجديد الدماغ بعد إصابة جرح طعنة. بالمقارنة مع الثدييات، على سلم التطور، والأنواع الأقل تطورا مثل حمار وحشي تظهر عموما معدلات أعلى من تكوين الأعصاب التأسيسية والمناطق الأوسع من سكن الخلايا الجذعية العصبية الكبار، مما يؤدي إلى توليد مستمر من الخلايا العصبية الجديدة في جميع أنحاء معظم مناطق الدماغ في حياة الكبار. ويبدو أن هذه الميزة ترتبط مع قدرة تجديدية أعلى بكثير من حمار وحشي بالمقارنة مع الثدييات¹، كما حمار وحشي لديها إمكانات ملحوظة لتوليد الخلايا العصبية الجديدة بكفاءة في معظم نماذج إصابات الدماغ درس^{2، 3,4,5,}6^,7,8. هنا، يتم دراسة telencephalon سمك الحمار الوحشي، لأنها منطقة الدماغ مع تكوين الأعصاب بارزة في مرحلة البلوغ. هذه المناطق من تكوين الأعصاب الكبار هي متجانسة للمناطق العصبية في الدماغ الثدييات الكبار^9،10،11.

المناطق العصبية وفيرة في telencephalon حمار وحشي موجودة بسبب وجود glia شعاعي مثل الخلايا أو خلايا ependymoglia. الخلايا الاستئصالية Ependymoglial بمثابة الخلايا الجذعية العصبية الكبار المقيمين ومسؤولة عن توليد الخلايا العصبية الجديدة في كل من الدماغ سليمة وتجديد^3،5. وقد أظهرت تجارب تتبع النسب أن ependymoglia البطينية تتفاعل مع الإصابة، ثم تنتشر وتوليد الخلايا العصبية الجديدة التي تهاجر إلى موقع الآفة⁵. بسبب الطبيعة المتتربدة من الدماغ حمار وحشي، الخلايا ependymoglial خط السطح البطيني وبناء الجدار البطيني البطيني. يتكون الجدار البطيني الحويصلي من طبقة الخلايا الأورسية(الشكل 1A). الأهم من ذلك، تجسد ependymoglia حمار وحشي خصائص كل من الثدييات الغليا شعاعي والخلايا ependymal. العمليات شعاعي طويلة هي سمة نموذجية من خلايا غليا شعاعي، في حين أن ملحقات الخلوية وتقاطعات ضيقة (فضلا عن مواقفها البطينية) هي ملامح نموذجية من الخلايا ependymal^12،13،14. لذلك، يشار إلى هذه الخلايا باسم الخلايا الإيبنموجلية.

لمتابعة في سلوك الجسم الحي من الخلايا ependymoglial واحدة أثناء التجدد، فإنها تحتاج إلى أن تكون وصفت بشكل موثوق. وقد سبق وصف أساليب مختلفة من وضع العلامات في الخلايا الحية للميكروسكوب الفلورسنت، مثل الصحفيين الذاتية أو الأصباغ lipophilic¹⁵. وقد تتطلب هذه الأساليب، على النقيض من الكهرباء، فترات زمنية أطول، وكثيراً ما لا تتيح إمكانية وضع علامات على خلية واحدة أو تتبع دائم طويل الأجل. الكهربة، ومع ذلك (إلى جانب وضع العلامات خلية واحدة)، ويوفر إمكانية إدخال الحمض النووي الجديد في الخلية المضيفة. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع غيرها من أساليب نقل الحمض النووي في الخلايا، وقد ثبت الكهربائي لتكون واحدة من أكثر الطرق كفاءة^{16،17،18،19}.

يعرض هنا بروتوكول الكهربائي الذي تم صقله لغرض وضع العلامات على الخلايا ependymoglial واحدة في telencephalon حمار وحشي الكبار. يسمح هذا البروتوكول بوضع العلامات على الخلايا الأيبنموغلية واحدة من أجل متابعتها على مدى فترة طويلة الأجل²⁰ أو للتعامل مع مسارات محددة بطريقة الخلية المستقلة^21،22.

Protocol

تم الاحتفاظ بجميع الحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول في ظل ظروف تربية موحدة، وأجريت التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح من اولة الاتحاد الأوروبي وحكومة بافاريا العليا (AZ 55.2-1-54-2532-0916).

1. إعداد خليط البلازميد للكهرباء

1. تمييع بلازميد الاهتمام بالماء المعقم وإضافة حل سريع للمرقة الخضراء وصمة عار [1 ملغ /مل]. تأكد من أن التركيز النهائي للبلازميد هو 1 ميكروغرام/لتر.
2. بمجرد إعداده، قم بخلط محلول البلازميد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات أو عن طريق التنصت على الأصابع. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى الاستخدام.
   ملاحظة: للكهرباء المشتركة لاثنين من البلازميدات في نفس الخلية، تأكد من أن تركيز كل بلازميد الفردية المستخدمة في الخليط هو على الأقل 0.8 نانوغرام / ميكرولتر مع نسبة الأضراس من 1:1 للحصول على كفاءة الكهرباء المشتركة 80٪-90٪.

2. الاستعدادات لإجراء الحقن والكهرباء

1. إعداد الشعيرات الدموية الزجاجية (القطر الخارجي 1 ملم، القطر الداخلي 0.58 مم) اللازمة للحقن في جهاز سحب إبرة.
2. من أجل حقن الكمية الصحيحة من بلازميد (انظر أعلاه)، وسحب الشعرية في درجة حرارة 68.5 درجة مئوية مع اثنين من الضوء واثنين من الأوزان الثقيلة (انظر جدول المواد لمواصفات الساحبة).
   ملاحظة: في حالة استخدام سحب مختلفة، معايرة الشعرية لتقديم الحجم المناسب من مزيج الكهربائي.
3. تعيين جهاز الحقن يدويا إلى ضغط حقن من 200 هبأ (عن طريق تحويل مقبض بي) والضغط المستمر من 0 هبأ. تعيين وقت الحقن يدويا لوضع يدوي والسيطرة على الضغط مع دواسة القدم.
4. قم بتعيين جهاز الكهرباء إلى "وضع LV" مع خمسة نبضات في 54-57 فولت (25 مللي ثانية لكل منها فواصل زمنية 1 ثانية). قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بالجهاز.
5. إعداد خزان سمك واحد مع مياه السمك النظيفة، حيث سيتم إيقاظ الأسماك من التخدير بعد إجراء الكهربائي. تُنير المياه عن طريق إبقاء حجر الهواء الملحق بمضخة الهواء طوال فترة التعافي حتى تستيقظ الأسماك بالكامل.
6. خذ اسفنجة المطبخ العادية وجعل قطع طولية في الاسفنجة لعقد الأسماك في أثناء عملية الحقن والكهرباء (انظر المنشور السابق³).
   ملاحظة: وينبغي غسل اسفنجة المطبخ بانتظام أو تبادلها من أجل إزالة المواد الكيميائية السامة المحتملة.
7. وضع كمية صغيرة من الموجات فوق الصوتية متعددة الأغراض موصل للغاية هلام بجوار الإعداد حقن والكهربائي.
   ملاحظة: وهذا يضمن الموصلية الكهربائية الكافية، وبالتالي، توزيع الخلايا الكهربائية في جميع أنحاء telencephalon كامل.

3. تخدير سمك الحمار الوحشي

1. قبل التخدير، وإعداد محلول مخزون التخدير مع 0.2٪ MS222 في الماء المقطر وضبط درجة الحموضة إلى 7 مع تريز-حمض الهيدروكلوريك العازلة. تخفيف هذا المخزون 1:10 (أي إلى 0.02٪ MS222) باستخدام مياه السمك.
2. التخدير الأسماك عن طريق الاحتفاظ بها في هذا الحل العمل حتى تتراجع حركة الجسم والخياشيم (عادة لبضع دقائق).

4. حقن محلول بلازميد

1. ملء الشعرية الزجاج المعدة مع 10 ميكرولتر من محلول بلازميد باستخدام نصائح microloader. تجنب تشكيل فقاعات الهواء داخل الشعرية.
2. اضغط على القائمة / تغيير الشعرية على جهاز الحقن. إدراج وتأمين الإبرة في حامل الإبرة.
3. تحت مجهر مجسم مع التكبير من 3.2x أو 4X، وقطع فقط غيض من الشعرية باستخدام ملقط نهاية غرامة. تبديل جهاز الحقن من تغيير وضع الشعرية في وضع الحقن، ثم تطبيق الضغط مع دواسة القدم للتأكد من أن الحل بلازميد يعمل بسهولة من الإبرة ودون عائق.
4. نقل الأسماك من خزان تربية إلى الحاوية (مربع من البلاستيك) مع محلول التخدير. انتظر لبضع دقائق حتى تهدأ حركة الخياشيم.
5. ضع السمك في الاسفنجة المبللة مسبقاً مع الجانب الظهري الذي يواجه. تنفيذ جميع خطوات الحقن التالية تحت المجهر المجسم لضمان دقة الإجراء.
6. باستخدام تشريح سكين صغير من الفولاذ المقاوم للصدأ مع 40 ملم حافة القطع وسمك 0.5 ملم، وخلق ثقب صغير في جمجمة الأسماك في الجانب الخلفي من telencephalon(الشكل 1B)،بجوار الحدود مع tectum البصرية.
   ملاحظة: وينبغي تنفيذ هذه الخطوة بعناية منذ ثقب ينبغي أن تكون صغيرة جدا وسطحية، واختراق الجمجمة فقط، لتجنب تلف الدماغ.
7. إمالة الأسماك حسب الضرورة وتوجيه غيض من الشعرية الزجاجية نحو الجمجمة في الزاوية الصحيحة لتسهيل اختراق طرف الشعرية من خلال الحفرة.
8. أدخل طرف الشعرية من خلال الثقب في الجمجمة بعناية حتى تصل إلى البطين الذيلاي (انظر الشكل 1B). وهذا يتطلب اختراق من خلال طبقة الخلايا الأوردية ependymal. يجب الحرص بشكل خاص على عدم إدراج الشعرية بعمق شديد لتجنب الاتصال مع أنسجة الدماغ. الحفاظ على الشعرية على وجه التحديد بين نصفي الكرة الأرضية، والبقاء داخل البطين فقط بعد ثقب طبقة ependymal الظهرية.
   ملاحظة: وهذه خطوة حساسة جدا. يتم تحسين دقة هذا الإجراء باستخدام خطوط متحولة تصبغ مثل النحاسية^24،مما يسمح أفضل التصور من موقف الشعرية الزجاج أثناء الحقن.
9. مع طرف الشعرية داخل البطين، حقن الحل بلازميد عن طريق تطبيق الضغط مع دواسة القدم لحوالي 10 ثانية، والذي يتوافق مع ما يقرب من 1 ميكرولتر من محلول بلازميد.
   ملاحظة: إذا كان تغيير سحب إبرة، الشعيرات الدموية أو حاقن، ينبغي معايرة النظام من أجل تقديم دائما 1 ميكرولتر من محلول بلازميد. ويمكن إجراء المعايرة عن طريق قياس قطر قطرات البلازميد التي تُطرد إلى زيت معدني (مثل زيت البارافين) ثم حساب حجم القطرة. بعد 10 ثانية من الحقن، يجب أن يكون هناك ~ 1 ميكرولتر من سائل بلازميد طرد إلى الزيت المعدني.
10. تأكيد نجاح الخطوة السابقة من خلال مراقبة انتشار السائل في جميع أنحاء البطين.

5. الكهربائي

1. إزالة الأسماك من حقن الإعداد في حين لا يزال عقد في الاسفنجة.
2. تزج الجانب الداخلي من طرف الأقطاب الكهربائية في هلام الموجات فوق الصوتية.
3. تغطية telencephalon الأسماك مع كمية صغيرة من هلام الموجات فوق الصوتية.
4. وضع رأس السمك بين الأقطاب الكهربائية، ووضع القطب الإيجابي في الجانب البطني من رأس السمكة والقطب السلبي على الجانب الظهري(الشكل 1C)،في حين لا يزال عقد جسم السمكة في الاسفنجة. هذا يحدد اتجاه تدفق الحالية اللازمة لependymoglia الكهربائي المتمركزة في منطقة تحت البطين.
5. اضغط على الأقطاب الكهربائية بلطف وعلى وجه التحديد ضد telencephalon(الشكل 1C). إدارة التيار مع دواسة القدم. عقد الأقطاب الكهربائية في مكان حتى يتم الانتهاء من جميع البقول الخمسة.

6. استعادة الأسماك

1. دع السمك يتعافى في الخزان الذي تم إعداده من قبل، ومنهك باستمرار حتى يستيقظ. يمكن تطبيق هلام ليدوكائين على الجمجمة من أجل تخفيف أي ألم ربما وضعت.

النتائج

طريقة الكهربائي الموصوفة يسمح تسليم الحمض النووي بلازميد في الخلايا ependymoglial، والتي تقع بشكل سطحي في telencephalon حمار وحشي وتحت طبقة الخلايا الأوردية ependymal(الشكل 1A).

إذا كانت نتيجة الكهربائي إيجابية، وصفت الخلايا ependymoglial واحدة...

Discussion

هذا البروتوكول الكهربائي هو موثوق بها في طريقة الجسم الحي من وضع العلامات على الخلايا الأيبنموجلية الفردية. قد يحتاج البروتوكول إلى مزيد من التكيف لتسمية أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا العصبية أو oligodendrocytes. ولتحقيق وضع العلامات الناجحة، يمكن استخدام البلازميدات التي تحتوي على مروّجين ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258-25G	For coloring plasmid solution
MS222	Sigma-Aldrich	A5040-25G	MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel	SignaGel, Parker laboratories INC.	15-60	Electrode Gel
Equipment
Air pump	TetraTec APS 50, 10l-60l		Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486	1 mm diameter
Electroporation device	BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus	45-0662
Injection device	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary	Warner Instruments	64-0766	Model No: G100-4
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micro-knife	Fine Science Tools	10056-12
Joystick micromanipulator	Narishige Japan	MN - 151
Needle holder	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013	Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device	Narishige Japan	Model No: PC-10	The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes	Greiner Bio-One International	633161