JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الضامة ، وخاصه الضامة الاوليه ، هي تحديا لtransfect لأنها تتخصص في الكشف عن جزيئات من أصل غير الذات. ونحن نقدم وصفا للبروتوكول الذي يسمح بالنقل عاليه الكفاءة من الضامة الاوليه مع mRNA المتولدة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات.

Abstract

الضامة هي خلايا الخلية المتخصصة في الكشف عن جزيئات من أصل غير الذات. ولهذه الغاية ، فهي مجهزه بمجموعه كبيره من مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs). لسوء الحظ ، وهذا أيضا يجعل الضامة تحديا خاصا لtransfect كما الكاشف ترانسفيكشن والأحماض النووية المحولة غالبا ما يتم التعرف عليها من قبل PRRs كما غير الذاتي. ولذلك ، غالبا ما يؤدي التحويل في الضامة التنشيط وتدهور الأحماض النووية المقسمة أو حتى في الانتحار من الضامة. هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي يسمح النقل عاليه الكفاءة من الضامة murine الابتدائية مثل الضامة البريتوني (PM) والضامة نخاع العظم المشتقة (BMDM) مع mRNA في المختبر المنقولة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات. مع هذا البروتوكول البسيط ، يتم تحقيق معدلات التحويل من حوالي 50-65 ٪ لل PM وحوالي 85 ٪ لشركه BMDM دون السمية الخلوية أو والاستمناع لاحظ. ونحن نوضح بالتفصيل جيل mRNA للتحويل من ثوابت الحمض النووي مثل البلازميدات واجراء التحويل.

Introduction

الضامة هي الخلايا البالعة التي تتخصص في الكشف ، وتناول والميكروبات المهينة ، والخلايا ابوتوتيك والحطام الخلوي. وعلاوة علي ذلك ، فانها تساعد علي تنسق الاستجابات المناعية عن طريق إفراز السايتوكينات والكيميائية وعن طريق تقديم المستضدات إلى خلايا T و B الخلايا. الضامة تلعب أيضا أدوارا هامه في العديد من العمليات الأخرى, مثل التئام الجروح, تصلب الشرايين, التورم والسمنة.

لتكون قادره علي الكشف عن جزيئات غير الذاتي مثل الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs) والجزيئات خارج المكان مثل الأنماط الجزيئية المرتبطة الضرر (DAMPs) ، وقد تم تجهيز الضامة مع مجموعه كبيره من مستقبلات التعرف علي النمط (PRR)1. لسوء الحظ, هذا أيضا يجعل الضامة تحديا خاصا ل transfect2 كما الكاشف ترانسفيكشن3 والأحماض النووية المتحولة4,5,6,7 غالبا ما يتم التعرف عليها من قبل prrs كما غير الذاتي. لهذا السبب ، نقل الضامة باستخدام الأساليب الكيميائية أو الفيزيائية8 عاده ما يؤدي إلى تنشيط الضامة وتدهور الأحماض النووية المقسمة أو حتى في الانتحار الضام عن طريق الحمم البركانية ، وهو شكل من اشكال الموت المبرمجة الخلية التيتسببت بعد الاعتراف بالأمبير الخلوي النقل البيولوجي للبلاعم باستخدام الفيروسات مثل الفيروسات اللحمية أو لينتيفيروسيس كمتجات غالبا ما يكون أكثر كفاءه ، ولكن بناء هذه النواقل الفيروسيةيستغرق وقتا طويلا ويتطلب السلامة البيولوجية مستوي 2المعدات 10 ،11.

وهكذا ، علي الرغم من ان الضامة هي موضوع البحوث المكثفة ، ويعوق تحليل وظائفها علي المستوي الجزيئي لان واحده من أهم الاداات من البيولوجيا الجزيئية ، والتحول من الحمض النووي يبني للتعبير الخارجية لل البروتينات ، لا ينطبق بالبالكاد. وهذا غالبا ما يجبر الباحثين علي استخدام الضامة مثل خطوط الخلايا بدلا من الضامة حسن النية. وتشمل تطبيقات الحقن بالأحماض النووية التعبير عن الصيغ البروتينية المتحولة أو الموسومة ، والتعبير المفرط عن بروتين معين ، وأعاده التعبير عن البروتين في خلفيه الضربة القاضية والتعبير عن البروتينات من الأنواع الأخرى (مثل , [كري] للالطبيعيه أو مرشده [رنا] و كاس 9 ل يستهدف مورثه ضربه قاضيه).

هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي يسمح الانتقال كفاءه عاليه من (عاده من الصعب ترنسفكايشن) الضامة الاوليه ، وهذا هو murine الضامة البريتوني (PM) والضامة نخاع العظم المشتقة (bmdm) مع mrna المتولدة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات. الأهم من ذلك ، في المختبر كتبت mrna التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول يحتوي علي النيونوسيدس المعدلة التي تحدث بشكل طبيعي 5-ميثيل-CTP والزائفة UTP التي تقلل من والاستمناع وتعزيز الاستقرار4،6،7،12،13. فضلا عن ذلك, ال 5 '-نهايات من ال في مختبره [مرنا] [دفوسفورلتد] بالفوسفاتيز قطبيه ان يمنع اعتراف ب ال [تلاعب-ي] مركبه14,15. هذا يقلل من الاعتراف المناعي الفطري لل في المختبر كتبت mRNA. مع شركائنا سهله لتنفيذ البروتوكول ، ومعدلات التحويل بين 50-65 ٪ (الضامة البريتوني (PM)) و 85 ٪ (BMDM) ويتم التوصل إلى حين ، الأهم من ذلك ، لا يوجد اي السمية الخلوية أو والاستمناع لاحظ. ونحن نوضح بالتفصيل ' 1 ' كيف يمكن ان تتولد من الحمض النووي الذي يسكت من الناحية المناعية لنقل العدوى من ثوابت الدنا مثل البلازميدات و (2) اجراء التحويل نفسه.

Protocol

تم تنفيذ عزل الضامة من الفئران وفقا لقانون حماية الماشية في ألمانيا وفقا للجنة الأخلاق في جامعه كولونيا.

ملاحظه: تنفيذ جميع الخطوات ارتداء القفازات. تنفيذ جميع الخطوات ترانسكشن تحت غطاء للتدفق الرقائقي لمنع تلوث الخلايا. قبل العمل مع mRNA ، تنظيف جميع الصكوك مثل الماصات وكل سطح مع 70 ٪ الايثانول و/أو السطحي RNAse المهينة (جدول المواد). تاكد من ان جميع أنابيب رد الفعل هي RNAse خاليه ومعقمه. استخدام المياه المعقمة فقط ، RNAase خاليه من أجل المخففات. استخدم بشكل حصري نصائح الماصة مع الفلاتر. تغيير نصائح الماصة بعد كل خطوه لضبط الماصات.

1. جيل من قالب الحمض النووي

ملاحظه: قالب الحمض النووي لل في المختبر النسخ mRNA باستخدام هذا البروتوكول يجب ان تحتوي علي تسلسل T7 بروموتور للسماح التحام من البوليميريز RNA. إذا كان البلازما التي تحتوي علي تسلسل الحمض النووي للبروتين من الفائدة بالفعل يحتوي علي تسلسل T7 بروموتور الموجهة بشكل صحيح مباشره المنبع من تسلسل الفائدة ، والعتب من البلازميد (انظر الخطوة 1.1.) يحتاج إلى ان يؤديها. والا ، ارفق T7 بروموتور إلى تسلسل الفائدة بواسطة تفاعل البلمره المتسلسل (PCR ، انظر الخطوة 1.2.).

  1. الT7 التي تحتوي علي البلازميدات المضادة للبروموتور
    1. Linearize البلازميدات بالفعل تحتوي علي تسلسل الموجهة بشكل صحيح T7 بروموتور عن طريق الهضم مع تقييد انزيم قطع المصب من توقف كودون من تسلسل الفائدة. والا ، فان النسخ لن تنتهي بشكل صحيح بعد تسلسل الفائدة.
      ملاحظه: فمن الأفضل لاستخدام الانزيمات تقييد ترك نهايات حاده أو 5 ' يتدلى.
    2. تاكيد العملية الكاملة لل البلازميد بواسطة الكهربائي هلام اجنشا من الحمض النووي الهضم ضد البلازما المهضومة.
    3. تنقيه الحمض النووي البلازميد البلازما قبل استخدامها كقالب الحمض النووي لفي المختبر mrna النسخ باستخدام مجموعه تنقيه الحمض النووي (جدول المواد).
  2. المرفق من T7 بروموتور بواسطة PCR
    1. استخدام التمهيدي إلى الامام الذي يحتوي علي المكونات التالية (في الترتيب المشار اليه من 5 ' إلى 3 '): حوالي 5 bp عشوائية المنبع من بروموتور (علي سبيل المثال ، GAAAT) ؛ التسلسل T7 بروموتور (تاتاكجاكتكاكتاتاج); اثنين اضافيه Gs لزيادة كفاءه النسخ (GG); الجزء المستهدف الخاص بالتسلسل الذي هو متماثل للتسلسل البلازميد المحيطة codon البداية.
      ملاحظه: وينبغي ان تتالف من: 3-6 bp المنبع من تسلسل kozak وبدء كودون, تسلسل kozak وبدء كودون (عاده gccacc atg g), 12-18 bp المصب من البداية كودون. إذا كان تسلسل الفائدة لا يحتوي بالفعل علي تسلسل KOZAK أو بدء codon ، ويمكن إرفاق هذه في هذه الخطوة ببساطه بما في ذلك لهم في تسلسل التمهيدي.
    2. حساب tm من التمهيدي إلى الامام فقط من خلال الأخذ في الاعتبار الجزء المتماثلة إلى تسلسل الهدف.
    3. لتقييم الدمامل/تشكيل دبوس الشعر استخدام تسلسل التمهيدي كله ، والتي يمكن ان تتجاوز بسهوله 50 bp.
    4. استخدام التمهيدي العكسي الموجود في مكان ما في المصب من توقف codon.
      ملاحظه: إذا كان تسلسل الفائدة لا يحتوي بالفعل علي توقف codon ، فانه يمكن إرفاقها في هذه الخطوة ببساطه بما في ذلك في تسلسل التمهيدي.
    5. استخدام الإشعال إلى الامام والعكس لتنفيذ PCR باستخدام البوليميرات عاليه الدقة مع التدقيق اللغوي (جدول المواد).
    6. تاكيد الجيل من منتج واحد وحجم الاتساع بواسطة الكهربائي هلام اجنشا (علي سبيل المثال ، استخدام 1 ٪ هلام اجنشا والتيار المستمر V 100).
    7. تنقيه المنتج PCR قبل استخدامها كقالب الحمض النووي لل في المختبر mRNA النسخ باستخدام مجموعه تنقيه الحمض النووي.

2. جيلنا

  1. تذويب جميع مكونات مجموعه النسخ في المختبر mRNA (انظر جدول المواد). دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g. يحفظ علي الثلج حتى الاستخدام.
  2. اعداد مزيج التفاعل لفي المختبر mRNA النسخ في أنبوب الطرد المركزي 0.5 mL في الترتيب التالي (الحجم الإجمالي لل 40 μL): 20 μL من 10x اركا/NTP مزيج (المدرجة في المختبر في عده النسخ mRNA) ؛ 0.25 ميكرولتر من 5-ميثيل-CTP (التركيز النهائي (نادي) هو 1.25 mM ؛ 50 ٪ من إجمالي CTP) ؛ 0.25 μL من الزائفة UTP (نادي هو 1.25 mM ؛ 50 ٪ من مجموع UTP) ؛ X μL من قالب الحمض النووي; 2 μL من T7 الحمض الريبي النيبالي البلمره مزيج (المدرجة في المختبر في عده النسخ mRNA) ؛ Y μL من RNAse خاليه H2O.
    ملاحظه: X هي وحده تخزين تحتوي علي 1 ميكروغرام علي الأقل من الحمض النووي. علي سبيل المثال ، 1.6 μL من 625 ng/μL الأسهم الحل. Y هو حجم الغيار إلى الحجم الإجمالي 40 μL.
  3. دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه في 400 دوره في الدقيقة علي خلاط حراري للنسخ في المختبر.
  4. ثم ، أضافه 2 μL من DNase انا مباشره في مزيج التفاعل لأزاله الحمض النووي القالب. دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g.
  5. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 15 دقيقه في 400 دوره في الدقيقة علي خلاط حراري. اتخاذ قسامه من 2 μl لهلام التحكم (الخطوة 3.3) وتخزين في-80 درجه مئوية.
  6. لبولي (A) المخلفات ، أضافه المكونات التالية مباشره في مزيج رد فعل السابقة (إلى حجم النهائي من 50 μL): 5 μL من بولي (A) العازلة تفاعل البلمره و 5 μL من بولي (A) البوليميريز (سواء المدرجة في المختبر في عده النسخ mRNA). دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g.
  7. احتضان المزيج في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه في 400 دوره في الدقيقة علي ثيرموميكسير. اتخاذ قسامه من 2 μl لهلام التحكم (الخطوة 3.3) وتخزين في-80 درجه مئوية.
  8. لأزاله الفوسفات من 5-نهايات من mRNA ، أضافه المكونات التالية مباشره في مزيج رد الفعل السابق (إلى حجم النهائي من 60 μL): 3 μL من RNAse خاليه H2O ؛ 6 μL من 10x القطب الجنوبي الفوسفاتيز رد فعل العازلة; 3 μL من الفوسفاتيز القطب الجنوبي (15 وحده ل 60 حجم التفاعل μL). دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g.
  9. احتضان المزيج في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه في 400 دوره في الدقيقة علي خلاط حراري.
  10. الحرارة-inactivate الفوسفاتيز القطب الجنوبي من قبل الحضانة في 80 درجه مئوية لمده 2 دقيقه.
    ملاحظه: من الناحية المثالية ، استخدم خلاط حراري منفصل ، لا تنتظر حتى يصل الخلاط الأول إلى درجه الحرارة المطلوبة.

3. mRNA تنقيه

  1. تنقيه في المختبر كتبت mRNA باستخدام مجموعه مخصصه لتنقيه الحمض الريبي النيبالي (جدول المواد).
    1. أضافه X μL من حل التملص إلى مزيج رد فعل mRNA من الخطوة 2.10. مزيج من خلال عكس 5 مرات. أضافه 300 μL من التركيز حل الربط. اخلطه بواسطة الماصات اللطيفة 5 مرات.
      ملاحظه: X هو حجم الغيار إلى حجم إجمالي 100 μL. علي سبيل المثال ، أضافه 40 μl الحل الشطف إلى 60 مزيج رد فعل mrna.
    2. أضافه 100 μL من الايثانول خاليه من RNAase. اخلطه بواسطة الماصات اللطيفة 5 مرات.
    3. ضع عمود عامل تصفيه في أحد أنابيب التجميع التي تم توفيرها. انقل مزيج تفاعل mRNA برفق إلى مركز الفلتر دون لمس الفلتر. أجهزه الطرد المركزي في 15,000 x g ل 1 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT).
    4. ارفع عمود الفلتر بعناية وتخلص من التدفق في أنبوب التجميع. ضع عمود الفلتر مره أخرى في نفس أنبوب التجميع.
    5. أضافه 500 μL من محلول الغسيل (لا ننسي لأضافه 20 مل من الايثانول خاليه من RNAase قبل استخدام محلول الغسيل للمرة الاولي).
    6. جهاز الطرد المركزي في 15,000 x g لمده دقيقه واحده في RT. كرر الخطوات 3-1-4-3.1.6 لغسل مره أخرى.
    7. الطرد المركزي باقصي سرعه (17,900 x g) لمده دقيقه واحده في RT لأزاله اي السوائل المتبقية من عمود الفلتر. خذ بعناية عمود الفلتر من أنبوب التجميع. ضع عمود الفلتر في أنبوب تجميع جديد.
    8. أضافه 50 μl من المخزن المؤقت الشطف إلى مركز التصفية دون لمس عامل التصفية. احتضان في 65 درجه مئوية لمده 10 دقيقه علي خلاط حراري.
    9. الطرد المركزي في 15,000 x ز لمده دقيقه واحده في RT. قم بازاله عمود عامل التصفية وتجاهله.
  2. قياس تركيز ونقاء mRNA التي لا يمكن التملص منها ، علي سبيل المثال ، باستخدام مقياس الطيف الطيفي لقياس الامتصاص في 260 و 280 نانومتر.
    ملاحظه: A260/A280 نسبه 1.8-2.1 يدل علي mRNA عاليه النقاء.
  3. التحقق من وجود منتج واحد ، وتصحيح طول النص وبولي (ا) المخلفات عن طريق تحليل قسامات من الخطوات 2.5 و 2.7 بواسطة اجبرز هلام الكهربائي تحت ظروف التعتيم (علي سبيل المثال ، استخدام 1.2 الهلام الذي يحتوي علي 20 مم التي تحتوي علي 10 ملم 3-(ن-مورتولينو) حمض بروبانيسولفونيك [MOPS] ، خلات الصوديوم 5 ملم ، 1 مم أدتا و 20 ٪ الفورمالديهايد وتشغيل في 20 مم MOPS ، 5 مم خلات الصوديوم ، 1 مم أدتا و 0.74 ٪ الفورمالديهايد في 100 V ثابت الحالي).
  4. تخزين mRNA تنقيه في أنبوب الشطف في-80 درجه مئوية حتى الانتقال. إذا كان استخدام كميات منخفضه فقط من mrna للتحويل ثم قسامه علي mrna لتجنب دورات التجميد المتكررة الذوبان.
    ملاحظه: يمكن تخزين mrna في-80 درجه مئوية لمده 1 سنه.

4. اعداد الضامة

  1. موت ببطء C57/BL6 الفئران (استخدام الفئران من نفس الجنس ومن 6-24 أسابيع من العمر) عن طريق خلع عنق الرحم.
    ملاحظه: يمكن استخدام نفس الفئران لعزل PM (الخطوة 4.2) وتوليد BMDM (الخطوات 4.3 و 4.4). لعزله من PM استخدام اثنين علي الأقل من الفئران. ان فقط [بMDM] ان يكون خلقت واحده فاره عاده كافيه.
  2. الإثراء المناعي للبلضام الصفاقي.
    1. ملء حقنه 10 مل مع 0.9 x 40 مم قني مع 8 مل من الجليد الباردة الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) و 2 مل من الهواء. مسح التجويف البريتوني مع تلفزيوني. سيشكل الهواء فقاعه ان يقلل تسرب من ال [ببس].
    2. جمع بسرعة غسل البريتوني مع نفس الحقنه ونقل إلى أنبوب طرد المخروطية مل 50. الجمع بين الخلايا الصفاقي من الفئران متعددة إذا لزم الأمر. إبقاء تعليق الخلية علي الجليد.
    3. تعليق خليه الطرد المركزي في 650 x g لمده 5 دقائق في 4 °c. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 5 مل من 0.2 ٪ nacl ل 30 ثانيه لخلايا الدم الحمراء lyse.
    4. أضافه 5 مل من 1.6 ٪ كلوريد الصوديوم إلى حجم إجمالي من 10 مل لأعاده تكوين الظروف متساوي الحركة. جهاز الطرد المركزي في 650 x g لمده 5 دقائق في 4 °c.
    5. 292.5 97.5 ).
    6. أضافه 2.5 μL من الخرز المغناطيسية مترافق إلى الأجسام المضادة CD11b محدده لكل 97.5 μL من تعليق الخلية (علي سبيل المثال ، أضافه 7.5 μL إلى 292.5 μL).
    7. احتضان علي الجليد لمده 15 دقيقه في 150 لفه في الدقيقة علي شاكر المدارية.
    8. تعليق خليه الطرد المركزي في 650 x g ل 5 دقيقه في 4 °c ، وتجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف.
    9. أضافه 4 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف إلى حجم إجمالي من 5 مل وغسل الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا ثلاث مرات.
    10. كرر الخطوات 4.2.8 و4.2.9 مرتين إضافيتين لما مجموعه ثلاث خطوات للغسيل.
    11. خلال خطوات الغسيل وضع عمود LS في فاصل الخلايا المغناطيسية (انظر جدول المواد). شطف العمود مع 3 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف.
      ملاحظه: تجنب اي فقاعات لان هذه قد تسد العمود.
    12. أعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف. أضافه 3 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف إلى حجم إجمالي من 4 مل ، ومزيج من الأنابيب صعودا وهبوطا ثلاث مرات.
    13. انقل 4 مل من تعليق الخلية إلى عمود LS المغسول.
      ملاحظه: مره أخرى ، تجنب اي فقاعات لان هذه قد تسد العمود.
    14. انتظر حتى يصبح خزان العمود فارغا تماما. لا تقم باضافه سوائل اضافيه حتى يتوقف العمود عن التنقيط.
    15. أضافه 3 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف علي العمود. ثم ، انتظر حتى خزان العمود فارغ تماما. كرر الخطوة 4.2.15 مرتين إضافيتين.
    16. وضع العمود LS في أنبوب طرد المخروطية 15 مل. تطبيق 5 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف علي العمود. الانتظار حتى 2 مل من السوائل قد مرت من خلال العمود ، ثم استخدام المكبس لدفع بلطف الجزء المتبقي في الأنبوب.
    17. تعليق خليه الطرد المركزي في 650 x g ل 5 دقيقه في 4 °c وتجاهل supernatant.
    18. أعاده التعليق بيليه الخلية في 1 مل من DMEM تستكمل مع 10% الحرارة--الجنين الساق المنشط المصل (FCS) (DMEM + FCS).
    19. تحديد عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق العد في الحل التريبين الأزرق في غرفه العد نيوبوير وخلايا البذور في DMEM + FCS في لوحات الثقافة.
      ملاحظه: بذره [م] في كثافة من 100,000 خلايا/بئر في مسطحه [ميكروتر] قعر لوحه. لا تستخدم الانسجه المعالجة الثقافة ألواح كما لا يمكن فصل PM من هذه. استخدام لوحات غير معالجه بدلا من ذلك.
  3. جيل من BMDM
    1. أزاله الجلد والعضلات من الساقين الخلفيتين باستخدام زوج من المقص. اغسل كل ساق بالغمر القصير في 70% الايثانول.
    2. فصل الساقين وفتح كلا طرفي عظم الفخذ والساق عن طريق قطع مع مقص.
    3. ملء حقنه 5 مل مليئه 0.6 مم × 30 ملم قني مع 5 مل من اندوتوكسين منخفض جدا (vle) rpmi 1640 ومسح نخاع العظم من العظام المفتوحة في طبق الثقافة.
    4. الجمع بين نخاع العظم من الفئران متعددة إذا لزم الأمر عن طريق تكرار الخطوات 4.3.3. نقل نخاع العظم إلى أنبوب طرد المخروطية 50 mL.
    5. الطرد المركزي النخاع العظمي تعليق في 650 x g ل 5 دقيقه في 4 °c وتجاهل supernatant.
    6. أعاده تعليق بيليه الخلية في 5 مل من خليه الدم الحمراء تحلل العازلة (8.3 ٪ NH4Cl ، 0.1 M تريس) واحتضان لمده 5 دقائق في RT لlyse خلايا الدم الحمراء.
    7. الطرد المركزي تعليق الخلية في 650 x g في 4 درجه مئوية لمده 5 دقيقه وتجاهل supernatant.
    8. أعاده تعليق الخلية بيليه في 1 مل من vle rpmi 1640 المتوسطة المضافة مع 10 ٪ FCS ، 1 ٪ البنسلين/ستربتوميسين ، 1 ٪ hepes ، 1 ٪ بيروفات الصوديوم و 10 نانوغرام/مل المؤتلف الضامة مستعمره عامل تحفيز (M-السائل الدماغي الشوكي) (rpmi + + + +).
    9. أضافه 4 مل منrpmi + + + + + إلى حجم إجمالي من 5 مل.
    10. اعداد 5 92 مم × 16 مم غير المعالجة اطباق بيتري مع الحدب (انظر جدول المواد) لكل الماوس عن طريق التنضيد 7 مل من rpmi + + + + + المتوسطة في كل طبق.
    11. نقل 1 مل من محلول الخلية إلى 5 اطباق الثقافة المعدة واحتضان في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
    12. بعد 4 أيام ، تغذيه الخلايا عن طريق أضافه 4 مل من RPMI + + + + +. بعد 6-7 أيام ، يتم تمييز خلايا نخاع العظم تماما في BMDM.
  4. حصاد BMDM
    1. أزاله المتوسطة تماما من الاطباق الثقافية. أضافه 5 مل من الحارة 0.2 mM أدتا في الاذاعه التلفزيونية لكل طبق.
    2. كشط برفق لوحه كامله مع مكشطه خليه لفصل BMDM. الجمع بين تعليق الخلية في أنبوب طرد المخروطية 50 mL.
    3. اغسل جميع الاطباق الخمسة مره أخرى. استخدام نفس الحجم من 5 مل من الحارة 0.2 mM أدتا في الاذاعه التلفزيونية لجميع الاطباق 5. الجمع بين هذا التعليق الخلية مع واحد من الخطوة السابقة.
    4. الطرد المركزي تعليق الخلية في 650 x g ل 5 دقيقه في 4 درجه مئوية وتجاهل supernatant.
    5. أعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من vle rpmi 1640 المتوسطة المضافة مع 10 ٪ FCS ، 1 ٪ hepes ، 1 ٪ بيروفات الصوديوم و 10 نانوغرام/مل المؤتلف M-السائل الدماغي الشوكي ولكن لا المضادات الحيوية (rpmi + + + +).
    6. تحديد عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق العد في الحل التريبين الأزرق في غرفه العد نيوبوير وخلايا البذور في rpmi + + + + في لوحات الثقافة.
      ملاحظه: البذور bmdm في كثافة من الخلايا 50,000/الحد الأقصى بشكل جيد في لوحه عيار مكروي أسفل مسطح. لا تستخدم لوحات الانسجه المعالجة الثقافة كما BMDM بالبالكاد يمكن فصلها عن هذه. استخدام لوحات غير معالجه بدلا من ذلك.

5. انتقال الضامة مع mRNA

  1. حساب الحجم المطلوب من المخزن المؤقت للتحويل mRNA.
    ملاحظه: حجم المخزن المؤقت النقل mRNA المطلوبة يعتمد علي حجم جيد: استخدام 200 μL للتحويل في لوحه 6-حسنا ، 100 μL في لوحه 12 بئر وهلم جرا. دائما أضافه حجم الغيار قليلا بسبب فقدان الأنابيب (ولكن ليس كثيرا ، لمنع التخفيف لا لزوم لها من mRNA). علي سبيل المثال ، استخدم 450 μL بدلا من 4 × 100 μL = 400 μL إلى transfect في 4 ابار من لوحه 12 بئر.
  2. حساب الحجم المطلوب من الكاشف العابر mRNA. يتم أضافه كاشف النقل mRNA بنسبه 1:50. علي سبيل المثال ، مطلوب 9 μL من الكاشف النقل mRNA لحجم النهائي من 450 μL.
  3. حساب المبلغ الإجمالي لل mRNA المطلوبة. لا يقل عن 100 ng لكل 100,000 الضامة مطلوبه لنقل كفاءه ، 200 ng يعمل بشكل أفضل (علي سبيل المثال ، 800 ng mRNA إلى transfection 400,000 الضامة).
    1. مضاعفه الكمية المحسوبة من mRNA المطلوبة مع العدد الإجمالي لآبار التي يجب ان يتم نقلها (علي سبيل المثال ، 4 الآبار مع 400,000 الضامة كل: 4 × 800 ng = 3,200 ng mRNA مطلوب في المجموع لجميع الآبار). علي سبيل المثال ، إذا كان سهم mRNA الخاص بك هو 426.8 ng/μL ، فانه من الضروري 7.49 μL للحصول علي التحويل الأمثل ل 4 ابار مع 400,000 الضامة لكل منهما.
  4. أضافه الحجم المحسوب من المخزن المؤقت نقل mRNA (الخطوة 5.1.) ناقص وحدات التخزين لكاشف النقل mRNA (الخطوة 5.2) و mRNA (الخطوة 5.3) إلى أنبوب رد فعل. علي سبيل المثال ، 450 μl-9 μl-7.49 μL = 433.51 μL.
  5. ذوبان الأسهم mRNA ومزجها بالتقليب لطيف من أنبوب التملص. أضافه الحجم المحسوب من mRNA (الخطوة 5.3) إلى أنبوب رد الفعل مع العازلة رد فعل mRNA (في المثال المعروض أعلاه: 7.49 μL في 433.51 μL).
  6. دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g.
  7. دوامه كاشف النقل mRNA ل 5 ليالي وتدور لمده 2 ليالي في 2,000 x ز.
  8. أضف الحجم المحسوب لكاشف النقل mRNA (الخطوة 5.2) إلى أنبوب التفاعل الذي يحتوي علي المخزن المؤقت لناقل الحركة mRNA و mRNA (في المثال المعروض أعلاه: 9 μL من كاشف النقل mRNA).
  9. دوامه مزيج التحويل لمده 5 ليالي وتدور لمده 2 ليالي في 2,000 x g.
  10. احتضان لمده 15 دقيقه في RT.
  11. في الوقت نفسه, استبدلت الثقافة وسط من الضامة مع طازجه, دافئه ثقافة وسط (رايت خطوات 4.2.18. و 4.4.5).
  12. بعد الخطوة حضانة 5.10 ، أضافه مزيج التحويل إلى الآبار التي تحتوي علي الضامة في حجم مناسب لحجم البئر (انظر الخطوة 5.1). أضف مزيج القطرات في دائره من الخارج إلى وسط البئر.
  13. صخره بلطف لوحه ، أولا في العمودي ومن ثم في اتجاه أفقي لضمان توزيع موحد لمزيج ترانسكشن في البئر. ثم ، احتضان في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2. سيبدا توليف البروتين المرمز بواسطة mRNA المقطع بعد فتره وجيزة من الانتقال. للحصول علي أفضل النتائج ، احتضان لمده 6 ساعات علي الأقل.
  14. بعد الحضانة ، وتحليل كفاءه النقل عن طريق (المناعي) المجهر الفلوري ، تدفق الخلوية أو المناعة16، أو استخدام الضامة المقسمة للتجربة الاختيار.

النتائج

لقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لتوليد mRNA الترميز للعلم الموسومة نيمو والمتغيرات IKKβ لتحويل الضامة الاساسيه16. الترميز البلازميدات للعلم--الموسومة من نوع البرية (نيموWT) و C54/347a متحولة نيمو (نيموC54/374a) (انظر جدول المواد) تحتوي بالفعل علي T7...

Discussion

هنا نقدم بروتوكول لنقل كفاءه عاليه من الضامة الاساسيه عاده من الصعب إلى ترنسفكايشن مع في المختبر كتبت mrna. والاهم من ذلك ، فان انتقال الضامة باستخدام هذا البروتوكول لا يحفز موت الخلايا أو ينشط الإشارات التهابيه التي تشير إلى انه لا يتم التعرف علي الكاشف العابر ولا علي مركبات mRNA غير الذاتية....

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ساندت هذا عمل كان ب ال [دوتش] [فورسسكهنغجيميندسكهفت] ([سالفيس] 670).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-methyl-CTP (100 mM)Jena BiosienceNU-1138Sstored at -20 °C
Antarctic phosphataseNew England BioLabsM0289stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x)New England BioLabsB0289stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibodyInvitrogenMA1-41046stored at -20 °C
anti-β-actin antibodySigma-AldrichA2228stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with camsSarstedt821,473stored at RT
CD11b Microbeads mouse and humanMiltenyi Biotec130-049-601stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primerSigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primerSigma-Aldrich5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification KitQiagen28104stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primerSigma-Aldrich5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primerSigma-Aldrich5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x)Thermo ScientificB64stored at -20 °C
FastDigest XbaIThermo ScientificFD0684stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-PolymeraseNew England Biolabs IncM0491Sstored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primerSigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primerSigma-Aldrich5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)New England BioLabsE2060stored at -20 °C
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401stored at RT
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGERPolyplus transfection409-0001DEstored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmidAddgene11105stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmidAddgene27268stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmidAddgene62043stored at -20 °C
poly(I:C)Calbiochem528906stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmidF.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM)Jena BiosienceNU-1139Sstored at -20 °C
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugatedBioLegend101212stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugatedeBioscience12-4801-82stored at 4 °C
Recombinant M-CSFPeprotech315-02stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kitThermoFisher ScientificAM1908stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAPSigma-AldrichR2020stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4Invivogenstored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmidAddgene11103stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmidAddgene27268stored at -20 °C

References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, 29-43 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

153 mRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved