مقايسة علي أساس الفلورية لتوصيف وتحديد كميات الدهون التجميعية في تشكيل الأمعاء البشرية

Jorik  M. van Rijn; Marliek van Hoesel; Sabine Middendorp

doi:10.3791/60150

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يصف هذا البروتوكول فحصا لتوصيف المكونات الحبريه الدهنية (LD) في الغدد المعوية البشرية عند التحفيز مع الأحماض الدهنية. نحن نناقش كيفيه استخدام هذا الفحص للقياس الكمي لتشكيل LD ، وكيف يمكن استخدامه لفحص الانتاجيه العالية للادويه التي تؤثر علي تكوين LD.

Abstract

يتم تناول الدهون الغذائية كالاحماض الدهنية الحرة (FAs) بواسطة ظهاره الأمعاء. يتم تحويل هذه FAs اينتراسيلولارلي إلى جزيئات الدهون الثلاثية (TG) ، قبل ان يتم تعبئتها في تشيلوميكرونس لنقل إلى الليمفاوية أو إلى قطرات الدهون عصاري خلوي (LDs) للتخزين داخل الخلايا. خطوه حاسمه لتشكيل LDs هو النشاط الحفاز من التركيب الجلسرين (DGAT) في الخطوة الاخيره من التوليف TG. LDs مهمة لتخزين أنواع الدهون السامة وتنظيم الأيض الخلوي في أنواع مختلفه من الخلايا. منذ يتم مواجهه ظهاره الأمعاء البشرية بانتظام مع تركيزات عاليه من الدهون ، وتشكيل LD من اهميه كبيره لتنظيم التوازن. هنا نحن وصف فحص بسيط لتوصيف والكمية من تكوين LD (DF) عند التحفيز مع الأكثر شيوعا الأحماض الدهنية غير المشبعة ، حمض الاوليك ، في الأمعاء المعوية البشرية. ويستند الفحص DF علي صبغ الفلورسنت LD محدده LD540, الذي يسمح للقياس الكمي من LDs عن طريق المجهر البؤري, قارئ لوحه الفلورسنت, أو تدفق الخلوية. ويمكن استخدام فحص DF لتوصيف تكوين LD في الخلايا الظهاريه المعوية البشرية ، أو لدراسة الاضطرابات البشرية (الوراثية) التي تؤثر علي الأيض LD ، مثل نقص DGAT1. وعلاوة علي ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا الفحص في خط أنابيب عاليه الانتاجيه لاختبار المركبات العلاجية الجديدة ، والتي تستعيد العيوب في تشكيل LD في الأمعاء أو أنواع أخرى من العضوية.

Introduction

الدهون هي عنصر حاسم في النظام الغذائي البشري وتلعب دورا هاما في تخزين الطاقة الجهازية والأيض. عند بلعها ، يتم تدهور الدهون الغذائية إلى الأحماض الدهنية الحرة (FFAs) و مونوليسريدس (MGs) بواسطة lipases البنكرياس. ثم يتم تناول هذه الركائز من قبل الخلايا المعوية من ظهاره الأمعاء ، حيث يتم أولا أعاده استيريفيد إلى ديسريميدس (DG) بواسطة انزيمات أحادي الغليسريد اسيترانسفيراسيس (MGAT) وبعد ذلك إلى الشحوم الثلاثية (TG) بواسطة التشكيل الجلسرين (DGAT1)¹. وأخيرا ، يتم دمج هذه tgs في اي تشيلوميكرونس للتصدير إلى النظام الليمفاوي أو قطرات الدهون عصاري خلوي (LDs) للتخزين داخل الخلايا²^،³. علي الرغم من ان هناك حاجه لتشيلوميكرونس لتوزيع الدهون الغذائية للأعضاء الأخرى ، فان اهميه تخزين الدهون داخل الخلايا في LDs ليست واضحة تماما. ومع ذلك, وقد أظهرت LDs لأداء وظيفة تنظيميه في الأمعاء, كما انها ببطء الإفراج عن الدهون في الدورة الدموية تصل إلى 16 ح بعد وجبه⁴. وعلاوة علي ذلك, وقد أظهرت LDs لحماية ضد تركيزات الأحماض الدهنية السامة, مثل في الخلايا الشحمية الماوس خلال الحالات المتعددة الدهون⁵.

ويقع البروتين DGAT1 علي غشاء الشبكية إندوبلازمي (ER) ويلعب دورا حاسما في تشكيل LD في ظهاره الأمعاء. الطفرات المنزلية في DGAT1 يؤدي إلى بداية مبكرة الإسهال الشديد و/أو القيء ، نقص البوميميا ، و/أو (قاتل) البروتين-فقدان الأمعاء مع فشل الأمعاء علي تناول الدهون ، مما يدل علي اهميه DGAT1 في التوازن الدهون من الإنسان ظهاره معوية⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. وبما ان حدوث نقص في الDGAT1 في البشر أمر نادر ، فقد كان الوصول إلى الخلايا الاوليه المستمدة من المرضي شحيحا. وعلاوة علي ذلك ، فان الثقافة طويلة الأجل للخلايا الظهاريه المعوية قد اقتصرت منذ فتره طويلة علي خطوط الخلايا المشتقة من الورم التي تمثل فسيولوجيا الطبيعية فقط لتمديد محدوده. لذلك, [DGAT1-بوساطة] [لد] أسست تشكيل يتلقى يكون في الأغلب في [فيبروبلاستس] أو [انيمل-فيلد] خليه خطوط⁷^,¹⁰^,¹¹^,¹². علي هذا النحو, وقد تبين مؤخرا ان الخلايا الليفية المشتقة من المريض DGAT1 تتراكم اقل LDs بالمقارنة مع خليه التحكم الصحية بعد التحفيز مع حمض الاوليك (OA)⁸.

سابقا ، تم إنشاء بروتوكولات للثقافة الخلايا الجذعية الظهاريه من اي جهاز الهضمي في شكل ثلاثي الابعاد (3D) الهيكل التنظيمي¹³. ويمكن الاحتفاظ بهذه العضوية المعوية في الثقافة لفتره طويلة من الزمن¹³، والسماح للدراسة الوظيفية للمريض-والأمعاء خصائص الظهاريه الموقع المحدد¹⁴. فهي مستقره وراثيا وظاهريا ويمكن تخزينها ، مما يسمح التوسع علي المدى الطويل و بيوانكينج¹³.

وقد أظهرنا مؤخرا ان تشكيل LD يمكن قياسه بسهوله في الأمعاء المعوية البشرية في الفحص^السادسلتشكيل الهوية العامة (df). عند التعرض للزراعة العضوية لمده 16 ساعة ، تولد الorganoids LDs لحماية الخلايا من السمية المستحثة بالدهن. عندما تركيزات الزراعة العضوية مرتفعه جدا ، تموت الخلايا من قبل المبرمج بوساطة caspase⁶. وقد تبين سابقا ان الفحص الذي قامت به هذه المبيدات يعتمد إلى حد كبير علي DGAT1 علي النحو المشار اليه في الغدد العضوية المشتقة من المرضي DGAT1 المتحولين وباستخدام مثبطات DGAT1 الخاصة⁶.

لفحص DF الموصوفة بالتفصيل هنا ، يتم استزراع العضو العضوي ثلاثي الابعاد من الخزعات المعوية ويتم المرور أسبوعيا عن طريق التشويش في خلايا واحده تشكل بسهوله التشكيلات العضوية الجديدة. لتشغيل فحص DF ، يتم طلاء ~ 7,500 الخلايا الاحاديه المشتقة organoid في كل بئر من لوحه 24 بئر. تتشكل organoids علي مدي عده أيام ، حضنت بين عشيه وضحيها مع 1 مم الزراعة العضوية وملطخه مع LD540 ، وهي صبغه الخلية الفلورية-نفاذيه LD الخاصة التي تسهل التصوير. ثم يتم قياس تشكيل LD عن طريق المجهر البؤري ، قارئ لوحه الفلورسنت ، أو تدفق الخلوي.

عن طريق قياس هذا الفحص التشكيل LD إلى شكل 96-بئر ، يمكن أيضا ان تستخدم المقايسة لتحليل عاليه الانتاجيه لتشكيل LD لفحص المخدرات الرواية التي تؤثر علي تكوين LD في الثقافات المعوية الأمعاء البشرية ، أو لدراسة (الوراثية البشرية) الاضطرابات التي تؤثر علي الأيض LD.

Protocol

تمت الموافقة علي جميع التجارب باستخدام الانسجه البشرية الموصوفة هنا من قبل اللجنة الاخلاقيه في المركز الطبي الجامعي اوترخت (UMCU). تم الحصول علي موافقه مستنيرة لجمع الانسجه وتوليدها وتخزينها واستخدامها من المرضي في مستشفي ويلهيلمينا للأطفال (WKZ)-UMCU.

1. اعداد وسائل الاعلام الثقافية

ملاحظه: يجب ان يتم تنفيذ هذا البروتوكول داخل خزانه السلامة الاحيائيه. يجب التعامل مع الهيكل التنظيمي وفقا للمبادئ التوجيهية لثقافة الخلية القياسية.

اعداد الثقافة القاعدية المتوسطة.
ملاحظه: يتم الاشاره إلى متوسط الثقافة بدون عوامل النمو كوسيط قاعدي (BM).
1. أضافه 5 مل من HEPES (1 M) ، 5 مل من L-غلوامين (100x) و 5 مل من البنسلين-ستربتوميسين (5,000 U/mL) إلى 500 مل من المتقدمة دولبيكو المتوسطة النسر المعدلة مع لحم الخنزير مزيج المغذيات F-12 لاعداد BM المتوسطة.
2. تخزين المتوسطة BM المعدة في 4 درجه مئوية واستخدامها لمده أقصاها 2 أشهر.
اعداد الوسيطة R-سبودين ونوجين مكيفه (CM) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
1. لفتره وجيزة ، يكبر الخلايا إلى الكمية المطلوبة في القوارير مع 5 × 10⁷ خلايا في 555 mL المتوسطة دون المضادات الحيوية الانتقائية للزجاجة الواحدة.
2. تنمو الخلايا لمده 4 أيام حتى متموج.
3. استبدل الوسيط ب BM والثقافة لمده 8 أيام اضافيه.
4. بعد 8 أيام من الثقافة في 37 درجه مئوية ، وجمع المتوسطة الثقافة والطرد المركزي لمده 5 دقائق في 450 x g إلى بيليه اي الخلايا المتبقية.
5. تصفيه تعقيم سوبرناتانت ، وتخزين الارصفه من R-سبودين أو نوجين سم في-20 درجه مئوية لمده أقصاها 6 أشهر.
اعداد Wnt3A-سم وفقا لبنك اليابان وآخرون¹⁵.
1. لفتره وجيزة ، يكبر الخلايا إلى الكمية المطلوبة في 145 مم الاطباق مع 2 × 10⁶ خلايا في 20 مل متوسطه دون مضاد حيوي انتقائي لكل طبق. التفاف كل طبق مع إحباط من البلاستيك لتجنب تبخر الوسط الثقافي.
2. بعد 8 أيام من الثقافة في 37 درجه مئوية ، وجمع المتوسطة الثقافة والطرد المركزي لمده 5 دقائق في 450 x g إلى بيليه اي الخلايا المتبقية.
3. تصفيه تعقيم supernatant ، وتخزين الارصفه من Wnt3A-سم في 4 درجه مئوية لمده أقصاها 2 أشهر.
اعداد المتوسطة التوسع العضوي.
ملاحظه: الإنسان الصغيرة المعوية التوسع العضوي المتوسطة (انظر وصفه في الجدول التكميلي 1) يشار اليها باسم HSI-EM. ستنتج الخطوات التالية الحجم النهائي من 1 L hSI-EM ، ويمكن توسيعها لاعلي أو لأسفل كما هو مطلوب.
1. حل 1.46 غرام من نيكوتيناميد في 12 مل من الخلية الصف الثقافة الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) لخلق التخفيف النهائي من 1 م.
2. حل 245 ملغ من ن-اسيتيل السيستين في 3 مل من الخلية ثقافة الصف تلفزيوني لخلق التخفيف النهائي من 500 mM.
  ملاحظه: لتسريع تشكيل الحل ، يمكن احتضان نيكوتيناميد و n-اسيتيل السيستين في حمام مائي في 37 درجه مئوية. ويمكن اعداد كلا الحلين في دفعه ، المقتبسة ، وتخزينها في-20 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل.
3. تصفيه تعقيم كل من الحلول من خلال فلتر 0.22 μm في أنبوب معقم 15 مل.
4. أضافه 167 mL من BM إلى معقمه 500 mL الثقافة قارورة المتوسطة. أضافه 200 mL من R-سبوندين-سم ، 100 مل من راس-سم ، و 100 μL من mEGF المؤتلف (500 ميكروغرام/مل) إلى تركيز نهائي من 50 ng/mL.
5. أضف 10 مل من محلول نيكوتيناميد المعقم و 2.5 مل من محلول التعقيم n-اسيتيل السيستين. أضافه 20 مل من B27 الملحق (50x).
  ملاحظه: في هذه المرحلة ، يشار إلى الوسيطة باسم hSI-EM دون كان (Wnt3A ، A83 ، و SB202190) ، ويمكن نقلها وتخزينها عند-20 درجه مئوية. إذا كانت الوسيطة مقتبسه إلى وحدات تخزين أصغر ، اضبط تركيزات الخطوات التالية وفقا لذلك.
6. إلى 500 مل من hSI-EM دون كان ، أضافه 10 مل من Wnt3A من آخر دفعه أعدت طازجه و 10 مل من Wnt3A-سم من الدفعة الاخيره الثانية للحد من تغيرات التقلب في ظروف Wnt3A سم.
7. أضافه A83 إلى تركيز نهائي من 500 nM ، و SB202190 إلى تركيز نهائي من 10 μM.
8. تخزين hSI-EM المعدة (مع كان) في 4 درجه مئوية واستخدامها لمده أقصاها 2 أسابيع.
  ملاحظه: أضف 27632 اضافيه إلى تركيز نهائي من 10 μM (يشار اليها باسم hSI-EM + Y) عندما تكون الشفرات أو الخلايا المفردة مستزرعه أو تبدا العضوية العضوية من الحجز بالتبريد.
اعداد فرز الخلايا النشطة الفلورسنت (FACS) المخزن المؤقت.
1. أضافه 10 مل من مصل الساق الجنينية (FCS) إلى 40 مل من تلفزيوني دون Ca^{2 +}/Mg^{2 +} للتركيز النهائي من 10 ٪ FCS.
  ملاحظه: يمنع FCS الخلايا من الانضمام إلى labware.

2-الإجراءات الثقافية للإنسان العضوي المعوي الصغير

ملاحظه: يجب ان يتم تنفيذ هذا البروتوكول داخل خزانه السلامة الاحيائيه. يجب التعامل مع الهيكل التنظيمي وفقا للمبادئ التوجيهية لثقافة الخلية القياسية. عند التعامل مع الخلايا العضوية أو المشتقة من العضو العضوي ، يجب إبقاء الخلايا علي الجليد كلما أمكن ذلك. ستظل الخلايا قابله للاستمرار لبضع ساعات بعد الحصاد عندما يكون ذلك مكفولا. وينبغي ان تكون مثقفه organoids في حاضنه الثقافة خليه القياسية في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO₂. وتنطبق هذه الشروط علي جميع خطوات الحضانة مع الهيكل العضوي المضمن في مصفوفة غشاء القبو (BMM ؛ اي ، النظام الأمومي) في جميع انحاء هذا البروتوكول. وقد استخدم المؤلفون الاثني عشر المشتقة من العضو العضوي لهذه المقايسات.

التمرير العضوي
ملاحظه: كل ثقافة organoid لديها وقت مضاعفه الخاصة بها. عاده ، يمكن ان تكون العضوي المعوية الصغيرة المرور 1:3 − 1:5 كل 7 − 10 أيام. عند المرور كخلايا واحده ، يمكن ان تصل كفاءه التمرير إلى 1:20 ، اعتمادا علي كثافة الخلايا. لإنشاء وصيانة ، يتم استزراع العضوية في لوحات 24-حسنا ؛ لمقايسة DF ، في لوحات اما 24 أو 96-حسنا.
1. اعداد
  1. قبل الحارة تفكيكها 24--حسنا الانسجه ثقافة لوحات في حاضنه في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO₂ علي الأقل بين عشيه وضحيها ، ويفضل 5 أيام مقدما.
    ملاحظه: ما قبل الاحترار لوحات ثقافة الانسجه في حاضنه ثقافة الخلية يضمن تشكيل السليم والتعلق من قطرات التي تحتوي علي organoid من BMM.
  2. للحد من عدد دورات التجميد والذوبان ، واعداد 1 مل من الارصفه من BMM وتخزين في-20 درجه مئوية. ذوبان قارورة من BMM علي الجليد علي الأقل 30 دقيقه قبل البدء في اجراء المرور العضوي.
  3. الحفاظ علي أنبوب 50 mL من BM علي الجليد وغسل المتوسطة.
  4. اعداد hSI-EM كما هو موضح في القسم 1.4 ، واعداد كميه مناسبه من hSI-EM + Y ، علي سبيل المثال ، 15 مل لكامل 24 بئر لوحه.
2. جمع العضوي.
  1. يستنشق بعناية وسط الثقافة دون إزعاج قطرات BMM.
  2. أضافه 500 μl من BM الباردة إلى البئر الاولي من organoids ، وتعطيل قطرات bmm مع العضوية عن طريق التنقيط بلطف صعودا وهبوطا مع عينه P1000.
  3. كرر هذا الاجراء مع نفس المتوسطة في البئر التالي كما هو مطلوب ، ولكن لا حصاد أكثر من 2 الآبار لكل 500 μL من BM.
  4. جمع العضوية في المنخفضة--ملزمه 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير وتدور في مصغره المركزية المنضديه لمده 15 − 20 s (الحد الأقصى 2,000 x g). يستنشق ماده طافي تماما وأزاله الجزء الأخير من المتوسطة مع pipet P200.
    ملاحظه: عندما تبدو الثقافات العضوية نظيفه تحت المجهر ولا تحتوي علي اي خلايا ميتة أو غيرها من الحطام ، يمكن حصاد قطرات BMM مباشره في التريبسين بدلا من BM في الخطوة 2.1.2.2. بعد خطوه 2.1.2.3 ، انتقل مباشره إلى الحضانة في الخطوة 2.1.3.1.
3. الانفصال العضوي في خلايا واحده.
  1. أضف 400 μL من التريبسين إلى الهيكل العضوي الذي تم نسجه. احتضان الهيكل العضوي عند 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق في حمام مائي.
  2. تعطيل المجاميع المتبقية من الخلايا عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا برفق مع عينه P200. مره أخرى ، احتضان organoids في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق في حمام مائي.
  3. تحقق من تقدم تفكك الخلية تحت المجهر باستخدام التكبير 4x. كرر التعطيل اليدوي والاحتضان عندما تبقي كتل كبيره من الخلايا.
  4. عندما تبقي خلايا واحده فقط ، أضافه 1 مل من BM وتدور أسفل الخلايا في جهاز الطرد المركزي مصغره الطاولة ل 15 − 20 s.
  5. يستنشق العملاق تماما. أعاده تعليق الخلايا المفردة في 200 μL من hSI-EM الطازجة باستخدام pipet P200. أضافه 800 μL اضافيه من hSI-EM.
  6. عد عدد الخلايا في التعليق.
    ملاحظه: في مختبر المؤلفين ، ينتج العد اليدوي للخلايا العضوية المنفصلة نتائج أكثر موثوقيه من العداد الألى للخلايا. عند استخدام عداد الخلايا المؤتمتة ، يجب اختبار كثافة الخلية للتطبيقات المتلقية للمعلومات في المنزل وتعديلها إذا كان القليل جدا أو عدد كبير جدا من العضو العضوي ينمو.
4. البذور العضوية للصيانة أو فحص تشكيل قطره الدهون.
  1. احسب حجم الخلايا المطلوبة لكثافة الخلية النهائية.
    ملاحظه: حوالي 250 خلايا/μL هو كثافة مناسبه. في لوحه 24 بئر ، يتم البذر 30 μL في كل بئر ، في حين يتم المصنفة 5 μL في كل بئر من لوحه 96 البئر.
  2. إخراج الحجم المناسب من تعليق وضبط الكثافة إلى 750 خلايا/μL (أو تدور إلى أسفل وأعاده التعليق عندما تكون الكثافة منخفضه جدا).
  3. أضافه BMM إلى تعليق الخلية بنسبه 2:1. كثافة الخلية النهائية في هذا الخليط هو 250 خلايا/μL. مزيج بلطف التعليق عن طريق التنضيد ، وتجنب بعناية اي فقاعات.
  4. في لوحه ثقافة الانسجه التي تم تسخينها مسبقا ، البذور من 3 10 μL قطرات لكل بئر في لوحه 24 بئر أو قطره واحده 5 μL في بئر في لوحه 96-حسنا.
  5. وضع لوحه في حاضنه في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO₂ لمده 10 − 15 دقيقه لترسيخ قطرات bmm. وفي الوقت نفسه ، قبل الحارة كميه مناسبه من hSI-EM + Y في حمام مائي في 37 درجه مئوية.
  6. بعناية أضافه 500 μL من قبل الحرارة hSI-EM + Y إلى كل بئر من لوحه 24 بئر أو 100 μL لكل بئر من لوحه 96-حسنا. احتضان الخلايا في حاضنه في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO₂ وبعد 2 − 3 أيام تغيير المتوسطة إلى HSI-EM (بدون Y) وتحديث 2 − 3 مرات في الأسبوع.
    ملاحظه: بعد 7 − 10 أيام ، يجب ان تكون ثقافة الصيانة من العضو العضوي المرور مره أخرى.

3. فحص الدهون في تشكيل القطرات

اعداد المتقارن حمض الاوليك
ملاحظه: منذ حمض الاوليك (الزراعة العضوية) هو مسعور وغير قابل للذوبان في الماء ، وهو مترافق إلى الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسني). يمكن للجيش الصربي البوسني ربط جزيئات الأحماض الدهنية المتعددة وهو في هذه الحالة يستخدم بنسبه 1:8 لجعل حمض الاوليك في متناول الخلايا المعوية. الأحماض الدهنية الحرة والجيش الصربي البوسني يمكن ربط كل من البلاستيك labware. لضمان التركيز النهائي السليم ، واستخدام قوارير زجاجيه والزجاج pipets كلما كان ذلك ممكنا.
1. تزن 0.2 غرام من حمض الاوليك السائل في درجه حرارة الغرفة. أضافه 1.5 mL من الصف الثقافي المعقمة والحرارة الخليط إلى 70 درجه مئوية ل 1 ح. دوامه بشكل متقطع.
2. تزن 5.89 غ من الأحماض الدهنية الخالية من الحمض الصربي البوسني وتذوب في 33.9 مل من الخدمات التلفزيونية. يسخن الخليط في حمام مائي عند 37 درجه مئوية حتى يذوب الجيش الصربي البوسني بالبالكامل.
3. دوامه خليط الزراعة العضوية مره أخرى لخلق مستحلب من قطرات غرامه وأضافها فورا إلى حل جيش صرب الجمهورية باستخدام pipet الزجاج. الحفاظ علي الحل النهائي بالقرب من 37 درجه مئوية بعد أضافه الزراعة العضوية. الخليط النهائي يتكون من 20 مم الزراعة العضوية في 2.5 mM الجيش الصربي البوسني.
4. الحفاظ علي الخليط في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه حتى يبقي محلول مصفر واضح.
5. ويمكن الاستشهاد بالمركب المذكور وتجميده عند-20 درجه مئوية لمده 6 أشهر علي الأقل. عند ذوبان الجليد ، احتضانه في 37 درجه مئوية حتى يذوب الغيوم والخليط هو واضح مره أخرى.
  ملاحظه: بسبب البروتين عاليه ومحتوي الدهون من الحل النهائي ، لا يمكن ان يكون الخليط فلتر تعقيمها أو تعقيمها. عندما تم التعامل مع المكونات مع الرعاية ، في غطاء التيار الرقائقي عندما يكون ذلك ممكنا وباستخدام العقيمة تلفزيوني ، والمؤلفين لم تواجه التهابات الميكروبية.
الفحص البؤري
1. اعداد العينات
  1. المرور العضوي كما هو موضح في القسم 2.1. البذور خارج الخلايا الاحاديه المشتقة العضوية في لوحه سوداء واضحة القاع 96-بئر.
  2. في اليوم 6 من الثقافة علي hSI-EM ، استبدل الوسط الثقافي مع hSI-EM التي تحتوي علي 1 مم الزراعة العضوية الصربية المترافق.
  3. احتضان الخلايا لمده 16 − 17 ساعة (بين عشيه وضحيها) في 37 درجه مئوية في وجود أو عدم وجود مثبطات 0.1 μM DGAT1. وتشمل مراقبه السيارة من 2.5 mM جيش صرب البوسنيين.
  4. بعد 16 − 17 ساعة ، يستنشق الوسط دون إزعاج قطرات BMM. Fixate الهيكل التنظيمي عن طريق أضافه 100 μL من 4 ٪ محايده الفورمالديهايد المخزنة مؤقتا إلى الآبار لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    ملاحظه: الفورمالديهايد سوف تذوب جزئيا BMM ، في حين ان الصفائح العضوية تغرق إلى أسفل والتمسك الجزء السفلي من لوحه.
  5. أزاله الفورمالديهايد بلطف ، ويغسل بعناية الآبار مع 150 μL من تلفزيوني لكل بئر.
  6. وصمه عار الخلايا ل LDs مع 0.025 mg/mL LD540 و 4 ′, 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) في الخدمات التلفزيونية لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
  7. اغسل الآبار بعناية مع الاذاعه التلفزيونية.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا عند الضرورة. حافظ علي العينات المغطية في الظلام عند 4 درجه مئوية. فان تلطيخ LD540 تبقي مستقره لمده تصل إلى أسبوع. ويمكن أيضا اجراء هذا الفحص مع الخلايا الحية ، لمراقبه تكوين LD علي مدي فتره من الزمن. لهذا ، يجب ان يتم حذف التثبيت من البروتوكول ، وينبغي استبدال DAPI مع تلطيخ Hoechst. LD540 يمكن وصمه عار LDs في الخلايا الحية في نفس التركيز كما هو موضح.
2. التصوير البؤري
  ملاحظه: يمكن اجراء التصوير علي العينات العضوية المعدة في اللوحة السوداء الشفافة 96 السفلي.
  1. للحصول علي صور عامه للصور العضوية الكاملة ، استخدم الهدف 40x المناسب للتصوير الفلوري البؤري.
  2. تعيين المجهر لصوره قناه DAPI في الاثاره 405 نانومتر و ca. 410 − 535 نانومتر الانبعاثات الموجي. لصبغ LD540 اختيار الليزر الاثاره في 540 nm (543 nm هو الأمثل) وتعيين مرشحات الانبعاثات إلى 545 − 700 نانومتر.
    ملاحظه: في هذا البروتوكول ، تم استخدام نظام المسح الضوئي بالليزر مع ليزر الضوء الأبيض ، والصوتية-البصرية الخائن شعاع (AOBS) ، 10x/20x الهدف ، ونظام الكشف الطيفي. وهذا يسمح لضبط الدقيق لأطوال موجية محدده. في حاله عدم توفر نظام مشابه ، اختر خطوط الليزر ومرشحات التمرير القصير/الطويل بالقرب من المواصفات المذكورة أعلاه. بالنسبة للتصوير العضوي الكامل ، فان دقه 512 × 512 أو 1024 × 1024 كافيه لتحليل الصورة النهائية.
  3. تعيين حجم الثقب إلى وحده مهواه 1 (AU) لدقه المحور z كافيه.
  4. لصوره نصف واحد من organoid كرويه ، تعيين z-كومه إلى ما يقرب من 85 μm.
3. تحليل الصور
  ملاحظه: لتحليل الصور ، تم استخدام فيجي/imagej¹⁶^،¹⁷ لتوليد الحد الأقصى من التوقعات. ويمكن اجراء التحليل مع اي حزمه برامج تحليل الصور التي تسمح لاقصي قدر من الإسقاط ، الدرس اليدوي ، وتحليل الجسيمات.
  1. باستخدام فيجي/ImageJ ، تحويل z-كومه من كل organoid إلى الحد الأقصى الإسقاط: صوره | مداخن | Z-المشروع.
  2. تعيين عتبه الحد الأقصى للإسقاط إلى مستوي لا توجد فيه اشاره LD540 مرئية في عينه التحكم في المركبات من الجيش الصربي البوسني: الصورة | ضبط | عتبه. استخدم هذه الإعدادات لعتبه كل صوره.
  3. قياس المساحة الاجماليه للمضان لكل إسقاط الحد الأقصى باستخدام وظيفة تحليل | تحليل الجزيئات.
    ملاحظه: علي الرغم من ان القرار المقايسة هو أفضل باستخدام المجهر البؤري ، ويمكن أيضا تحليل هذا الفحص باستخدام قارئ لوحه الفلورسنت مع مرشحات مماثله. لتطبيع للعد العضوي لكل بئر ، يجب تقسيم اشاره LD540 بواسطة اشاره DAPI. وأخيرا ، ينبغي طرح اشاره مراقبه المركبات التابعة للجيش الصربي البوسني لتطبيع القياسات. ويسمح هذا النهج بتحجيم المقايسة باتجاه شكل لوحه 96.
فحص القياس الخلوي لتدفق DF
1. اعداد العينات
  1. المرور العضوي كما هو موضح في القسم 2.1. بذور الخلايا الاحاديه المشتقة من الأرغن في لوحه ثقافة الانسجه 24 بئر. اثنين من الآبار لكل حاله كافيه لقياس التدفق الخلوي.
  2. في اليوم 10 من الثقافة علي hSI-EM ، استبدل الوسط الثقافي مع hSI-EM التي تحتوي علي 1 مم الزراعة العضوية الصربية المترافق.
    ملاحظه: وعلي النقيض من التحليل البؤري ، تم اختيار 10 أيام من النمو في التقييم الخلوي لقياس التدفق بدلا من 6 أيام. الاضافيه 4 أيام من التوسع سيؤدي إلى متداخلة بصريا العضوية التي من شانها ان تعقد الفحص القائم علي المجهر. ومع ذلك ، فان العدد الأكبر من الخلايا يسهل تحليل التدفق الخلوي.
  3. احتضان الخلايا لمده 16 − 17 ساعة (بين عشيه وضحيها) في 37 درجه مئوية في وجود أو عدم وجود مثبطات 0.1 μM DGAT1. وتشمل مراقبه السيارة من 2.5 mM جيش صرب البوسنيين.
  4. بعد 16 − 17 ساعة ، وجمع الهيكل التنظيمي كما هو موضح في القسم 2-1-2.
  5. فصل الهيكل العضوي في خلايا واحده كما هو موضح في القسم 2-1-3.
    ملاحظه: علي الرغم من عدم الحاجة الصارمة ، فمن المستحسن للتحقق من عدد الخلايا في كل عينه. العدد الإجمالي للخلايا 10,000 لكل عينه هو الحد الأدنى المطلق المطلوب لدقه كافيه. للحصول علي أفضل النتائج استخدام الخلايا الكالسيوم 50000 − 100000.
  6. تدور الخلايا في جهاز الطرد المركزي مصغره منضديه لمده 15 − 20 s.
  7. وصمه عار كل عينه مع 500 μL من 0.025 mg/mL LD540 و 1 ميكروغرام/مل Hoechst في التلفزيونية الخاصة لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
  8. تدور الخلايا في جهاز الطرد المركزي مصغره منضديه لمده 15 − 20 s ويغسل 3x مع تلفزيوني.
  9. Fixate الخلايا عن طريق أعاده تعليق لهم في 500 μL من 4 ٪ محايد الفورمالديهايد المخزنة مؤقتا لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
  10. تدور أسفل الخلايا ويغسل 3x مع العازلة FACS.
  11. قبل شطف أنابيب FACS مع العازلة FACS لمنع الخلايا الشائكة إلى جدار الأنبوب.
  12. أعاده تعليق الخلايا في 200 μL من المخزن المؤقت FACS ونقل تعليق الخلية إلى أنابيب FACS شطفها مسبقا.
2. تحليل التدفق الخلوي
  1. تعيين المعلمات النابضة لاستبعاد الخلايا الميتة وكتل من الخلايا (انظر قسم النتائج التمثيلية).
  2. في السكان بوابات النهائي, قياس ما لا يقل عن 10,000 خلايا لنتائج موثوق بها.
    ملاحظه: من هذا السكان ، فان متوسط كثافة الفلورسنت (مؤسسه مونتانيار) من LD540 ومتوسط الاشاره SSC-A معا توفر مقياسا للحجم الإجمالي لتشكيل LD للخلية الواحدة.

النتائج

للتحليل السليم لتشكيل LD ، يجب ان لا يتم المصنفة العضوية الكثيفة جدا قبل التحفيز مع الزراعة وتلطيخ اللاحقة. هذا هو خصوصا من الاهميه بالنسبة للقراءة المنسق ولوحه قراءات, منذ تداخل العضوية قد تتداخل مع فلوري. مثال علي كثافة البذر العضوي السليم (الشكل 1ا

Discussion

هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لتحديد تكوين LD في العضوية المعوية البشرية عند الحضانة مع حمض الاوليك. ويستند هذا الأسلوب علي الصبغة الفلورية LD الخاصة LD540¹⁸، والذي يسمح لتوصيف والتقدير الكمي للحجم الكلي من قطرات الدهون داخل ثقافة organoid. وقد نشرت الإجراءات المتعلقة بإنشاء وصيانة الثقاف...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

نشكر b. Spee لتوفير بسخاء LD540. وقد حظي هذا العمل بدعم منظمه هولندية للمنح البحثية العلمية (NWO-ZonMW ؛ VIDI 016.146.353) إلى اس ام

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-028
B27 supplement	Gibco	17504-044
Basement membrane matrix (matrigel)	BD Biosciences	356231
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG
DGAT1 inhibitor (AZD 3988)	Tocris Bioscience	4837/10
Fatty acid free BSA	Sigma-Aldrich	A7030
Formaldehyde	Klinipath	4078-9001
Glutamin (GlutaMAX, 100x)	Gibco	15630-056
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Laser scanning confocal microscope	Leica	SP8X
LD540			kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University
mEGF	Peprotech	315-09_500ug
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-100G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-500G
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)			MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Oleic acid	Sigma-Aldrich	O1008-5G
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	Sigma-Aldrich	S7067-25MG
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML
PBS without Ca²⁺/Mg²⁺	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070-063
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)	R&D systems	3710-001-01
TC-treated 24 well plates	Greiner-One	662160
TC-treated black clear-bottom 96 well plates	Corning Life Sciences	353219
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)	Tocris Bioscience	2939/10
Trypsin (TrypLE Express)	Life Technologies	12604021
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)			MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)	Abcam	ab120129-10

References

Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152 DGAT1

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: