JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تتعاون بروتينات Cognate J-domain مع مرافق Hsp70 للمساعدة في عدد لا يحصى من العمليات البيولوجية التي تتراوح بين طي البروتين إلى التدهور. هنا، ونحن نصف دراسة الربط القرب في الموقع، والذي يسمح برصد هذه الآلات مرافقة شكلت عابرة في الخلايا البكتيرية والخميرة والبشرية.

Abstract

البروتينات J-المجال (JDPs) تشكل أكبر وأكثر تنوعا الأسرة المشتركة في الخلايا eukaryotic. وتظهر النتائج الأخيرة أن أعضاء معينين من عائلة JDP يمكن أن تشكل المجمعات غير المتجانسة العابرة في eukaryotes لضبط اختيار الركيزة لضبط البروتين صدمة الحرارة 70 kDa (Hsp70) المثبطون القائم على البروتين المفككة. تستهدف مجمعات JDP البروتينات المجمعة الناجمة عن الإجهاد الحاد/المزمن، ويفترض أنها تساعد في تجميع التدرجات عن طريق توظيف عدة من Hsp70s على سطح مجاميع البروتين. مدى شبكة مراقبة جودة البروتين (PQC) التي شكلتها هذه JDPs التفاعل جسديا لا يزال إلى حد كبير غير مميزة في الجسم الحي. هنا، نقوم بوصف الفحص المجهري القائم على التفاعل البروتيني في الموقع المسمى الفحص ربط القرب (PLA)، والتي هي قادرة على التقاط بقوة هذه المجمعات مرافقة شكلت عابرة في مقصورات الخلوية متميزة من الخلايا eukaryotic. عملنا يوسع توظيف جيش التحرير الشعبى الصينى من الخلايا البشرية إلى الخميرة(Saccharomyces cerevisiae)والبكتيريا (الإشريكيةالقولونية) ، مما يجعل أداة هامة لرصد ديناميات جمعيات البروتين شكلت بشكل عابر في كل من الخلايا البروكاريوتيكية وeukaryotic.

Introduction

كمية هائلة من المعلومات الجينية لا تزال غير قابلة للتفسير بسبب فهمنا غير الكامل للinteractomes الخلوية. إن منهجيات الكشف عن التفاعل التقليدي بين البروتين والبروتين، مثل الهطول المناعي المشترك للبروتين مع/بدون الربط بين المواد الكيميائية وتوطين البروتين المشترك، على الرغم من استخدامه على نطاق واسع، تشكل مجموعة من العيوب. وتشمل بعض المساوئ الرئيسية ضعف التحديد الكمي للتفاعلات وإمكانية إدخال أحداث ملزمة غير أصلية. وبالمقارنة، توفر التقنيات الناشئة القائمة على القرب نهجاً بديلاً وقوياً لالتقاط تفاعلات البروتين في الخلايا. اختبار الربط القرب (جيش التحرير الشعبى الصينى)1، والمتاحة الآن كمجموعة الملكية ، ويستخدم الأجسام المضادة لاستهداف على وجه التحديد مجمعات البروتين على أساس القرب من الوحدات الفرعية المتفاعلة.

بدأ جيش التحرير الشعبى الصينى من خلال تشكيل سقالة تتكون من الأجسام المضادة الأولية والثانوية مع علامات الحمض النووي الصغيرة (تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى) على سطح مجمع البروتين المستهدف (الشكل 1، الخطوات 1-3). بعد ذلك، التي يحددها القرب من علامات الحمض النووي، يتم إنشاء جزيء الحمض النوويالدائري عن طريق التهجين مع موصل oligonucleotides (الشكل 1، الخطوة 4). يتم الانتهاء من تشكيل الحمض النووي الدائري عن طريق خطوة ربط الحمض النووي. القطعة الدائرية التي تم تشكيلها حديثا من الحمض النووي بمثابة قالب لتضخيم دائرة المتداول اللاحقة (RCA) القائم على تفاعل سلسلة بوليميراز (PCR) تستعد من قبل واحدة من العلامات oligonucleotide المترافقة. وهذا يولد جزيء الحمض النووي المقعر الذي تقطعت به السبل واحد تعلقعلى مجمع البروتين عن طريق سقالة الأجسام المضادة (الشكل 1، الخطوة 6). يتم تصور جزيء الحمض النووي المتسلسل باستخدام oligonucleotides المسمى بشكل فلورسنت التي تهجينإلى تسلسل فريد ة متعددة متناثرة عبر الحمض النووي تضخيم (الشكل 1، الخطوة 7)2. تتوافق إشارة PLA التي تم إنشاؤها، والتي تظهر كنقطة فلورسنت (الشكل1، الخطوة 7)، مع موقع مجمع البروتين المستهدف في الخلية. ونتيجة لذلك، يمكن للتحليل الكشف عن مجمعات البروتين بدقة مكانية عالية. هذه التقنية لا تقتصر على مجرد التقاط تفاعلات البروتين، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم للكشف عن جزيئات واحدة أو تعديلات البروتين على البروتينات ذات الحساسية العالية1،2.

Hsp70 يشكل نظام مرافق ة متعدد الاستخدامات للغاية مهم بشكل أساسي للحفاظ على التوازن البروتين الخلوي من خلال المشاركة في مجموعة من التدبير المنزلي والوظائف المرتبطة بالإجهاد. وتشمل أنشطة التدبير المنزلي لنظام مرافقة Hsp70 دي نوفو طي البروتين، ونقل البروتين عبر الأغشية الخلوية، وتجميع وتفكيك مجمعات البروتين، وتنظيم نشاط البروتين وربط مختلف البروتين للطي / آلات مراقبةالجودة 3. نفس نظام الchaperone أيضا refolds misfolded /unfolded البروتينات، ويمنع تجميع البروتين، ويعزز تصنيف البروتين ويتعاون مع البروتياز الخلوية لتحلل البروتينات التي لا نهاية لها مطوية / التالفة لتسهيل إصلاح الخلوية بعد بروتيوسالاجهاد4,5. ولتحقيق هذا التنوع الوظيفي، يعتمد مرافق Hsp70 على الشراكة المشتركة بين الشركاء في عائلة JDP وعوامل التبادل النيوكليوتيد (NEFs) التي تقوم بصقل التحكم في اللوستريك المعتمد على ATP 70 من ربط الركيزة والإصدار3، 6. وعلاوة على ذلك، فإن المشاركين في مرافقة JDP تلعب دورا حيويا في اختيار ركائز لهذا النظام مرافقة تنوعا. وينقسم أفراد هذه الأسرة إلى ثلاث فئات (A و B و C) على أساس الهولوجية الهيكلية الخاصة بهم إلى النموذج الأولي JDP، E. coli DnaJ. الفئة A JDPs تحتوي على N-محطة J-المجال، الذي يتفاعل مع Hsp70، وهي منطقة غنية بالجلايسين فينيلألانين، وهي منطقة ملزمة الركيزة تتكون من منطقة تشبه أصابع الزنك (ZFLR) واثنين من المجالات بيتا برميل، ومجال ديميريسي محطة C. JDPs مع N-محطة J-المجال ومنطقة غنية بالجلايسين فينيلألانين، ولكن تفتقر إلى ZFLR، تقع في الفئة B. وبصفة عامة، يشارك أفراد هاتين الفئتين في مهام مرافقة. الأعضاء الذين يندرجون تحت الفئة C، والتي تحتوي على JDPs التي تشترك فقط في J-المجال4، تجنيد Hsp70s لأداء مجموعة متنوعة من وظائف غير مرافقة. وينعكس الدور الهام للJDPs كـ "محولات" قابلة للتبديل في نظام Hsp70 من خلال توسع أفراد الأسرة أثناء التطور. على سبيل المثال، البشر لديهم أكثر من 42 أعضاء JDP متميزة4. هذه JDPs تعمل كمونومرات، homodimers و / أو homo/hetero oligomers4،5. في الآونة الأخيرة، تعاون وظيفي عن طريق تشكيل معقدة عابرة بين الفئة ألف (على سبيل المثال، H. sapiens DNAJA2؛ S. cerevisiae Ydj1) والفئة B (على سبيل المثال، H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) تم الإبلاغ عن JDPs eukaryotic لتعزيز الاعتراف الفعال لمجاميع البروتين غير متبلور في المختبر7،8. هذه المجمعات JDP فئة مختلطة يفترض تجميع على سطح البروتينات المجمعة لتسهيل تشكيل Hsp70- و Hsp70 + Hsp100 القائم على البروتين disaggregases7،8،9، 10.تم توفير الأدلة الحاسمة لدعم وجود هذه المجمعات من فئة مختلطة شكلت عابرة JDP في الخلايا eukaryotic مع جيش التحرير الشعبى الصينى8.

ويستخدم جيش التحرير الشعبي بشكل متزايد لتقييم تفاعلات البروتين في ميتازوا، في المقام الأول في خلايا الثدييات. هنا، نبلغ عن التوسع الناجح لهذه التقنية لرصد المجمعات مرافقة شكلت عابرة في الكائنات أحادية الخلية eukaryotic وprokaryotic مثل الخميرة الناشئة S. سيريفيسياي والبكتيريا E. القولونية. والأهم من ذلك، يسلط هذا التوسع الضوء على الاستخدام المحتمل لجيش التحرير الشعبي في الكشف عن الميكروبات التي تصيب الخلايا البشرية والحيوانية وتحليلها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد خلية هيلا

  1. إعداد المواد التالية: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 m Na2HPO4,1.8 m KH2PO4),pH 7.4; DMEM، تستكمل مع 10٪ FCS و 1٪ القلم العقدية؛ 4% بارافورمالدهايد في PBS; 0.5% تريتون-X100 في PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0.05% Tween), pH 7.4; 0.0001٪ معقمة بولي-L-يسين الحل؛ 10 جيدا الشرائح التشخيصية؛ غرفة رطبة ، و المناديل الورقية. وكوبلين الشريحة تلطيخ الجرار.
    ملاحظة: لضمان كفاءة التثبيت الأمثل، يجب إعداد حلول البارافورمالدهايد طازجة قبل كل تجربة.
  2. إعداد غرفة رطبة من خلال تغطية الجزء السفلي من مربع مغلق مع الأنسجة الرطبة. ضع الغرفة الرطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية قبل بدء التجربة، لضمان أن درجة حرارة الغرفة عند 37 درجة مئوية أثناء احتضان التفاعلات الأنزيمية.
  3. خلايا هيلا الثقافة في قوارير T25، في 5 مل من DMEM (ارتفاع الجلوكوز، الجلوتامات والصوديوم بيروفات تستكمل) تستكمل مع 10٪ FCS و 1٪ القلم العقدية، في حاضنة CO2 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2. فصل الخلايا الملتصقة باستخدام 0.05٪ تريبسين-إدتا. بعد إضافة DMEM جديدة إلى الخلايا المنفصلة، عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا وتنمو على الشرائح التشخيصية داخل غرفة رطبة.
  4. تعقيم الشرائح التشخيصية عن طريق الأشعة فوق البنفسجية التشعيع في غطاء السيارة ثقافة الخلية المعقمة لمدة 30 دقيقة.
  5. إضافة 100 درجة مئوية من معقمة تصفية 0.0001٪ بولي-L-يسين إلى كل جيدا المطلوبة للتجربة. الحضانة لمدة 30 دقيقة.
  6. جرب خلايا HeLa وإضافة ما يقرب من 15،000 خلية إلى كل بئر. إذا لزم الأمر، تمييع الخلايا إلى ما لا يقل عن 30-50 درجة مئوية من DMEM لكل بئر.
  7. تنمو الخلايا في غرفة رطبة داخل حاضنة CO2 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة تقريبا.
    ملاحظة: عالية جدا ً من الإنقواب يقلل من امتصاص الكواشف ، مما يقلل من الإشارة التي تم الحصول عليها في نهاية البروتوكول.
  8. إزالة المتوسطة عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. غسل الآبار 3X مع 50 درجة مئوية من PBS.
    ملاحظة: تخضع الخلايا للفصل عند إضافة السوائل بقسوة. ويمكن منع ذلك عن طريق عدم السماح للآبار الجافة تماما قبل إضافة سائل جديد وعن طريق إضافة السائل الجديد بلطف إلى حافة البئر.
  9. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 درجة مئوية من البارافورماليدات 4٪ أعدت حديثا في PBS إلى كل بئر. الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  10. غسل الشرائح 3X في PBS. قم بإجراء عمليات غسل في جرة تلطيخ الشرائح التي تحتوي على 100 مل من PBS. لكل غسل، وحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون هز.
  11. Permeabilize غشاء الخلية عن طريق غمر الشرائح في 100 مل من 0.5٪ تريتون-X100 في PBS في جرة كوبلين الشريحة تلطيخ. الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون هز.
  12. غسل الشرائح 3X في TBS-T. قم بإجراء عمليات غسل في جرة تلطيخ الشرائح التي تحتوي على 100 مل من TBS-T. لكل غسل، وحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون هز.
  13. بعد الغسيل الأخير، قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد باستخدام ورق الأنسجة. عند هذه النقطة الخلايا جاهزة لبروتوكول "إجراء عملية ربط القرب" التي سيتم مناقشتها في القسم 4.

2. S. سيريفيسياي إعداد الخلية

  1. إعداد المواد التالية: 100 mM KPO4,pH 6.5, يشار إليها باسم غسل العازلة; 37% الفورمالديهايد; 4٪ بارافورمالدهايد في 100mM KPO 4، والحموضة 6.5؛ 1.2 M السوربيتول في 100M KPO 4، والحموضة 6.5؛ محلول الليسيكيس (500 ميكروغرام/مل ليتيك، 20 ملي متر بيتا-ميركابتوإيثانول، 100 مم ك بو4،درجة الحموضة 6.5)؛ 0.0001٪ بولي-L-يسين الحل؛ 1٪ تريتون-X100 في 100mM KPO 4، درجة الحموضة 6.5؛ 10 جيدا الشرائح التشخيصية؛ غرفة رطبة (أعدت كما هو الحال في الخطوة 1.2)؛ المناديل الورقية. وكوبلين الشريحة تلطيخ الجرار.
    ملاحظة: لضمان كفاءة التثبيت الأمثل، يجب إعداد حلول البارافورمالدهايد طازجة قبل كل تجربة.
  2. تنمو ثقافة بين عشية وضحاها في استخراج الخميرة غير انتقائية، Peptone وسكر العنب (YPD) المتوسطة في 30 درجة مئوية في حين تهتز.
    ملاحظة: اعتمادا على المتطلبات التجريبية S. cerevisiae الخلايا يمكن زراعتها في الاصطناعية كاملة (SC) المتوسطة أو انتقائية الاصطناعية الحد الأدنى (SM) المتوسطة بدلا من ذلك.
  3. تمييع الثقافة الثابتة إلىOD 600 من 0.1 في وسط 20 مل. تنمو الخلايا في 30 درجة مئوية في حين تهتز حتى OD600 تصل إلى 0.5.
  4. نقل ثقافة 20 مل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 665 × ز لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في 5 مل من المتوسطة الطازجة.
  5. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 550 درجة مئوية من الفورمالديهايد 37٪ إلى الثقافة. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  6. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 665 × ز لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من إعداد هابافورمهايد 4٪ طازجة في الغسيل العازلة. الحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. أثناء الحضانة، وإعداد الشرائح التشخيص عن طريق إضافة 100 درجة مئوية من 0.01٪ بولي-L-يسين الحل لكل بئر. احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. بعد 30 دقيقة، اغسلي اللايسين الزائد بماء فائق النقاء ودعي الشرائح تجف. الشرائح الجافة جاهزة للاستخدام.
  9. غسل الخلايا مرتين مع 1 مل من الغسيل العازلة. قم بإجراء عمليات غسل بواسطة الطرد المركزي للخلايا عند 665 × ز لمدة 3 دقائق.
  10. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 665 × ز لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من 1.2 M السوربيتول في الغسيل العازلة.
  11. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 665 × ز لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق بيليه في 250 درجة مئوية من محلول Lyticase أعدت حديثا لهضم جدار الخلية. احتضان الخلايا في محلول Lyticase لمدة 15 دقيقة في 30 درجة مئوية في حين يهز.
  12. بعد الهضم، يغسل الخلايا 3x بواسطة الطرد المركزي في 665 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant. إعادة تعليق الخلايا في 250 درجة مئوية من السوربيتول 1.2 M في الغسيل العازلة.
    ملاحظة: لأن الخلايا هشة بعد هضم جدار الخلية، وإعادة تعليقها بعناية فائقة لعدم تلف الخلايا.
  13. إضافة 20 درجة مئوية من الخلايا المعاد تعليقها إلى الشرائح المغلفة بولي-L-يسين. السماح لهم بإرفاق إلى الشرائح لمدة 30 دقيقة.
  14. Permeabilize غشاء الخلية عن طريق غسل 3X مع 50 درجة مئوية من 1٪ تريتون-X في الغسيل العازلة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة الخلايا جاهزة لبروتوكول تصنيف الربط القرب التي سيتم مناقشتها في القسم 4.

3. E. القولونية إعداد الخلية

  1. إعداد المواد التالية: PBS-T (140 mM NaCl, 2 m M KCl, 8 m K2HPO4,1.5 m KH2PO4,0.05% Tween-20), pH 7.4; محلول ليسوزيم (2 ملغ / مل ليسوزيم، 25 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 50 مل الجلوكوز، 10 MM EDTA)؛ 0.0001٪ بولي-L-يسين الحل؛ 99% الميثانول البارد على الجليد; 99٪ غرفة درجة الحرارة الميثانول؛ 99% أسيتون; 10 جيدا الشرائح التشخيصية؛ غرفة رطبة (أعدت كما هو الحال في الخطوة 1-1-1)؛ المناديل الورقية. وكوبلين الشريحة تلطيخ الجرار.
  2. تنمو ثقافة بين عشية وضحاها في لوريا-بيرتاني (LB) المتوسطة في 30 درجة مئوية في حين تهتز.
  3. تمييع الثقافة الثابتة إلىOD 600 من 0.02 في وسط LB الطازجة. تنمو الخلايا في 30 درجة مئوية في حين تهتز حتى OD600 يصل إلى 0.4 لخلايا مرحلة السجل.
  4. ما يقرب من 15 دقيقة قبل أن تصل الخلايا إلى OD600 من 0.4، وإعداد بولي-L-يسين المغلفة الشرائح عن طريق إضافة 100 درجة مئوية من 0.0001٪ بولي-L-يسين إلى كل بئر. احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. بعد 30 دقيقة يغسل الزائدة بولي-L-يسين بالماء النقي جدا والسماح للشرائح الهواء الجاف. الشرائح الجافة جاهزة للاستخدام.
  6. عندما تصل الخلايا إلى OD600 من 0.4، نقل 1 مل من الثقافة إلى أنبوب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المعقمة وخلايا بيليه في 2650 × ز لمدة 2 دقيقة.
  7. إعادة تعليق الخلايا في 50 درجة مئوية من LB المتوسطة.
  8. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من الجليد البارد 99٪ الميثانول. يُخلط المزيج برفق بالغين باليد. حضانة الخلايا لمدة 30 دقيقة عند -20 درجة مئوية.
  9. بعد التثبيت إضافة 20 درجة مئوية من الخلايا إلى الشرائح المغلفة بولي-L-يسين. دع الشرائح تجف لمدة 30 دقيقة.
  10. إضافة 50 درجة مئوية من محلول lysozyme أعدت حديثا لكل بئر لهضم جدار الخلية. حضانة في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة في 25 درجة مئوية.
  11. إزالة محلول lysozyme من الآبار عن طريق إضافة ورقة الأنسجة إلى حافة البئر. غسل الشرائح 3X في 100 مل من PBS-T. قم بإجراء كل غسل في جرة تلطيخ الشرائح كوبلين لمدة 30 ق، دون اهتزاز.
  12. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل من الشرائح بالنقر فوق الشرائح على ورق الأنسجة.
  13. نفاذيبيليز أغشية الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الميثانول 99٪ إلى كل بئر. الحضانة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  14. إزالة الميثانول عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر.
  15. إضافة 50 درجة مئوية من الأسيتون 99٪ إلى كل بئر. الحضانة لمدة دقيقة واحدة.
  16. إزالة الأسيتون الزائد عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. السماح للشرائح بالهواء الجاف. عند هذه النقطة الخلايا جاهزة لبروتوكول تصنيف الربط القرب التي سيتم مناقشتها في القسم 4.

4. القرب الربط التبيّن

  1. إعداد المواد التالية: حظر المخزن المؤقت; الأجسام المضادة تخفيف العازلة; غسل العازلة 'A' – (10 MM تريس, 150 MM حمض الكل، 0.05٪ توين-20) درجة الحموضة 7.4؛ غسل العازلة 'B' – (200 MM تريس, 100 مل NaCl) الحموضة 7.4; المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية زائد; الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس ناقص; 5X الربط العازلة؛ ligase ، وعندما كان هناك الكثير من ال 5X تضخيم العازلة (البرتقالي: 554 نانومتر السابقين؛م 576 نانومتر)؛ البلمرة. المياه فائقة النقاء. والتركيب المتوسط الذي يحتوي على DAPI.
    ملاحظة: الكواشف الكشف جيش التحرير الشعبي متاحة أيضا في المتغيرات الخضراء (495 نانومتر السابقين؛em 527 نانومتر)، الأحمر (594 نانومترالسابق؛ em 624 نانومتر)، FarRed (644 نانومترالسابق؛ م 669 نانومتر) أو برايتفيلد (peroxidase الفجل (HRP) مترافق).
  2. حظر الخلايا عن طريق إضافة قطرة من حظر المخزن المؤقت إلى كل بئر. حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
  3. إعداد حلول الأجسام المضادة عن طريق تخفيف الأجسام المضادة للمخزون في الجسم المضاد تخفيف العازلة. لكل بئر 40 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة مطلوب.
  4. إزالة حظر العازلة عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. إضافة 40 درجة مئوية من الأجسام المضادة المخففة في الجسم المضاد تخفيف العازلة إلى كل بئر. حضانة لمدة 60 دقيقة في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  5. إزالة محلول الأجسام المضادة من الآبار عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. غسل الشرائح 2X في 100 مل من غسل العازلة 'A' في كوبلين الشريحة تلطيخ جرة لمدة 5 دقائق، دون هز.
  6. خلال خطوات الغسيل، تمييع 5X تحقيقات الأجسام المضادة الثانوية، المضادة للأرنب زائد ومكافحة الماوس MINUS (خصوصية الأنواع من تحقيقات يعتمد على الأجسام المضادة الأولية المستخدمة)، في الأجسام المضادة تخفيف العازلة. إعداد 40 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة في بئر.
  7. إضافة 40 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر. حضانة لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
  8. إزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية من الآبار عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. غسل الشرائح 2X في 100 مل من غسل العازلة 'A' في كوبلين الشريحة تلطيخ جرة لمدة 5 دقائق، دون هز.
  9. أثناء الإذاهية يعدّ 40 [فل] من ربط خليط لكلّ بئر, ب يمزج 8 [فل] من [5إكس] ربط احتياطيّة, 31 [فل] من ماء [أولتربور] و1 [فل] من [ليغس].
  10. إضافة 40 درجة مئوية من خليط الربط إلى كل بئر. حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
  11. إزالة خليط الربط من الآبار عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. غسل الشرائح 2X في 100 مل من غسل العازلة 'A' في كوبلين الشريحة تلطيخ جرة لمدة 2 دقيقة، دون هز.
  12. أثناء الإذاهية إعداد 40 ميكرولتر من خليط التضخيم في البئر، عن طريق خلط 8 ميكرولتر من محلول تضخيم 5X، 31.5 ميكرولتر من الماء النقي جدا، و 0.5 ميكرولتر من البلمرة.
    ملاحظة: التضخيم 5X يحتوي على تحقيقات الفلورسنت. حماية هذا الخليط من الضوء. أيضاً، حماية الشرائح من الضوء أثناء كل من الخطوات التالية. إذا كنت تستخدم الجرار الشفافة كوبلين الشريحة تلطيخ وغرف الرطبة، التفاف لهم في رقائق الألومنيوم.
  13. إضافة 40 درجة مئوية من خليط التضخيم لكل بئر. حضانة لمدة 100 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
  14. إزالة خليط التضخيم من الآبار. غسل الشرائح 2X في 100 مل من غسل العازلة 'B' في كوبلين الشريحة تلطيخ جرة لمدة 10 دقيقة دون هز.
  15. غسل الشرائح في 100 مل من غسل العازلة 'B' المخفف 1:100 في المياه النقية في جرة كوبلين الشريحة تلطيخ لمدة 30 s.
  16. إضافة 20 درجة مئوية من DAPI تحتوي على متوسط تصاعد لكل بئر إلى الشرائح. أغلق الشرائح مع غطاء وشرائح الختم مع طلاء الأظافر.
  17. في حالة التصوير، قم باحتضان DAPI على الفور الذي يحتوي على وسط التركيب لمدة 10-15 دقيقة، مع الحماية من الضوء. إذا لم يكن الأمر كذلك، قم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد، محمية من الضوء.

5. الكشف

  1. استخدام الفحص المجهري البؤري للحصول على صور من خلايا HeLa وS. cerevisiae وE. coli مع 20x/0.8 NA و 63x/1.4 NA و 100x/1.4 NA خطة أهداف Apochromat، على التوالي. تثير DAPI ملطخة بالحمض النووي مع ليزر صمام ثنائي نابض 405 نانومتر. للإشارة جيش التحرير الشعبي (لهذه الدراسة) تثير مع ليزر 561 نانومتر الحالة الصلبة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كشفت دراساتنا السابقة في المختبر باستخدام البروتينات النقية أن مجموعة فرعية من الفئة البشرية A والفئة B JDPs تشكل مجمعات مختلطة عابرة من فئة JDP لاستهداف مجموعة واسعة من البروتينات المجمعة بكفاءة وربما تسهيل تجميع Hsp70 القائم على البروتين التجمّع7. وظفنا جيش التحرير الشعبي لتحديد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد استخدمت النُهُج القائمة على التسيب المناعي المشترك والتوطين المشترك كأساليب طويلة الأمد لتوصيف تجميع البروتين. ويشكل الكشف عن مجمعات مرافقة محددة مشكلة بصورة عابرة تحديا رئيسيا بهذه الأساليب التقليدية، ونتيجة لذلك، فإن النتائج السابقة تقتصر إلى حد كبير على التفسيرات النوعية. غالبا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ويتلقى البرنامج دعما من منحة توظيف خاصة من كلية الطب في جامعة موناش للتمريض والعلوم الصحية بتمويل من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية. نشكر بيرند بوكو (ZMBH، جامعة هايدلبرغ، ألمانيا) وهارم ه. كامبينجا (قسم العلوم الطبية الحيوية للخلايا والنظم، جامعة خرونينغين، هولندا) على دعمهما ومشاركة الكواشف التي لا تقدر بثمن، هولغر لورنز (ZMBH) مرفق التصوير، جامعة هايدلبرغ، ألمانيا) لدعمه في الفحص المجهري البؤري ومعالجة الصور، وكلير هيرست (ARMI، جامعة موناش، أستراليا) للقراءة النقدية للمخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
37% FormaldehydeMerck103999
AcetoneSigma-Aldrich32201
anti-DNAJA2 antibodyAbcamab157216
anti-DNAJB1 AntibodyEnzo Life SciencesADI-SPA-450
anti-DnaK antibodyIn house
anti-mCherry antibodyAbcamab125096
anti-Sis1 AntibodyCosmo Bio CorpCOP-080051
anti-Ydj1 antibodyStressMarq Biosciences SMC-150,
anti-YFP antibodyIn house
Coplin slide-staining jarSigma-AldrichS5516
Diagnostic slidesMarienfeld1216530
DMEMThermo-Fischer31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents OrangeSigma-AldrichDUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPISigma-AldrichDUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUSSigma-AldrichDUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUSSigma-AldrichDUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, FluorescenceSigma-AldrichDUO82049
Fetal Calf SerumThermo-Fischer10082147
LysozymeSigma-Aldrich62971
MethanolSigma-Aldrich32213
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Penicillin/StreptomycinThermo-Fischer15070063
Poly-L-LysineSigma-AldrichP47-07
SorbitolSigma-AldrichS7547
Triton-X100Merck108643
TrypsinThermo-Fischer25300096
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Zymolase 100T / / LyticaseUnited States BiologicalZ1004

References

  1. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  2. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  3. Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
  4. Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
  5. Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  6. Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  7. Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
  8. Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
  9. Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
  10. Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
  11. Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
  12. Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
  13. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  14. Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
  15. Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
  16. Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
  17. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  18. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
  19. Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
  20. Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
  21. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  22. Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
  23. Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
  24. Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
  25. Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
  26. Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
  27. Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679(2015).
  28. Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
  29. Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
  30. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE151ChaperoneJHsp70ES

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved