A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
لقد كشفنا نظام microphysiological (MPS) مع الأمعاء والكبد organoids لاسيتامينوفين (APAP). توضح هذه المقالة طرق الإنتاج العضوي وتقييمات الملكية الدوائية والسمية APAP في MPS. كما يصف تحليل وظائف الأنسجة اللازمة للتحقق من صحة النتائج.
ومن المتوقع أن يكون أداء النظم الدقيقة الفيزيولوجية التي أدخلت مؤخراً التي تزرع العضيات البشرية أفضل من أداء الحيوانات في مرحلة الاختبارات قبل الفحصي لعملية تطوير المخدرات لأنها بشرية وراثياً وتختبأ التفاعل بين الأنسجة. في هذه الدراسة، تم دمج حاجز الأمعاء البشرية (التي تحاكيها ثقافة شارك في زراعة الخلايا كاكو-2 وHT-29) والكبد المكافئ (التي تحاكيها spheroids مصنوعة من خلايا هيباتج متمايزة وخلايا نجمية الكبدية البشرية) في جهاز microfluidic لرقاقة جهازين (2-OC) لتقييم بعض الأسيتامينوفين (APAP) الدوائية (PK) والخصائص السامة. وكان MPS ثلاث جمعيات: الأمعاء فقط 2-OC، الكبد فقط 2-OC، والأمعاء / الكبد 2-OC مع نفس وسائل الإعلام تضخ كلا organoids. بالنسبة لتقييمات PK، قمنا بسد APAP في وسائل الإعلام في نقاط زمنية محددة مسبقاً بعد إدارتها إما فوق الحاجز المعوي (محاكاة الطريق الفموي) أو في وسائل الإعلام (محاكاة الطريق الوريدي)، عند 12 ميكرومتر و2 ميكرومتر على التوالي. تم تحليل عينات الوسائط من خلال عكس مرحلة اللونية السائلة عالية الضغط (HPLC). تم تحليل العضيات من أجل التعبير الجيني، وقيم TEER، للتعبير عن البروتين والنشاط، ثم تم جمعها، وإصلاحها، وتقديمها إلى مجموعة من التقييمات المورفولوجية. كان أداء تقنية MTT جيدًا في تقييم الجدوى العضوية ، ولكن التحليلات عالية المحتوى (HCA) تمكنت من اكتشاف أحداث سامة مبكرة جدًا استجابة لعلاج APAP. لقد تحققنا من أن تدفق الوسائط لا يؤثر بشكل كبير على امتصاص APAP في حين أنه يحسن بشكل كبير وظائف الكبد المكافئة. ويمكن محاكاة امتصاص الأمعاء البشرية APAP والتمثيل الغذائي الكبدي في MPS. إن الارتباط بين بيانات MPS وفي نمّجة السيليكو لديه إمكانات كبيرة لتحسين قابلية التنبؤ بالأساليب المختبرية وتوفير دقة أفضل من النماذج الحيوانية في الدراسات الدوائية السمية.
ونظراً للاختلافات الجينية والبروتيومية، فإن النماذج الحيوانية لها قيمة تنبؤية محدودة بالنسبة لعدة نتائج بشرية. وعلاوة على ذلك، فهي تستغرق وقتا طويلا، ومكلفة ومشكوك فيها أخلاقيا1. MPS هي تقنية جديدة نسبيا تهدف إلى تحسين القدرة التنبؤية وتقليل التكاليف والوقت الذي يقضيه مع الاختبارات قبل السريرية. فهي الأجهزة microfluidic زراعة organoids (المحاكاة الاصطناعية وحدات وظيفية من الأجهزة) في ظل تدفق وسائل الإعلام التي تعزز الاتصالات organoid organoid. Organoids مصنوعة من الخلايا البشرية زيادة صلة الترجمة2،3،4. ومن المتوقع أن MPS لأداء أفضل من الاختبارات الحيوانية لأنها بشرية وراثيا وتكخيص التفاعل بين الأنسجة. عندما تعمل بكامل طاقتها، فإن MPS تقديم نتائج أكثر وضوحا، في سرعة أعلى وأقل التكاليف والمخاطر4. العديد من المجموعات النامية MPS لعدة أغراض, وخاصة نماذج المرض لاختبار فعالية المخدرات.
مستوى التعرض هو واحد من أهم المعلمات لتقييم فعالية الدواء وسميته5،6،7،8،9،10،11،12. MPS يسمح التكامل العضوي الذي يحاكي التعرض النظامي ومن المتوقع أن يكون أداؤه أفضل من ثقافة الأنسجة البشرية التقليدية 2D. هذه التكنولوجيا يمكن أن تحسن بشكل كبير التنبؤ بالمجمع امتصاص الأمعاء والكبد الأيض4.
و MPS دمج نموذج معادل الإنسان من الأمعاء والكبد هو نقطة انطلاق جيدة، معتبرا الدور المركزي لهذين الجهازين في التوافر البيولوجي للأدوية والتعرض الجهازي13,14,15. APAP هو دواء جذاب لدراسة MPS دون مكافئ الكلى لأن استقلابه يتم بشكل رئيسي من قبل الكبد16,17.
و2-OC هو جهاز microfluidic من غرفتين مناسبة لثقافة اثنين من الأنسجة البشرية المختلفة المكافئة / organoids مترابطة بواسطة microchannels16. من أجل محاكاة في المختبر البشري عن طريق الفم / الحقن الوريدي من المخدرات وتقييم آثار عبر الحديث بين الأمعاء والكبد مكافئات على المستحضرات الدوائية APAP، إلى جانب وظيفة organoids ومقومات البقاء، تم تنفيذ ثلاثة جمعيات MPS مختلفة: (1) "الأمعاء 2-OC MPS" تتألف من الأمعاء مكافئ يستند في إدراج ثقافة تحتوي على Caco-2 + HT-29 الخلايا coculture، دمجها في الجهاز 2-OC. (2) "الكبد 2-OC MPS" تتألف من spheroids الكبد مصنوعة من HepaRG + HHSteC (خلايا هيبيت الكبدية الإنسان) متكاملة في الجهاز 2-OC؛ و (3) "الأمعاء / الكبد 2-OC MPS" تتألف من ما يعادل الأمعاء في مقصورة جهاز واحد التواصل مع مكافئ الكبد في الآخر من خلال تدفق وسائل الإعلام من خلال القنوات microfluidic.
تم إجراء جميع المقايسات تحت ثابت (لا تدفق) وديناميكية (مع تدفق) الشروط بسبب تأثير المحفزات الميكانيكية (ضغط، وتمتد، والتشيد) على الخلية قابلية البقاء والوظائف18،19،20. هذه المادة يصف بروتوكول لAP البصرية عن طريق الفم / الحقن وتقليد الإدارة والامتصاص / الأيض والتحليلات السمية في 2 - OC MPS التي تحتوي على الأمعاء البشرية والكبد ما يعادل نماذج.
1. إنتاج مكافئات الأنسجة للزراعة في 2-OC
2. التكامل من الأمعاء والكبد مكافئات في 2-OC MPS
3. إعداد الأسيتامينوفين (APAP)
4- إدارة المواد الاختبارية وأخذ عينات من وسائط الإعلام
5. الأجهزة والظروف الكروماتوغرافية
6. الأنسجة مكافئات البقاء / وظائف
لإجراء اختبارات PK APAP في 2-OC MPS، فإن الخطوة الأولى هي تصنيع الأمعاء البشرية والكبد مكافئات (organoids). وهي مدمجة في جهاز microfluidic 2-OC(الشكل 1A)24 ساعة قبل البدء في اختبار PK APAP. في اليوم التالي، يتم تغيير الوسيط، ويتم عرض النموذج إلى APAP. يوضح الشكل 1 مكافئات الأمعاء والكب?...
إن التقييم الدقيق والموثوق للخصائص الدوائية للأدوية الجديدة التحقيقية أمر بالغ الأهمية للحد من المخاطر في خطوات التطوير التالية. MPS هي تقنية جديدة نسبيا ، التي تهدف إلى تحسين القدرة التنبؤية وتقليل التكاليف والوقت الذي يقضيه مع الاختبارات قبل الإكلينيكية. وتتقدم مجموعتنا في تقييم الخصا?...
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
نشكر الدكتور كريستي غوجين- غيلوزو، والدكتور فيليب جريبون في الوحدة 522 INSERM، والدكتور كريستيان تريبو في الوحدة 271 INSERM لاستخدام المواد البيولوجية (خلايا هيبا RG) وإتاحتها لنا من أجل إجراء البحث الأكاديمي.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
Cacodylate buffer | |||
Cell culture flasks | Sarstedt | ||
Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
Cryostat | Leica | CM1950 | |
DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
Ethanol | Synth | ||
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
Hematoxylin & Eosin | |||
HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
Human Insulin | Invitrogen - Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
Isopropanol | Merck | 278475 | |
Karnovsky’s fixative | |||
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
Microscope | Leica | DMi4000 | |
Microtome | Leica | RM2245 | |
Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
MX3000P system | Agilent Technologies | ||
Neubauer chamber | Counting cells | ||
Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
Primers | RT-qPCR | ||
PVDF membrane | BioRad | ||
PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
Vectashield plus DAPI mounting media | |||
White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
Wide-bore tips | |||
Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved