JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لقد كشفنا نظام microphysiological (MPS) مع الأمعاء والكبد organoids لاسيتامينوفين (APAP). توضح هذه المقالة طرق الإنتاج العضوي وتقييمات الملكية الدوائية والسمية APAP في MPS. كما يصف تحليل وظائف الأنسجة اللازمة للتحقق من صحة النتائج.

Abstract

ومن المتوقع أن يكون أداء النظم الدقيقة الفيزيولوجية التي أدخلت مؤخراً التي تزرع العضيات البشرية أفضل من أداء الحيوانات في مرحلة الاختبارات قبل الفحصي لعملية تطوير المخدرات لأنها بشرية وراثياً وتختبأ التفاعل بين الأنسجة. في هذه الدراسة، تم دمج حاجز الأمعاء البشرية (التي تحاكيها ثقافة شارك في زراعة الخلايا كاكو-2 وHT-29) والكبد المكافئ (التي تحاكيها spheroids مصنوعة من خلايا هيباتج متمايزة وخلايا نجمية الكبدية البشرية) في جهاز microfluidic لرقاقة جهازين (2-OC) لتقييم بعض الأسيتامينوفين (APAP) الدوائية (PK) والخصائص السامة. وكان MPS ثلاث جمعيات: الأمعاء فقط 2-OC، الكبد فقط 2-OC، والأمعاء / الكبد 2-OC مع نفس وسائل الإعلام تضخ كلا organoids. بالنسبة لتقييمات PK، قمنا بسد APAP في وسائل الإعلام في نقاط زمنية محددة مسبقاً بعد إدارتها إما فوق الحاجز المعوي (محاكاة الطريق الفموي) أو في وسائل الإعلام (محاكاة الطريق الوريدي)، عند 12 ميكرومتر و2 ميكرومتر على التوالي. تم تحليل عينات الوسائط من خلال عكس مرحلة اللونية السائلة عالية الضغط (HPLC). تم تحليل العضيات من أجل التعبير الجيني، وقيم TEER، للتعبير عن البروتين والنشاط، ثم تم جمعها، وإصلاحها، وتقديمها إلى مجموعة من التقييمات المورفولوجية. كان أداء تقنية MTT جيدًا في تقييم الجدوى العضوية ، ولكن التحليلات عالية المحتوى (HCA) تمكنت من اكتشاف أحداث سامة مبكرة جدًا استجابة لعلاج APAP. لقد تحققنا من أن تدفق الوسائط لا يؤثر بشكل كبير على امتصاص APAP في حين أنه يحسن بشكل كبير وظائف الكبد المكافئة. ويمكن محاكاة امتصاص الأمعاء البشرية APAP والتمثيل الغذائي الكبدي في MPS. إن الارتباط بين بيانات MPS وفي نمّجة السيليكو لديه إمكانات كبيرة لتحسين قابلية التنبؤ بالأساليب المختبرية وتوفير دقة أفضل من النماذج الحيوانية في الدراسات الدوائية السمية.

Introduction

ونظراً للاختلافات الجينية والبروتيومية، فإن النماذج الحيوانية لها قيمة تنبؤية محدودة بالنسبة لعدة نتائج بشرية. وعلاوة على ذلك، فهي تستغرق وقتا طويلا، ومكلفة ومشكوك فيها أخلاقيا1. MPS هي تقنية جديدة نسبيا تهدف إلى تحسين القدرة التنبؤية وتقليل التكاليف والوقت الذي يقضيه مع الاختبارات قبل السريرية. فهي الأجهزة microfluidic زراعة organoids (المحاكاة الاصطناعية وحدات وظيفية من الأجهزة) في ظل تدفق وسائل الإعلام التي تعزز الاتصالات organoid organoid. Organoids مصنوعة من الخلايا البشرية زيادة صلة الترجمة2،3،4. ومن المتوقع أن MPS لأداء أفضل من الاختبارات الحيوانية لأنها بشرية وراثيا وتكخيص التفاعل بين الأنسجة. عندما تعمل بكامل طاقتها، فإن MPS تقديم نتائج أكثر وضوحا، في سرعة أعلى وأقل التكاليف والمخاطر4. العديد من المجموعات النامية MPS لعدة أغراض, وخاصة نماذج المرض لاختبار فعالية المخدرات.

مستوى التعرض هو واحد من أهم المعلمات لتقييم فعالية الدواء وسميته5،6،7،8،9،10،11،12. MPS يسمح التكامل العضوي الذي يحاكي التعرض النظامي ومن المتوقع أن يكون أداؤه أفضل من ثقافة الأنسجة البشرية التقليدية 2D. هذه التكنولوجيا يمكن أن تحسن بشكل كبير التنبؤ بالمجمع امتصاص الأمعاء والكبد الأيض4.

و MPS دمج نموذج معادل الإنسان من الأمعاء والكبد هو نقطة انطلاق جيدة، معتبرا الدور المركزي لهذين الجهازين في التوافر البيولوجي للأدوية والتعرض الجهازي13,14,15. APAP هو دواء جذاب لدراسة MPS دون مكافئ الكلى لأن استقلابه يتم بشكل رئيسي من قبل الكبد16,17.

و2-OC هو جهاز microfluidic من غرفتين مناسبة لثقافة اثنين من الأنسجة البشرية المختلفة المكافئة / organoids مترابطة بواسطة microchannels16. من أجل محاكاة في المختبر البشري عن طريق الفم / الحقن الوريدي من المخدرات وتقييم آثار عبر الحديث بين الأمعاء والكبد مكافئات على المستحضرات الدوائية APAP، إلى جانب وظيفة organoids ومقومات البقاء، تم تنفيذ ثلاثة جمعيات MPS مختلفة: (1) "الأمعاء 2-OC MPS" تتألف من الأمعاء مكافئ يستند في إدراج ثقافة تحتوي على Caco-2 + HT-29 الخلايا coculture، دمجها في الجهاز 2-OC. (2) "الكبد 2-OC MPS" تتألف من spheroids الكبد مصنوعة من HepaRG + HHSteC (خلايا هيبيت الكبدية الإنسان) متكاملة في الجهاز 2-OC؛ و (3) "الأمعاء / الكبد 2-OC MPS" تتألف من ما يعادل الأمعاء في مقصورة جهاز واحد التواصل مع مكافئ الكبد في الآخر من خلال تدفق وسائل الإعلام من خلال القنوات microfluidic.

تم إجراء جميع المقايسات تحت ثابت (لا تدفق) وديناميكية (مع تدفق) الشروط بسبب تأثير المحفزات الميكانيكية (ضغط، وتمتد، والتشيد) على الخلية قابلية البقاء والوظائف18،19،20. هذه المادة يصف بروتوكول لAP البصرية عن طريق الفم / الحقن وتقليد الإدارة والامتصاص / الأيض والتحليلات السمية في 2 - OC MPS التي تحتوي على الأمعاء البشرية والكبد ما يعادل نماذج.

Protocol

1. إنتاج مكافئات الأنسجة للزراعة في 2-OC

  1. إنتاج مكافئ حاجز الأمعاء الدقيقة
    1. الحفاظ على خلايا Caco-2 وHT-29 باستخدام الأمعاء ما يعادل المتوسطة: DMEM تكمل مع 10٪ FBS، 1٪ البنسلين وstreptomycin، و 1٪ غير الضرورية الأحماض الأمينية، والتي سميت باسم "DMEM S" في هذه المخطوطة.
    2. إزالة المتوسطة، وغسل مرتين مع 1X DPBS وإضافة 8 مل من 0.25٪ تريبسين / EDTA لتفكك كاكو-2 الخلايا التي تزرع في قارورة ثقافة الخلية (175 سم2). احتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية ووقف رد الفعل عن طريق إضافة على الأقل حجم مزدوج من مثبطات التربسين. تنفيذ نفس الإجراء لخلايا HT-29، وضبط وحدات التخزين الكاشف منذ حاجة إلى كمية أصغر من هذه الخلايا ويتم الاحتفاظ بها في قارورة أصغر (75 سم2).
    3. الطرد المركزي في 250 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة افرنح من كلا الأنابيب، وإعادة تثبيت كريات الخلية في 10 مل من خلايا العد DMEM S. ، وضمان صلاحية الخلية أعلى من 80٪. تكامل Aseptically إدراج ثقافة الخلية في لوحة 24-well شغلها سابقا مع 400 ميكرولتر من DMEM S في بئر في الجانب القاعدي (الذي يمثل مجرى الدم البشري).
    4. شارك في زراعة كاكو-2 و HT-29 الخلايا بنسبة 9:121. استخدام 2.25 × 105 كاكو-2 و 2.5 × 104 HT-29 الخلايا إلى كل ما يعادل الأمعاء في حجم النهائي من 200 ميكرولتر من DMEM S. ضبط أرقام الخلايا وحجم وفقا لعدد المطلوب من organoids. مزيج بعناية.
    5. ماصة 200 μL من حل الخلية في كل جانب إدراج في نوع من نوعها (الذي يمثل الجانب التجويف المعوي الإنسان)، البذر 250،000 الخلايا لكل إدراج. شارك في زراعة الخلايا في إدراج لمدة ثلاثة أسابيع22. تغيير المتوسطة على الأقل ثلاث مرات في الأسبوع، الطامحة من الجانبين على حد سواء apical والبصلة مع ماصة باستور العقيمة، مع الحرص على عدم إلحاق الضرر حاجز الخلية سليمة.
      ملاحظة: المضي قدما في الطموح على الجانب apical، حتى لا تلمس حاجز الخلية (الpirateate بدعم ماصة باستور على حافة من البلاستيك من إدراج الخلية).
    6. تحقق من تشكيل أحادية ضيق من خلال قياس TEER (المقاومة الكهربائية عبر الثانية) كل ثلاثة أيام باستخدام فولتمتر23، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      1. تنفيذ فارغة، وقياس المقاومة عبر خلية ثقافة إدراج دون خلايا، ولكن مع نفس المتوسطة الخلية وعلى نفس لوحة الخلية.
      2. حساب مقاومة الأنسجة عن طريق طرح المقاومة فارغة من مقاومة مكافئ الأنسجة، وضرب من قبل مساحة السطح الفعالة للغشاء مرشح (0.6 سم2). A جيدة مقاومة حاجز الأمعاء في مجموعة من 150 إلى 400 Ω •سم2.
        ملاحظة: بعد 21 يوما يجب أن تكون الخلايا متمايزة تماما، وتشكل الحاجز المعوي، وبالتالي فإن مكافئات الأمعاء جاهزة لدمجها في MPS.
  2. الكبد يعادل الإنتاج
    1. الحفاظ على خلايا HepaRG باستخدام الوسط المكافئ للكبد، وهو متوسطة E وليام تستكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنينية، 2 M L-الجلوتامين، 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل ستربتوميسين، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين البشري و 5 × 10-5 M هيدروكورتيزون، و يدعى "وليامز E S" في هذه المخطوطة. تجديد وسائل الإعلام HepaRG كل 2-3 أيام والحفاظ على ثقافة الخلية لمدة أسبوعين لبدء التمايز في الكبد وcholangiocytes.
    2. بعد الأسبوعين الأولين، إضافة 2٪ DMSO إلى المتوسط HepaRG لمدة أسبوعين إضافية لإكمال تمايز الخلية24،25. Grow HHSTeC في وسائط الخلايا النجمية (SteC CM) ، باستخدام قارورة ثقافة الخلية المغلفة بـ Poly-L-lysine ، وتغيير الوسائط كل يومين أو ثلاثة أيام.
    3. إزالة المتوسطة، وغسل مرتين مع 1X DPBS وإضافة 8 مل من 0.05٪ تريبسين / EDTA، لتفكك خلايا HepaRG التي تزرع في قارورة ثقافة الخلية (175 سم2). احتضان لمدة 5 إلى 10 دقيقة في 37 درجة مئوية ووقف رد الفعل عن طريق إضافة ما لا يقل عن ضعف حجم مثبطات التربسين. أداء الشيء نفسه لHHSTeC، وتكييف حجم الكاشف منذ هناك حاجة إلى كمية أصغر من هذه الخلايا، ويمكن الحفاظ عليها في قارورة أصغر (75 سم2).
    4. الطرد المركزي على حد سواء في 250 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة فائقة وإعادة تعليق كريات الخلية في وليامز E S المتوسطة. عد الخلايا، وضمان صلاحية الخلية أعلى من 80٪.
    5. توليد spheroids الكبد الجمع بين خلايا HepaRG وHHSTeC بنسبة 24:1، على التوالي، في وليامز E S المتوسطة16. إضافة 4.8 × 104 هيبارج متمايزة و 0.2 × 104 HHSTeC لتكوين كل 50000 خلية الكبد، في حجم 80 μL. ضبط أرقام الخلايا وحجم وفقا لعدد المطلوب من spheroids. مزيج بعناية.
    6. باستخدام ماصة متعددة القنوات، الاستغناء 80 ميكرولتر من تجمع الخلايا مجتمعة في كل بئر من 384 الألواح الدقيقة spheroid، والتي لديها جولة هندسة قاع جيد.
      ملاحظة: بعد أربعة أيام، يتم تشكيل طاردات من حوالي 300 ميكرومتر.
    7. باستخدام نصائح واسعة تتحمل، نقل spheroids الكبد إلى فائقة منخفضة مرفق 6 لوحات جيدا، والذي يسمح المطلوبة "واحدا تلو الآخر" العد.

2. التكامل من الأمعاء والكبد مكافئات في 2-OC MPS

  1. الأمعاء 2-OC MPS الجمعية لامتصاص فحص
    1. ماصة 500 ميكرولتر من DMEM S في مقصورة أكبر من 2-OC و 300 ميكرولتر في أصغر واحد. pirate وسائل الإعلام البصين وapical من كل ما يعادل حاجز معوي في لوحات 24 جيدا. باستخدام ملقط معقمة، دمج إدراج واحد لكل 2-OC الدائرة، وتحديدا في المقصورة أكبر. تطبيق 200 μL من الأمعاء المتوسطة في الجانب apical.
      ملاحظة: تجنب تشكيل فقاعات عند دمج organoids في MPS.
    2. قم بتوصيل MPS بوحدة التحكم، والتي يجب أن تكون متصلة بإمدادات الهواء المضغوط. تعيين المعلمات: ضغط، تقريبا، ±300 شريط وتواتر ضخ 0.3 هرتز. بدء تدفق 24 ساعة قبل إدارة المادة اختبار. في اليوم التالي، قم بإجراء علاج APAP.
  2. الكبد 2-OC الجمعية MPS ل فحص التمثيل الغذائي
    1. Pipette 650 μL من وليامز E S في المقصورة الكبيرة و 350 ميكرولتر في المقصورة الأصغر ، والتي سوف تتلقى الزفيرويدات. في ال [ا-رت-6- لور], عدّ ال [سهيرويدسّسّيّرّسّيّر]. كل مكافئ الكبد يتكون من عشرين spheroids26. دمج 20 مكافئ الكبد لكل دائرة، وذلك باستخدام نصائح واسعة تتحمل، والذي يسمح لنقل organoids فقط، في المقصورة الأصغر من 2-OC.
    2. قم بتوصيل MPS بوحدة التحكم، والتي يجب أن تكون متصلة بإمدادات الهواء المضغوط. تعيين المعلمات: ضغط، تقريبا، ±300 شريط وتواتر ضخ 0.3 هرتز. بدء تدفق 24 ساعة قبل إدارة المادة اختبار. في اليوم التالي، قم بإجراء علاج APAP.
  3. الأمعاء / الكبد 2-OC الجمعية MPS لامتصاص والاستقلاب
    1. الجمع بين وسائل الإعلام اثنين (الأمعاء والكبد) في نسبة 1:4، وهو ما يعني 200 ميكرولتر من DMEM S في الجانب apical الأمعاء و 800 μL من وليامز E S في الجانب القاعدي. دمج الأمعاء والكبد مكافئات, في وقت واحد, في 2-OC.
    2. قم بتوصيل MPS بوحدة التحكم، والتي يجب أن تكون متصلة بإمدادات الهواء المضغوط. تعيين المعلمات: ضغط، تقريبا، ±300 شريط وتواتر ضخ 0.3 هرتز. بدء تدفق 24 ساعة قبل إدارة المادة اختبار. في اليوم التالي، قم بإجراء علاج APAP.
      ملاحظة: بالنسبة لجميع التجارب، قم بإجراء كل نقطة زمنية في ثلاث ية، مما يعني ثلاث دوائر منفصلة 2-OC (أي أجهزة 1/2 2-OC). الحجم الكلي لكل دائرة 2-OC هو 1 مل.

3. إعداد الأسيتامينوفين (APAP)

  1. إعداد حل الأسهم APAP، حل APAP في الإيثانول المطلق. في يوم التجربة، تمييع APAP في الوسط المعني (حل APAP)، إلى تركيز 12 ميكرومترًا لـ "الإدارة الفموية" و2 ميكرومتر لـ "الإدارة الوريدية".
  2. تأكد من أن التركيز النهائي من الإيثانول في التحكم في السيارة والحل العلاج هو 0.5٪ لكلا الإدارتين. للسيطرة الإيجابية (100 mM APAP)، وتركيز الإيثانول هو 2٪.

4- إدارة المواد الاختبارية وأخذ عينات من وسائط الإعلام

  1. APAP "عن طريق الفم" الإدارة وأخذ عينات وسائل الإعلام
    1. التعرق وسائل الإعلام القاعدي و apical من كل ما يعادل حاجز معوي في 2-OC. pipette 500 μL من المتوسط المناسب الثقافة في المقصورة الكبيرة في الجانب الباسطوي العضوي و 300 ميكرولتر في المقصورة الصغيرة.
    2. تحقق من وجود فقاعات والمضي قدما مع حاجز معوي العلاج المكافئ مع مادة اختبار في الجانب apical، محاكاة الإدارة عن طريق الفم. محاكاة APAP "عن طريق الفم" الإدارة بإضافة 200 ميكرولتر من 12 μM حل APAP على الجانب apical من إدراج ثقافة الأمعاء، والذي يمثل الأمعاء "الجانب التجويف"(الشكل 1B). قم بتوصيل MPS بوحدة التحكم.
    3. جمع الحجم الكلي من apical ومن الجوانب البصين في النقاط الزمنية التالية: 0 h, 5 دقيقة, 15 دقيقة, 30 دقيقة, 1 ساعة, 3 ح, 6 h, 12 h, و 24 h15,27. تنفيذ جميع التجارب في ثلاث ية، في ظروف ثابتة وديناميكية، وجمع كل عينة، من كل ثلاثية، في microtube منفصلة. تحليل العينات باستخدام HPLC / الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: عينات منفصلة من apical و basolateral.
  2. APAP "عن طريق الوريد" الإدارة وأخذ عينات وسائل الإعلام
    1. محاكاة "الوريد" الطريق عن طريق إدارة 2 μM حل APAP مباشرة في مقصورة الكبد. استلهم جميع المحتوى المتوسط 2-OC. Pipette 650 μL من وليامز E S التي تحتوي على مادة الاختبار في المقصورة الكبيرة و 350 ميكرولتر من نفس الوسائط في المقصورة الأصغر التي تحتوي على 20 spheroids. جمع جميع وحدات التخزين في النقاط الزمنية التالية: 0 ح، 30 دقيقة، 1 ح، 2 ح، 3 ح، 6 ح، 12 ح، و 24 ح27،28.
    2. إجراء جميع التجارب في ثلاث ية، في ظروف ثابتة وديناميكية. جمع كل عينة، من كل ثلاثية، في microtube منفصلة. تحليل العينات باستخدام HPLC / الأشعة فوق البنفسجية.

5. الأجهزة والظروف الكروماتوغرافية

  1. تحليل HPLC
    1. تعيين كافة المعلمات ذات الصلة لتحليل HPLC وفقا للجدول 1.
    2. تصفية المرحلة المتنقلة من خلال مرشح غشاء 0.45 ميكرومتر تحت فراغ. تصفية العينات من خلال 0.22 ميكرومتر المسام حجم الفهداح PVDF حقنة (قطرها 13 مم) وتخزينها في قارورة. بدء القياس.
  2. حلول المخزون ومعايير المعايرة وعينات مراقبة الجودة (QC)
    1. إعداد 10 mM من حلول الأسهم APAP في خلات الأمونيوم العازلة (100 mM، pH 6.8) والمزيد من التخفيف مع DMEM S وS ويليامز E وسائل الإعلام خلية المخفف مع المخزن المؤقت خلات الأمونيوم (1:1، الخامس / الخامس) لتحقيق حلول العمل تتراوح بين 0.25 إلى 100.00 μM.
    2. وتشمل مجموعة من عينات المعايرة في ثلاث 333 وكذلك عينات مراقبة الجودة على أربعة مستويات في ثلاث 33. إعداد هذه المعايير عن طريق التخفيف المسلسل.
    3. إنشاء منحنيات معايرة من مناطق الذروة APAP مقابل التركيزات القياسية الاسمية APAP. تحديد الانحدار الخطي المناسب لكل منحنى معايرة. تقييم جودة النماذج المختلفة للمعايرة عن طريق الفحص البصري ومعامل الارتباط والدقة داخل وفيما بين المدى وقيم الدقة.
    4. حقن عينات فارغة من DMEM S وS Williams E وسائل الإعلام المخفف في خلات الأمونيوم العازلة (1:1، v/v) في sextuplicate. إعداد ثلاثية من عينات مراقبة الجودة في DMEM S وS وليامز E وسائل الإعلام المخففة مع المخزن المؤقت خلات الأمونيوم (1:1، v/v) لتركيزات APAP من 0.50 (LOQ)، 4.50، 45.00 و 90.00 μM.
    5. تأكد من إعداد عينات مراقبة الجودة من محلول جديد للأسهم، يختلف عن ذلك المستخدم لإنشاء منحنى قياسي. استخدام عينات مراقبة الجودة للتحقيق في الاختلافات داخل وفيما بين.
  3. إجراءات المصادقة
    1. تنفيذ التحقق من صحة الأسلوب الحيوي في مجال الصحة بعد الإجراءات التي تم الإبلاغ عنهاسابقاً 29,30. تنفيذ مسارات الكروماتوغرافية في خمس أو ست مناسبات منفصلة، والنظر وليامز E S وDM S وسائل الإعلام ثقافة الخلية، على التوالي.
    2. تأكد من أن نقاط المعايرة التي تتراوح بين 0.25 و 100.00 μM من APAP، في وسائط ثقافة الخلايا DMEM S أو Williams E S المخففة في حاجز خلات الأمونيوم (1:1، v/v)، يتم رسمها استنادًا إلى مناطق الذروة في APAP (المحور ص) مقابل التركيزات الاسمية ذات الصلة (المحور x). قارن بين منحدرات منحنيات المعايرة القياسية هذه مع منحدرات منحنى المعايرة المعدة في مخزن خلات الأمونيوم. تأكد من أن جميع منحنيات المعايرة لها قيمة ارتباط لا تقل عن 0.998.
    3. تحديد الدقة والدقة (داخل و intra-تشغيل) للاندار في مصفوفة بديلة باستخدام تكرارات في أربعة مستويات مختلفة LLOQ، منخفضة، متوسطة، وعالية الجودة في خمسة أو ستة أيام مختلفة. تنفيذ قياسات الدقة والدقة داخل المدى في نفس اليوم في وسائط ثقافة الخلايا DMEM S أو Williams E S المخففة في مخزن خلات الأمونيوم (1:1، v/v) الذي يحتوي على 0.50 و4.50 و45.00 و90.00 ميكرومتر APAP تركيزات (ن = 3).
    4. تقييم كل مجموعة من عينات مراقبة الجودة التي تحتوي على تركيزات APAP من منحنيات المعايرة التي تم الحصول عليها مؤخرًا. اختبار الانتقائية من المقايسات من درجة فصل مجمع الفائدة والذرى الكروماتوغرافية الأخرى المحتملة الناجمة عن المكونات التداخل.
  4. الحد الأدنى من القياس الكمي (LLOQ) والحد من الكشف (LOD)
    1. تحديد الحد الأدنى من القياس الكمي (LLOQ) استناداً إلى الانحراف المعياري للإستجابة ونهج الميل. حساب باستخدام الصيغة 10α / S، حيث α هو الانحراف المعياري من تقاطع y و S هو ميل خط مستقيم تم الحصول عليها عن طريق رسم منحنيات المعايرة29،30. تقدير حد الكشف (LOD) مع الأخذ في الاعتبار 3.3 مرات الانحراف المعياري للفراغ ، مقسوما على منحدر منحنى المعايرة29،30.

6. الأنسجة مكافئات البقاء / وظائف

  1. MTT
    1. إجراء مقايسة MTT لتقييم قابلية البقاء في جميع الأوقات في كل من المقايسة MPS. كما التحكم السلبي، واستخدام وسائل الإعلام خلية زائد السيارة. كما السيطرة الإيجابية، وعلاج organoids مع APAP 100 mM و 1٪ صوديوم مخففة في وسط الخلية.
    2. نقل 20 spheroids من كل تكرار لآبار فردية في لوحة 96 جيدا، وتدرج ثقافة الخلية، التي تحتوي على مكافئات الأمعاء، إلى 24 لوحات خلايا جيدا، ووضع ما يعادل الأمعاء واحدة في البئر. اغسل مكافئات الأنسجة ثلاث مرات مع 1x DPBS.
    3. إضافة 300 μL من 1 ملغ / مل MTT الحل، المخفف في متوسطة الخلية المعنية، في بئر. احتضان لوحات لمدة 3 ساعة في ظروف ثقافة الخلية القياسية.
    4. إزالة حل MTT من كل جيدا بعناية عن طريق الأنابيب. استخراج MTT formazan من الأمعاء والكبد مكافئات باستخدام 200 ميكرولتر من ايزوبروبانول في كل ليلة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: قم بختم الغطاء لمنع التبخر.
    5. نقل 200 ميكرولتر من كل عظمى إلى كل منهما مسبقا تحديد جيدا في 96 جيدا لوحة اختبار الصغرى. استخدام الايزوبروبانول كفراغ.
    6. قراءة امتصاص formazan في قارئ لوحة في 570 نانومتر. حساب القدرة النسبية للخلايا على تقليل MTT (%) باستخدام متوسط الكثافة البصرية لكل نقطة زمنية ، مقارنة مع التحكم السلبي ، تعتبر 100 ٪ خلية البقاء.
  2. الكيمياء السيتوكيمية/علم الأنسجة
    1. إصلاح الأمعاء والكبد مكافئات, لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة, باستخدام 4% (ث/ الخامس) شبهformaldehyde في 0.1 M الفوسفات المالحة العازلة, درجة الحرارة 7.4. غسل organoids 5 مرات في المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في كل مرة. وصمة عار الأمعاء والكبد مكافئات مع tetramethylrhodamine isothiocyanate-phalloidin أو اليكسا فلور 647 phalloidin، 1:50 في برنامج تلفزيوني31.
    2. نقلها إلى أوك تجميد المتوسطة لبضع دقائق للتأقلم في RT قبل نقلها إلى النيتروجين السائل حتى تجميد كامل. تنفيذ عمليات اكشنات الكبد spheroids حول 10-12 μm سميكة، وذلك باستخدام cryostat.
    3. جبل أقسام الأنسجة في تصاعد المتوسطة مع DAPI. فحصها عن طريق المجهر الفلورية confocal.
    4. تجميد organoids بعد التثبيت لأداء الهماوكسيلين وeosin تلطيخ وفقا للبروتوكولات المعمول بها. قم بتركيب الشرائح مع متوسطة التركيب بعد تقطيع الأنسجة كما هو موضح أعلاه والتقط صورًا نسيجية باستخدام المجهر البصري.
  3. تحليل المحتوى العالي
    1. الميتوكوندريا وتلطيخ نووي للخلايا
      1. إعادة تكوين مسحوق مزال في DMSO لجعل 1 mm الميتوكوندريا تلطيخ الأسهم حل (على سبيل المثال، MitoTracker عميق الأحمر FM). مخزن ali ونقلت حل الأسهم في -20 درجة مئوية محمية من الضوء. تمييع 1 mm الميتوكوندريا تلطيخ الأسهم حل التركيز النهائي (200 nM) في قبل الدفء (37 درجة مئوية) الأنسجة المتوسطة دون مصل.
      2. إزالة وسائط ثقافة الخلية. إضافة حل تلطيخ الميتوكوندريا لتغطية تماما العينة واحتضان الخلايا لمدة 15-45 دقيقة في 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO2.
      3. إزالة بعناية الميتوكوندريا تلطيخ حل العمل واستبدالها مع 2-4٪ paraformaldehyde التثبيت في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      4. شطف الخلايا الثابتة بلطف مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. كرر عملية الغسيل مرتين.
      5. إعداد 10 ملغ / مل (16.23 M) الحمض النووي تلطيخ محلول الأسهم عن طريق حل 100 ملغ من Hoechst صبغة 33342 في 10 مل من الماء فائقة السخاء.
        ملاحظة: يجب أن يكون حل المخزون على سعر أو تخزين محمي من الضوء عند -20 درجة مئوية.
      6. إعداد 0.2-2.0 ميكروغرام / مل الحمض النووي تلطيخ حل العمل في برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا المثبت مع حمض نووي تلطيخ حل العمل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      7. إزالة الحمض النووي تلطيخ حل العمل وشطف الخلايا بلطف مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ثلاث مرات. يجب أن تبقى الخلايا في برنامج تلفزيوني عند 4 درجة مئوية، محمية من الضوء.
    2. تحليل التلطّخات النووية والميتوكوندريا
      1. تحليل الخلايا باستخدام المجهر الفلوري مع مجموعات مرشح مناسبة لطخة الحمض النووي (λEx / λEm: 361/497 نانومتر) و stain الميتوكوندريا (λEx / λEm: 644/665 نانومتر). العثور على الخلايا عن طريق الحمض النووي إيجابية تلطيخ وقياس عدد الخلايا. كمي شدة الفلورية البقع الميتوكوندريا في الميتوكوندريا.
  4. قياسات مورفوميتري (حسابات السفئيات) في ImageJ
    1. تصدير عالية المحتوى تحليل (HCA) الصور كالملفات *.flex من برنامج كولومبوس. استيراد ملفات .flex كتدرج رمادي في ImageJ باستخدام المساعد تنسيقاتBio-Formats 32: ملف > استيراد > تنسيقات حيوية.
    2. في نافذة خيارات الاستيراد، حدد عرض Hyperstack وقم بتمكين قنوات الانقسام ضمن تقسيم إلى نوافذ منفصلة. سيسمح هذا الخيار بالوصول إلى كافة الملفات في قناة معينة (مثل DAPI و mitotracker وما إلى ذلك). لا تحدد استخدام المكدس الظاهري ضمن إدارة الذاكرة.
      ملاحظة: يفضل استخدام قناة DAPI كـ "غبار" في الصور حيث يتم تقليل الاستزراع في الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية (على سبيل المثال، 405 نانومتر).
    3. ضبط حجم البكسل(تحليل > تعيين مقياس) إذا لم يتم تحميله وفقًا للقيم المضمنة في الملف .flex. تطبيق مرشح طمس غاوسي لإزالة فائض من الضوضاء وتجنب المخالفات في كفاف الشكل. عملية > مرشحات > غاوسي طمس. قيمة عالية من سيغما (نصف قطرها) بين 2.0 و 3.0 مثالية لمعظم الحالات. إذا كان المكدس يحتوي على عدة صور، تطبيق على كافة منها (حدد نعم في إطار "عملية المكدس").
    4. إنشاء صورة ثنائية لفصل الخلفية والأجهزة (الكائنات) باستخدام عتبة. انقر فوق صورة > ضبط > الحد الأدنى. استخدام قناع أحمر لضبط القيم وفقا لشدة الصورة ، لتناسب شكل organoid ، والحفاظ على مورفولوجيا سليمة. تعطيل الخلفية الداكنة إذا كانت الصورة تحتوي على خلفية بيضاء. انقر فوق تطبيق.
    5. في إطار تحويل المكدس إلى ثنائي اختر الأسلوب Threshold. عادة ، الافتراضي أو المثلث المفضل في هذا النوع من معالجة الصور. الحفاظ على الخلفية كما الظلام. حدد حساب الحد الأقصى لكل صورة إذا كان هناك عدة صور في المكدس.
    6. حدد عملية > ثنائي > ثقوب التعبئة. اختياريا، إزالة الثقوب من الخلفية. في عملية > ثنائي > الخيارق، حدد خلفية سوداء وتنفيذ ثقوب التعبئة مرة أخرى. تعطيل خيار خلفية أسود قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
    7. كائنات منفصلة. بالنسبة للعضيات، فإن طريقة مستجمعات المياه هي خيار جيد. انقر فوق عملية > ثنائي > مستجمعات المياه. تنفيذ تحليل الشكل.
      1. حدد تحليل > تعيين القياسات. تتوفر العديد من الخيارات (التفاصيل في https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). بالنسبة للعضيات، حدد المنطقة، متوسط القيمة الرمادية، الحد الأدنى & الحد الأقصى من قيمة الرمادي و واصفات الشكل. اختياريًا، حدد تسمية العرض لتحديد الكائنات في الصورة وعلامة علمية. انقر فوق موافق.
      2. حدد التحليل > تحليل الجسيمات. اختر حدود الحجم و دائرية. الاحتفاظ 0-اللانهاية و 0.00-1.00، على التوالي لقياس جميع الكائنات في الصورة. في إظهار، اختر المخططات التفصيلية بحيث يتم تحديد الكائنات. تمكين نتائج العرض لنتائج الإخراج؛ استبعاد على الحواف لاستبعاد الكائنات التي تم لمسها الحدود؛ وتشمل الثقوب حتى الثقوب الداخلية في نهاية المطاف في الكائنات تعتبر جزءا من الشكل الرئيسي.
    8. كرر تحليل الشكل لكل مكدس صور وسيتم إلحاق النتائج في جدول واحد. تصدير جدول نتائج في ملف > حفظ باسم... كملف القيم المفصولة بفاصلة (.csv).
  5. في الوقت الحقيقي PCR
    1. استخراج الحمض النووي الريبي من مكافئات الأنسجة باستخدام محلول أحادي الطور من الفينول وisothiocyanate guanidine، اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    2. تنفيذ التوليف cDNA عن طريق النسخ العكسي من 1 – 2 ميكروغرام من مجموع RNA.
    3. تضخيم جميع الأهداف باستخدام التمهيديات الخاصة بالجينات(الجدول 5)لإجراء عملية PCR الكمية في الوقت الحقيقي. كل qRT-PCR يحتوي على 30 نانوغرام من الحمض النووي الريبي العكسي و 100 nM من كل التمهيدي.
    4. اتبع شروط PCR: 50 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (دورة 1)؛ 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (دورة 1)؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 59 درجة مئوية لمدة 45 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (35 - 40 دورة).
  6. CYP الفحص
    1. اتبع القسم 2.2 للكبد 2-OC الجمعية. المجموعات التجريبية هي لا خلية التحكم، APAP 2 μM العلاجات ل 12 ساعة، 24 ساعة، والتحكم في السيارة. اتبع القسمين 3.3 و 4.2 لإعداد ومعالجة APAP 2 μM.
      ملاحظة: لضمان أن جميع العينات سوف تكون جاهزة في نفس الوقت لCYP اختبار, بدء العلاج 12 ح 12 ساعات بعد بدء العلاج 24 ح. علاج التحكم في عدم وجود خلية من النشاط CYP مع 0.5٪ من محلول الإيثانول، فضلا عن التحكم في السيارة.
    2. ذوبان 3 mM الركيزة حل مضيئة في درجة حرارة الغرفة وجعل تخفيف 1:1000 في وليام E S. حماية من الضوء.
    3. جمع spheroids ونقل كل مجموعة تجريبية إلى بئر من لوحة 96-جيدا. إزالة المتوسطة، وغسل مرتين مع 100 ميكرولتر من 1X DPBS وإضافة 80 ميكرولتر من 3 ميكرومتر محلول الركيزة في البئر. حافظ على التحكم بدون خلية في وسط ويليام إي إس حفظ جيدا دون spheroids أو حل الركيزة لعنصر تحكم في الخلفية. احتضان لمدة 30-60 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2،محمية من الضوء.
    4. اكويليراتي lyophilized كاشف الكشف Luciferin (LDR) باستخدام العازلة إعادة تشكيل مع esterase. مزيج عن طريق دوامة أو عكس. قم بتخزين وحدة التخزين المخصصة في درجة حرارة الغرفة حتى الخطوة التالية.
      ملاحظة: يمكن تخزين LDR المعاد تشكيلها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة أو عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع دون فقدان النشاط. للتخزين على المدى الطويل، يُخزن عند -20 درجة مئوية.
    5. نقل 25 ميكرولتر من spheroids سليمة 'سوبرنات في ثلاثة آبار مختلفة من الأبيض شفاف 96 جيدا microplate، بعد الحضانة. إضافة 25 μL من LDR في البئر والتجانس.
    6. احتضان لوحة بيضاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. قراءة الإنارة على مضيئة. لا تستخدمي مقياس الفلور.
    7. حساب الإشارات الصافية عن طريق طرح قيم الإضاءة الخلفية (التحكم بدون خلية) من قيم اختبار المعالجة المركبة وغير المعالجة (التحكم في السيارة). حساب النسبة المئوية لتغير نشاط CYP3A4 بقسمة القيم المعالجة الصافية على القيم غير المعالجة الصافية والضرب على 100.
  7. النشاف الغربي
    1. نقل spheroids الكبد إلى 1.5 مل تحديد microtube. قم بإزالة الوسط واغسل مرتين مع 100 ميكرولتر من 1x DPBS.
    2. Lysate spheroids الكبد في 100 ميكرولتر من الخلايا تحلل RIPA العازلة في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية، و 11000 دورة في الدقيقة. نقل supernatant إلى آخر تحديد 1.5 مل microtube.
    3. كمّيّة المبلغة البروتين ينال من خلال برادفورد طريقة. تحميل ما بين 10 و 50 ميكروغرام من البروتين من الخلية كميا lysate لكل بئر من جل البولي أكرريلاميد التدرج 3-15٪ وتنفيذ SDS-PAGE.
    4. نقل البروتين المحملة من هلام إلى 0.22 μm PVDF غشاء من خلال معدات النظام شبه الجاف. استخدم محلول نقل من 50 mM تريس-HCl و 192 mM جليكين. تعيين المعلمات المعدات وفقا لعدد من المواد الهلامية التي سيتم نقلها (1 إلى 2 في وقت).
    5. منع التفاعلات غير محددة على غشاء PVDF مع محلول الحليب الخالي من الدسم 3-5٪ في العازلة TBS-T: تريس المخزنة سالين (50 mM تريس pH 7.6، 150 mM كلوريد الصوديوم) تكملها 0.1٪ من Tween 20. الحفاظ على الغشاء تحت اهتزاز مستمر بلطف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    6. غسل مع TBS-T تحت اهتزاز مستمر بلطف لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة الغسيل مرتين.
    7. تمييع الالبومين و vinculin الأجسام المضادة الأولية إلى 1:1000 و 1:2000 على التوالي على TBS-T. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، تحت اهتزاز مستمر بلطف.
      ملاحظة: اتبع دائما تعليمات الشركة المصنعة لتخفيف الأجسام المضادة.
    8. إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل غشاء 3 مرات (الخطوة 6.7.6). تخفيف ECL المضادة للماوس IgG الأجسام المضادة الثانوية إلى 1:5000 على TBS-T. احتضان الغشاء مع جسم مضاد ثانوي تحت اهتزاز مستمر بلطف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    9. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل الغشاء (الخطوة 6.7.6). إجراء الكشف عن البروتين باستخدام ECL الغربية النشاف الركيزة. عرض الأفلام autoradiographic لمدة 30 s إلى 30 دقيقة. إجراء الكشف المناعي في ثلاثية.

النتائج

لإجراء اختبارات PK APAP في 2-OC MPS، فإن الخطوة الأولى هي تصنيع الأمعاء البشرية والكبد مكافئات (organoids). وهي مدمجة في جهاز microfluidic 2-OC(الشكل 1A)24 ساعة قبل البدء في اختبار PK APAP. في اليوم التالي، يتم تغيير الوسيط، ويتم عرض النموذج إلى APAP. يوضح الشكل 1 مكافئات الأمعاء والكب?...

Discussion

إن التقييم الدقيق والموثوق للخصائص الدوائية للأدوية الجديدة التحقيقية أمر بالغ الأهمية للحد من المخاطر في خطوات التطوير التالية. MPS هي تقنية جديدة نسبيا ، التي تهدف إلى تحسين القدرة التنبؤية وتقليل التكاليف والوقت الذي يقضيه مع الاختبارات قبل الإكلينيكية. وتتقدم مجموعتنا في تقييم الخصا?...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر الدكتور كريستي غوجين- غيلوزو، والدكتور فيليب جريبون في الوحدة 522 INSERM، والدكتور كريستيان تريبو في الوحدة 271 INSERM لاستخدام المواد البيولوجية (خلايا هيبا RG) وإتاحتها لنا من أجل إجراء البحث الأكاديمي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235No calcium, no magnesium
2-OCTissUse GmbHTwo-organ chip
384-well Spheroid MicroplateCorning3830Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% ParaformaldehydeUse to fix cell
AcetaminophenSigma AldrichA7085Use to MPS assays
AcetonitrileTediaUsed to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidinThermo Fisher Scientificconfocal experiment
Ammonium acetateSigma AldrichUsed to perform HPLC
Caco-2 cellsSigma Aldrich86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasksSarstedt
Confocal Fluorescence microscopeLeicaDMI6000
CryostatLeicaCM1950
DMEM high glucoseThermo Fisher Scientific12800017Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSOSigma AldrichD4540Add 2% to HepaRG media
EthanolSynth
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific12657029
Freezing medium OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cellsBiopredic InternationalHPR101Undifferentiated cells
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300Cells and all culture supplements
Hoechst 33342HCA experiments
HT-29 cellsSigma Aldrich85061109
Human InsulinInvitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
IsopropanolMerck278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamineThermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 guard column SSPhenomenexUsed to perform HPLC
MicroscopeLeicaDMi4000
MicrotomeLeicaRM2245
Millicell 0.4 µm pore size insertsMerckPIHP01250
Millicell ERS-2 meterMerckMERS00002Used to TEER measurement
MitoTracker Deep RedHCA experiments
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P systemAgilent Technologies
Neubauer chamberCounting cells
Operetta High Content Imaging SystemPerkin ElmerUsed to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPAPromegaCat.# V9001
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15070063Cell culture
PermountThermo Fisher ScientificHistology
PrimersRT-qPCR
PVDF membraneBioRad
PVDF Syringe filter0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 columnPhenomenexUsed to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM)ScienCell5301Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse TranscriptaseThermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific
TRizol TM reagentThermo Fisher ScientificTrizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solutionThermo Fisher ScientificR001100
Ultra-low-attachment platesCorningCLS3471-24EA6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well MicroplatePerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams EPan BiotechP04-29510Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

References

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  24. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  25. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  26. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  27. Dollery, C. . Therapeutic Drugs. , (1999).
  28. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  29. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  30. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  31. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, (2018).
  32. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  33. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, (2018).
  34. OECD, O. E. C. D. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, (2016).
  35. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, (2015).
  36. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  37. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  38. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

166 ADMETox

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved