توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

Summary

تتميز آثار مثبطات الميغراستاتيك على هجرة الخلايا السرطانية في اختبار الغزو ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) باستخدام مثبطات الأسيتيليلاز الهيستون (HDAC) بالفحص المجهري البؤري عالي الدقة.

Abstract

ويتزايد الاستناد إلى اكتشاف المخدرات وتطويرها في بحوث السرطان على شاشات المخدرات في شكل ثلاثي الأبعاد. ويجري اكتشاف مثبطات جديدة تستهدف إمكانات الخلايا السرطانية المهاجرة والغازية، وبالتالي الانتشار النقيلي للمرض، وتعتبر علاجات تكميلية في أنواع السرطان الشديدة التوغل مثل الأورام الدبقية. وبالتالي، فإن توليد البيانات التي تمكن من إجراء تحليلات مفصلة للخلايا في بيئة ثلاثية الجوانب بعد إضافة دواء مطلوب. المنهجية الموصوفة هنا، التي تجمع بين اختبار غزو البشيرويد والتقاط الصور عالية الدقة وتحليل البيانات عن طريق الفحص المجهري المسح الضوئي بالليزر (CLSM)، مكنت من توصيف مفصل لآثار مثبطات مكافحة الهجرة المحتملة MI-192 على خلايا الورم الدبقي. تم إنشاء Spheroids من خطوط الخلايا لتجارب الغزو في لوحات 96 جيدا الالتزام منخفضة ومن ثم أعدت لتحليل CLSM. وقد تم تفضيل سير العمل الموصوف على تقنيات أخرى شائعة الاستخدام لتوليد السفيرويد بسبب سهولة واستنساخ. هذا، جنبا إلى جنب مع دقة الصورة المحسنة التي تم تحقيقها عن طريق الفحص المجهري البؤري مقارنة مع النهج التقليدية واسعة المجال، سمح بتحديد وتحليل التغيرات المورفولوجية المتميزة في الخلايا المهاجرة في بيئة ثلاثية الأبعاد بعد العلاج مع المخدرات mi-192 mi.

Introduction

ويتزايد تفضيل التكنولوجيات الثلاثية الأبعاد لاكتشاف المخدرات قبل السريرية وتطوير أدوية السرطان المحتملة على شاشات الأدوية التقليدية؛ وبالتالي، هناك المزيد من التنمية من migrastatic - الهجرة ومنع الغزو - المخدرات. الأساس المنطقي وراء هذه التطورات في علاج السرطان واضحة: 3D sheroid الاختبارات تمثل نهجا أكثر واقعية لفحص الأدوية المضادة للسرطان المحتملة لأنها تحاكي الهندسة المعمارية الورم 3D أكثر إخلاصا من الثقافات الخلية أحادية الطبقة، تلخيص التفاعلات بين المخدرات والورم (الحركية) بشكل أكثر دقة، والسماح بتوصيف نشاط الدواء في بيئة ذات صلة الورم. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ارتفاع مقاومة الأدوية السامة للسموم الكيميائية في العديد من أنواع السرطان وارتفاع معدلات الوفيات بين مرضى السرطان بسبب الانبثاث القوى من خلال قدرة الخلايا السرطانية على الهجرة إلى مواقع الورم البعيدة يدعم إدراج عوامل العلاج الكيميائي استهداف إمكانات الهجرة من الخلايا السرطانية كعلاج مساعد في تجارب السرطان السريرية في المستقبل¹. وهذا هو الحال بشكل خاص في السرطانات الغازية للغاية، مثل الأورام الدبقية عالية الجودة (GBM). تشمل إدارة GBM الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي. ومع ذلك، حتى مع الجمع بين العلاج، فإن معظم المرضى الانتكاس في غضون 1 سنة من التشخيص الأولي مع البقاء على قيد الحياة متوسط من 11-15 شهرا^2،3. وقد أحرز تقدم كبير في مجال التكنولوجيا 3D على مدى السنوات القليلة الماضية: نظم دوارة، وهياكل مجهقلة والسقالات 3D، ويجري تحسين الاختبارات الفردية الأخرى باستمرار للسماح بإجراء اختبارات روتينية على نطاق واسع^{4، 5و6و7.} ومع ذلك، يجب تحليل النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الاختبارات بطريقة مجدية لأن تفسير البيانات غالباً ما يعوقه محاولات تحليل البيانات التي تم إنشاؤها ثلاثية الأبعاد مع أنظمة تحليل الصور ثلاثية الأبعاد.

وعلى الرغم من أن معظم النظم الواسعة النطاق لا تزال محدودة بموجب القرار^8،على الرغم من أنها أفضل من حيث سرعة الحصول على الصور وانخفاض سمية الصورة. وهكذا، وبصرف النظر عن البيانات قراءة الخروج المتعلقة بفعالية المخدرات، والآثار التفصيلية للعمل المخدرات على الهياكل الخلوية 3D من الخلايا المهاجرة تضيع حتما إذا تم تصويرها باستخدام نظام واسع المجال. وعلى العكس من ذلك، يلتقط الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر (CLSM) صورًا عالية الجودة ومقطعة بصريًا يمكن إعادة بنائها وتقديمها في مرحلة ما بعد الاكتساب ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج الكمبيوتر. وهكذا، فإن CLSM ينطبق بسهولة على الهياكل الخلوية ثلاثية الأبعاد المعقدة التصويرية، مما يتيح التحقيق في آثار مثبطات مضادة للميثاستاتيك على الهياكل ثلاثية الأبعاد والتحليلات المتعمقة لآليات هجرة الخلايا. ومما لا شك فيه أن هذا سيوجه تطوير العقاقير الميجراستاتيكية في المستقبل. هنا، يتم وصف سير العمل مجتمعة من جيل spheroid، والعلاج من المخدرات، بروتوكول تلطيخ، والتوصيف عن طريق الفحص المجهري البؤري عالية الدقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. توليد من Spheroids الخلية

اليوم الأول

1. إعداد وسط الثقافة القياسية كما هو مطلوب من قبل خط الخلية قيد التحقيق.
2. تنفيذ جميع الخطوات المرتبطة بزراعة الأنسجة في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة باستخدام تقنيات المناولة المعقمة.
3. التجرب وحساب الخلايا السرطانية. استخدام 20 مل من تعليق الخلية لكل لوحة. الحفاظ على تعليق الخلية في أنابيب عالمية معقمة وصفت بوضوح.
4. إضافة عدد محدد مسبقا من الخلايا إلى كل بئر. كل من العدد الأولي للخلايا وحجم spheroid النهائي المطلوبة يعتمد على معدل انتشار خط الخلية التي يجري التحقيق فيها.
   ملاحظة: لخطوط الخلايا الدبقية الراسخة مثل U251 و KNS42^9،10،5 × 10³ خلايا / مل سوف تنتج spheroid مرئية مجهرية (200 أو 800 م) بعد 4 أيام من الحضانة.
5. إعادة تعليق الخلايا في أنابيب عالمية عن طريق انعكاس لطيف لتجنب تكتل الخلايا. ماصة 200 درجة مئوية من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة 96 جيدا. إذا لم تكن جميع الآبار مطلوبة، فمن المستحسن إضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS إلى كل بئر فارغة لتجنب التبخر.
6. حضانة الخلايا في حاضنة طبيعية عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: خطوط الخلايا مثل خطوط الخلايا السرطانية الورم الدبقي سوف تشكل spheroids في غضون 24 ح. السماح للهندسة الخلوية 3D لتشكيل عن طريق احتضان spheroid لمدة 72 ساعة.

اليوم الثاني

7. فحص الخلايا عن طريق الفحص المجهري مشرق الميدان بعد 24 ح. اعتمادا على خط الخلية، قد تكون الخلايا قد شكلت spheroid يمكن الكشف عنها في الجزء السفلي من البئر.
   ملاحظة: خطوط الخلايا السرطانية السرطانية الراسخة تشكل بسهولة النفيض في غضون 24 ساعة.

2. الكولاجين غزو ة

اليوم الثالث

1. ضع الكولاجين، 5X ثقافة المتوسطة، 1 M هيدروكسيد الصوديوم، وأنبوب واحد 20 مل على الجليد.
2. إضافة بعناية وببطء 10.4 مل من الكولاجين البارد في أنبوب الثقافة المبردة. تجنب فقاعات. هذه الكمية من الكولاجين كافية للوحة واحدة 96 جيدا. الترقية ممكن، ولكن من المستحسن أن يتم إعداد أنبوب واحد 20 مل لكل لوحة في وقت واحد.
3. إضافة بلطف 1.52 مل من الباردة معقمة 5X وسط الثقافة. تجنب فقاعات.
4. قبل الاستخدام مباشرة، أضف بلطف 72 ميكرولتر من هيدروكسيد الباردة 1 M هيدروكسيد الصوديوم. الحفاظ على الحل على الجليد.
5. يُمزج بلطف عن طريق الأنابيب. تجنب فقاعات. خلط فعال يؤدي إلى تغيير اللون (من الأحمر إلى البرتقالي والأحمر (درجة الحموضة 7.4) في المتوسط. يُترك المزيج على الثلج حتى يُترك.
6. خطوة حاسمة: إزالة 190 درجة مئوية من supernatant من لوحة 96 جيدا أعدت في اليوم 1. كن حذرا جدا لا يزعج spheroids التي شكلت في الجزء السفلي من البئر. استخدام ماصة في زاوية نحو الجانب، وليس مركز، من البئر.
7. إضافة بلطف 100 درجة مئوية من مزيج الكولاجين إلى كل بئر. لمنع أي اضطراب spheroid، ماصة مزيج أسفل الجانب من البئر. تجنب فقاعات. الحفاظ على أي مزيج الكولاجين المتبقية في أنبوب 20 مل في درجة حرارة الغرفة لتقييم البلمرة.
8. طبق الحضانة في الحاضنة لمدة 10 دقائق على الأقل للسماح للكولاجين للبلمرة. كمبدأ توجيهي، إذا تم تعيين الكولاجين المتبقي، لتصبح شبه صلبة والإسفنج مثل، وspheroids على استعداد لعلاجمع المانع.
9. إضافة الأدوية أو مثبطات في تركيز 2X إلى وسط الثقافة. إضافة المتوسطة بلطف إلى كل بئر (100 درجة مئوية لكل بئر). مرة أخرى، ماصة المتوسطة أسفل جانب البئر لتجنب اضطراب spheroid.
10. مراقبة وصورة كل spheroid عن طريق المجهرية حقل مشرق في بعض الأحيان T = 0 ساعة، 24 ح، 48 ح، و 72 ح لتقييم نشاط المخدرات. ثم اعادة اللوحة الى الحاضنة.
    ملاحظة: اعتمادا على السلوك الغازية من خط الخلية، يمكن ملاحظة الهجرة بعيدا عن جوهر spheroid الأصلي من 24 ساعة فصاعدا.

3. إعداد الكولاجين جزءا لا يتجزأ من Spheroids والخلايا المهاجرة للميكروسكوب البؤري

1. ضع اللوحة في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة وإزالة بلطف supernatant (200 درجة مئوية). مرة أخرى، والحرص على عدم إزعاج spheroid وتجنب لمس الكولاجين، وهذا قد تتداخل مع المكونات الكولاجين.
2. استبدال supernatant مع 100 درجة مئوية من 1X PBS. كرر هذه الخطوة غسل 3x.
3. إزالة الغسيل النهائي واستبدال مع 4٪ الفورمالديهايد في 1X PBS (100 درجة مئوية لكل بئر).
   تحذير: الفورمالديهايد هو مسرطن محتمل. التعامل مع الرعاية وفقا للمبادئ التوجيهية للصحة والسلامة.
4. ضع طبق 96 بئر على مقعد المختبر، وتغطية مع احباط، وترك لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
5. إزالة الفورمالديهايد بعناية واستبدالها 1X PBS. كرر هذا 1X PBS غسل 3X.
6. إعداد 0.1٪ تريتون X-100 في 1X PBS. قم بإزالة غسل PBS 1x واستبداله بـ 100 ميكرولتر من حل تريتون X-100. الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في هذه الأثناء، إعداد حل حجب مع 1X PBS و 0.05٪ مسحوق الحليب منزوع الدسم وتخلط جيدا.
7. إزالة تريتون X-100 وغسل 3X مع 1X PBS. إضافة 100 درجة مئوية من حل حظر لكل بئر وحضانة لمدة 15 دقيقة.
8. تمييع الأجسام المضادة الأساسية المطلوبة في حظر المخزن المؤقت عند التركيز المحدد مسبقاً. هنا، استخدم الأجسام المضادة للماوس IgG الأسيتيلاتيتوبين (1:100).
9. الطرد المركزي الأساسية المضادة حجب الجسم العازلة مزيج لمدة 5 دقائق في 15,682 × ز. قم بإزالة محلول الحظر بعناية وأضف الـ supernatant (25-50 درجة مئوية) إلى كل بئر. الحضانة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
10. إزالة محلول الأجسام المضادة وغسل 3X مع 1X PBS (100 درجة مئوية لكل بئر).
11. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في المخزن المؤقت حظر في التركيز الموصى بها أو المحددة مسبقا بالإضافة إلى أي بقع الفلورسنت إضافية. هنا، استخدم 1:500 مضاد للماوس فلوروفور-488 جسم مضاد مترافق، phalloidin-594 (1:500) لتلطيخ الأكتين، ووصمة الحمض النووي (DAPI).
12. مرة أخرى، الطرد المركزي حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة 5 دقائق في 13،000 دورة في الدقيقة.
13. قم بإزالة محلول الحظر من كل بئر وأضف 25-50 درجة مئوية من مزيج الأجسام المضادة الثانوية/الفيلويدين/DAPI. الحضانة في الظلام لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
14. إزالة الثانوية المضادة للجسم صبغ الحل وغسل 3X مع 1X PBS (100 درجة مئوية لكل بئر).
15. رفع بعناية المقابس الكولاجين الفردية عن طريق شفط مع ماصة بلاستيكية (200 درجة مئوية) على وسط شريحة زجاجية عاديعالية الجودة.
16. إضافة قطرة واحدة من جبل مناسبة إلى قابس الكولاجين، وضمان تغطية المكونات تماما. تجنب فقاعات.
17. تطبيق غطاء من سمك الأمثل لهدف المجهر التي سيتم استخدامها للتصوير والسماح لتعيين بين عشية وضحاها. تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

4. مجهريال الفلورة

1. التقاط الصور الفلورية باستخدام المجهر البؤري المناسب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تعمل تقنية spheroid ثلاثية الأبعاد على تعزيز فهم التفاعلات بين المخدرات والورم لأنها أكثر تمثيلاً للبيئة الخاصة بالسرطان. ويمكن تحقيق جيل من spheroids في عدة طرق. تم استخدام لوحات 96 جيدا منخفضة في هذا البروتوكول. بعد اختبار العديد من المنتجات من مختلف الشركات المصنعة، تم اختيار ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يتم وصف طريقة جديدة لخلق spheroids الخلايا السرطانية لتحديد نشاط المخدرات migrastatic باستخدام الفحص المجهري البؤري عالية الدقة. وقد سهل استخدام لوحات منخفضة الالتزام على تقنيات أخرى، مثل قطرات شنقا^15،وسيلة لتوليد spheroids قابلة للاستنساخ وموحدة لاستخدامها في هجرة الكولاجين وتجارب الغز...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.