تنميط اوبيكويتين و اوبيكويتين-مثل التعديلات اللاحقة الانتقالية وتحديد التعديلات الهامه

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء اوبيكييتين (Ub) و اوبيكويتين-أمثال (Ubls) بروتينيه محدده من أجل تحديد التعديلات من هذا النوع من التعديلات بعد الانتقالية (PTMs) ، المرتبطة بحاله معينه مثل العلاج أو النمط الظاهري.

Abstract

اوبيكويتين (ub) و اوبيكويتين (ubl) تعتمد التعديلات بعد الانتقالية من البروتينات تلعب الأدوار التنظيمية البيولوجية الاساسيه داخل الخلية عن طريق التحكم في استقرار البروتين ، والنشاط ، والتفاعلات ، وتوطين الخلايا. فهي تمكن الخلية من الاستجابة للإشارات والتكيف مع التغيرات في بيئتها. التعديلات داخل هذه أليات يمكن ان يؤدي إلى حالات مرضيه شديده مثل امراض الأعصاب والسرطان. والهدف من هذه التقنية الموصوفة هنا هو إنشاء ملفات PTMs التابعة ل ub/ubls ، بسرعة ودقه ، من خطوط الخلايا المستزرعة. وتسمح المقارنة بين الملامح المختلفة التي يتم الحصول عليها من ظروف مختلفه بتحديد التعديلات المحددة ، مثل تلك التي يسببها العلاج علي سبيل المثال. يتم تنفيذ لينتيفيرال الخلية بوساطة لإنشاء خطوط خلايا مستقره التعبير عن اثنين من العلامات (6 له والعلم) الإصدار من المعدل (اوبيكويتين أو ubl مثل SUMO1 أو Nedd8). هذه العلامات تسمح لتنقيه اوبيكويتين التالي من البروتينات اوبيتاميناتيد من الخلايا. ويتم ذلك من خلال عمليه تنقيه من خطوتين: يتم تنفيذ أول واحد في ظروف التعتيم باستخدام علامة 6 له ، والثانية في الظروف الاصليه باستخدام علامة العلم. وهذا يؤدي إلى عزله شديده التحديد ونقيه من البروتينات المعدلة التي يتم تحديدها فيما بعد ونصف الكمية بواسطة اللوني السائل متبوعا بتكنولوجيا الطيف الكتلي (LC-MS/MS) الترادفية. يتيح التحليل المعلوماتي السهل لبيانات MS باستخدام برنامج Excel إنشاء ملفات تعريف PTM عن طريق القضاء علي إشارات الخلفية. وتقارن هذه التوصيفات بين كل حاله من أجل تحديد التعديلات المحددة التي ستدرس بعد ذلك بشكل أكثر تحديدا ، بدءا من التحقق من صحتها بواسطة تقنيات الكيمياء الحيوية القياسية.

Introduction

الطريقة المقترحة هنا مكرسه لدراسة PTMs بوساطة افراد الاسره اوبيكويتين من خلايا الثدييات مثقف من أجل تحديد التغييرات المحتملة المرتبطة بحاله معينه (العلاج ، والتمايز ، الخ). PTMs تمثل الخطوة الاخيره من تنظيم وظائف البروتينات¹. في الواقع ، مره واحده التي تنتجها آلات الانتقالية ، ومعظم ان لم يكن جميع البروتينات الخضوع لأنواع مختلفه من PTMs التي تعدل نشاطها ، والتفاعلات الجزيئية ، والموقع داخل الخلايا¹. من بين عدد كبير من PTMs هي تلك التي توسط من قبل عائله اوبيكييتين من البروتينات ، اوبيكويتين نفسها وجميع الأمثال اوبيكويتين ، لديها القدرة علي تنظيم جميع البروتينات الخلوية أو جزئيا الخلايا الدهنية². لأنها هي نفسها البروتينات ، ويمكن ان تكون مترافقة مع بعضها البعض ، وتشكيل سلاسل متجانسة وغير متجانسة من طبولوجيا متنوعة ، كل المرتبطة بوظائف تنظيميه محدده². هناك حاجه إلى أدوات لمحاولة فك وفهم هذه آلات المعقدة. تم تطوير العديد من النهج في جميع انحاء العالم ، وجود مزاياها وعيوبها الخاصة ، وهنا نقترح واحده مع أداء عاليه مناسبه للخلايا مثقف.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي دقتها. في الواقع ، يتم تحسين نقاء البروتينات المعدلة المعزولة بشكل كبير من خلال استخدام التوافقية اثنين من العلامات (6 له والعلم) والاجراء خطوتين ، التالي فانه هو أكثر انتقائية بكثير من الانصهار علامة واحده Ub/ubl^3،4. ان وجود العلامة السادسة يتيح الخطوة الاولي لتنقيه الحالة بشكل كامل التالي تجنب اي تنقيه مشتركه للبروتينات التي تحتوي علي النطاقات الملزمة بالبالكامل أو البروتينات الأخرى الملزمة لتلك البروتينات. هذه هي مشكله تقنيه واجهتها العديد من النهج الأخرى علي أساس التقارب تنقيه البروتينات اوبيتامينيد باستخدام اما الأجسام المضادة المحددة⁵ أو جنبا بالترادف العناصر الملزمة (أنابيب)⁶. الأهم من ذلك ، فان هذه التقنية ليست متحيزة لصالح تنقيه نوع معين من العرافة ، كما انه يمكن ان يكون الحال بالنسبة لبعض النهج الأخرى ، لأنه تم تحديد كل من أحاديه وأنواع مختلفه من polyubiquitinations⁷. التالي ، وبمجرد العثور عليها ، سيكون من الممكن دراسة تغيير في الكل بمزيد من التفاصيل عن طريق النهج الكيميائية الحيوية القياسية من أجل التعرف علي النوع الدقيق من الرغبة المطلقة المعنية.

وأخيرا ، ميزه تقنيه أخرى من هذا البروتوكول هو استخدام لينتيفيروسيس ، التي بسهوله وسرعه يخلق مستقره خطوط الخلايا التعبير مع مستوي معقول من التعبيرات معدل الموسومة دون التدخل في السلوك الخلوي العادي.

في حين ان أحد الأدوار الهامه للإبداء هو استهداف البروتينات للتحلل البروتيني ، فمن المعروف الآن ان لديها العديد من الخصائص التنظيمية الأخرى للبروتينات المحتملة داخل الخلايا أو جزئيا¹. زادت الرقم من هذا اعمال أكثر بالوجود من كثير [اوبيقوتين] مثل بروتينات, يشكل أسره البروتينات ينظم تقريبا كل خليه اليه¹. تعديلاتها يمكن ان يكون لها تاثير جذري علي بيولوجيا الخلية ، ويمكن ان يؤدي أو المشاركة في الحالات المرضية⁸، مثل السرطان⁹. التالي ، هناك حاجه إلى أدوات لاستكشاف هذه المناظر الطبيعية الشاسعة وتحديد التعديلات المرتبطة بحاله مرضيه يمكن ان تكون بمثابه أهداف علاجيه جديده.

ويكرس هذا البروتوكول للخلايا في الثقافة لأنها تحتاج إلى ان تكون محوله للتعبير عن الخارجية الموسومة Ub/Ubl. وبمجرد إنشائها ، يمكن استخدام هذه الخطوط الخلوية المستقرة لتوليد ملفات Ubl من الثقافة في 2D أو 3D أو xenografts ، التالي توسيع أفق النماذج التجريبية المختلفة التي يمكن تطبيقها لدراسة لمحات PTMs.

Protocol

1. توليد خطوط الخلايا مستقره التعبير عن 6His-العلم-Ubl

ملاحظه: الانتقال المشترك للخلايا 293T مع Pكونتيننت-6HF-Ubl ، pVSVG ودلتا-المساعد.

1. اليوم 0: البذور 293T الخلايا في لوحه 6 حسنا للحصول علي 50-70 ٪ التقاء في اليوم التالي.
2. اليوم الأول: شارك في transfect 50-70 ٪ متموج الخلايا مع مزيج من 1 ميكروغرام من Pكونتيننت-6HF-Ubl أو Pكونتيننت-GFP ، 1 ميكروغرام من pVSVG و 1 ميكروغرام من ناقلات دلتا المساعد ، وذلك باستخدام كاشف النقل وبروتوكول لإنتاج لينتيفيروس. بعد 6 ح من الانتقال ، تغيير المتوسطة إلى واحده جديده المقابلة للخلايا ان تكون محوله. بذور الخلايا التي سيتم توصيلها في 6 لوحه جيدا من أجل الحصول علي 10-20 ٪ التقاء في اليوم التالي (يوم بدء المحول).
3. اليوم 2:24 ساعة بعد التحويل ، واستعاده المتوسطة التي تحتوي علي جزيئات لينتيفيرال وتصفيه باستخدام مرشحات 0.45 μm. إذا لزم الأمر ، أضافه المتوسطة الطازجة في هذه المرحلة من أجل إنتاج دفعه ثانيه من لينتيفيروسيس. استبدلت الوسط الخلايا ان يكون [ترنسفيد] (10-20% التقاء) بالواحدة يحتوي لينتيفيروسيس.
   ملاحظه: يمكن الاحتفاظ لينتيفيرال المتوسطة في + 4 درجه مئوية لعده أيام قبل محول الوقود أو تخزينها في-80 درجه مئوية لأشهر.
4. احتضان الخلايا مع لينتيفيروسيس بين 24 h إلى 72 h في حاضنه القياسية (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO₂) ، ومن ثم تغيير المتوسطة لمعيار واحد جديد. إذا كان ذلك ممكنا ، تحقق من التعبير GFP باستخدام مجهر فلوري مقلوب لتقييم كفاءه التوصيل: النسبة المئوية للخلايا المعبرة والمستوي النسبي للتعبير لكل خليه. إذا لم يتم الكشف عن فلوري ، انتظر 2-3 اضافيه أيام كتعبير قد يستغرق وقتا أطول اعتمادا علي نوع الخلايا ليتم محوله.
5. إذا كانت السيطرة GFP ايجابيه ، وتنمو جميع الخلايا حتى وجود ما يكفي لتنفيذ السيطرة علي التعبير من 6HF-Ubl بواسطة المناعي ولطخه الغربية باستخدام مكافحه العلم الأجسام المضادة.

2. تنقيه مزدوجة من البروتينات المعدلة

ملاحظه: المخزن المؤقت 1:6 M Guanidinium-HCl ، 0.1 M Na₂hpo₄/الجناح₂PO₄، pH 8.0 ، 0.5 ٪ تريتون X-100.
العازلة 2:50 mM الجناح₂بو₄، 150 mm Nacl ، 1 ٪ Tween20 ، 5 ٪ الجلسرين ، pH 8.0.
العازلة 3:100 mM NH₄hco₃، pH 8.0.

1. تحلل الخلية: مره واحده جاهزه ، وغسل الاطباق الثقافية علي الأقل مره مع المحلول الملحي الفوسفات مخزنه (تلفزيوني) في درجه حرارة الغرفة (RT) والمضي قدما إلى تحلل الخلية أو ، بدلا من ذلك ، فلاش تجميد في N₂ السائل وتخزين في-80 درجه مئوية. لتحلل ، أضف 2 مل من المخزن المؤقت 1 لكل طبق 15 سم في RT. استخدام مكشطه خليه لاسترداد جميع لست] في أنابيب الطرد المركزي المخروطية 50 ml (حجم النهائي حوالي 20 مل).
2. يتم فصلها ثلاث مرات لمده 30 ثانيه مفصوله وقفه دقيقه 1.
3. طارد الطرد المركزي لست] في 15,000 x g لمده 15 دقيقه.
4. نقل ماده طافي إلى أنبوب جديد باستخدام مصفاه الخلية (40 μm).
5. تحديد تركيز العينات وضبط ، إذا لزم الأمر ، للحصول علي نفس الكمية من البروتينات ونفس الحجم. استخدام كميه إجماليه من البروتين بين 50 و 100 ملغ (10 اطباق مع قطر 15 سم ل MiaPaCa-2 الخلايا).
6. أضافه Ni^{2 +}-الخرز NTA ، وذلك باستخدام 2 μl من الخرز لكل 1 ملغ من البروتين.
7. تدوير في 30 دوره في الدقيقة خلال 2.5 h في RT.
8. بيليه الخرز في 500 x g لمده 5 دقائق.
9. غسل الخرز مع 1 مل من المخزن المؤقت 1 ، ونقل العينات إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL ، ثم نقل الأنابيب علي الجليد. تنفيذ جميع الخطوات التالية علي الجليد أو في 4 درجه مئوية.
10. يغسل مرتين مع 1 مل من الجليد الباردة العازلة 2 تحتوي علي 10 مم ايميدازول.
11. إلى الوت ملزمه البروتينات ، أضافه 600 μl من العازلة 2 تحتوي علي 250 mM ايميدازول وتدوير ل 2 ح في 4 درجه مئوية.
12. بيليه الخرز بواسطة طرد في 500 x g لمده 1 دقيقه نقل supernatants إلى جديد ، قبل تبريد ، 1.5 mL أنابيب وأضافه 50 μl من مكافحه العلم M2 الأجسام المضادة الخرز مترافق.
13. تدوير في 30 دوره في الدقيقة ل 2.5 h في 4 درجه مئوية ، ثم يغسل 2 مرات مع 500 μL من المخزن المؤقت 2 ، ثم 2 مرات مع 500 μL من المخزن المؤقت 3.
14. للهلاك النهائي ، أضافه 100 μL من المخزن المؤقت 3 التي تحتوي علي الببتيد العلم في 0.1 ميكروغرام/μL وتدوير في 4 درجه مئوية ل 1.5 h.
15. أجهزه الطرد المركزي في 500 x g لمده 1 دقيقه ونقل supernatants إلى أنابيب جديده قبل تبريدها.
16. خذ 10 ٪ (10 μL) لتحميل علي SDS-الصفحة وأداء تلطيخ الفضة من هلام للسيطرة علي نوعيه تنقيه. إذا كان تنقيه تبدو جيده ، وتحليل 90 ٪ اليسار من قبل LC-MS/MS.

3-تجهيز بيانات قياس الطيف الكتلي لتوليد لمحات من Ub/Ubls PTMs وتحديد الاختلافات الكبيرة بينها

ملاحظه: النتائج من تحليل MS تحتوي علي العديد من المعلومات بما في ذلك العدد الإجمالي من الببتيدات ، فضلا عن القيم منطقه الذروة (يعني من اعلي 3 الببتيد منطقه¹⁰) لكل بروتين المحددة في كل عينات. يمكن معالجه هذه البيانات باستخدام أرقام عدد الببتيد أو قيم منطقه الذروة أو كليهما. لحساب مع مناطق الذروة ، لان هذه القيم عاده ما تكون في نطاق 10⁶، فمن الضروري تقسيمها بهذا الترتيب قبل تطبيق نفس الصيغ علي النحو التالي. وينبغي ان تظهر النتائج التي يتم الحصول عليها مع كل من منهجيات العد ارتباطا قويا كما هو الحال عاده. لكل بروتين محدد ، استخدم الصيغ التالية حيث:
القيم الببتيدات v1 في عينه اوبيكويتين غير المعالجة (علي سبيل المثال ، Ub-المخدرات)
v2 القيم الببتيدات في Gemcitabine معالجه العينة اوبيكويتين (علي سبيل المثال ، Ub + المخدرات)
القيم الببتيدات k1 في عينه gfp التحكم غير المعالجة (علي سبيل المثال ، gfp-المخدرات)
القيم الببتيدات k2 في Gemcitabine معالجه عينه gfp التحكم (علي سبيل المثال ، gfp + المخدرات).

1. التطبيع: تطبيع القيم بين الخلايا المعالجة بالمخدرات والخلايا غير المعالجة ل اوبيكويتين و GFP باستخدام الصيغ التالية. تطبيع v = V وتطبيع k = K.
   V1 = v1. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v1) ؛ V2 = v2. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v2)
   K1 = k1. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ k1) ؛ K2 = k2. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ k2)
2. أزاله الخلفية: باستخدام الصيغ التالية ، اطرح القيم في نموذج التحكم (GFP) من القيم في نموذج اوبيكويتين للحصول علي قيم معينه (V ' 1 و V ' 2) لكل بروتين تم تحديده في كلا الحالتين.
   V ' 1 = V1-K1 إذا V1-K1 ≥ 0; V ' 1 = 0 إذا V1-K1 < 0
   V ' 2 = V2-K2 إذا V2-K2 ≥ 0; V ' 2 = 0 إذا V2-K2 < 0
3. الاختلاف (Var) من اوبيتاميويشن. للحصول علي درجه (بين-100 و + 100) للتغيرات الايجابيه والسلبية من PTMs الناجمة عن المخدرات ، استخدم الصيغة التالية التي يقسم الفرق بين قيم معينه من العينات المعالجة وغير المعالجة بمجموع جميع القيم ، بما في ذلك تلك الموجودة في السيطرة (لمعاقبه البروتينات التي حددت أيضا في السيطرة GFP) ، وتتضاعف ب100.
   Var = (V'2-V ' 1)/(V1 + K1 + V2 + K2) * 100 ؛ -100 < Var < 100 ؛
   الاختلافات أدناه-50 (قمع PTM) أو أعلاه 50 (التعريفي PTM) وعاده ما تعتبر كبيره.
4. الثقة (Conf). استخدم الصيغة التالية للحصول علي قيمه ثقة بين 0 و 100% ،:
   Conf = ((V1 + V2)²/(1 + V1 + V2 + K1 + K2)²) * 100-100/(1 + V ' 1 + v ' 2) ؛ = 0 إذا < 0
   القيم المذكورة أعلاه 50 عاده ما تعتبر واثقه.
5. للحصول علي توزيع الطف من قيم الاستقراء/القمع والنظر في كل من الاختلاف والثقة المعلمات ، ضرب Var و conf القيم باستخدام الصيغة التالية حيث V Var و C conf
   = SI (V2 > 0; (V2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6); (V2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6))
   ملاحظه: كما قيم منطقه الذروة عاده أكثر دقه من العد الببتيد ، فمن الممكن استخدام برامج معينه والتي هي مكرسه لتفسير هذا النوع من البيانات مثل ساوس (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus) ، بعد توصيات الاستخدام.

النتائج

توصيل خلايا الثدييات الثقافية لإنشاء خلايا GFP و 6HF-Ub التي تعبر عن
لإنتاج لينتيفيروسيس التي سيتم استخدامها في وقت لاحق إلى transduce MiaPaCa-2 الخلايا ، 70 ٪ متموج يشيك-293T الخلايا هي المشتركة مع كميه متساوية من المتجات الثلاثة ، Pكونتيننت-6HF-اوبيكويتين أو GFP/دلتا-المساعد/pvSv...

Discussion

لقد وضعنا منهجيه قويه وموثوق بها لتوليد لمحات من البروتينات التي تم تعديلها من قبل أعضاء الاسره الرئيسية اوبيكويتين. في الواقع ، لقد نجحنا في تطبيق هذا البروتوكول لتوليد لمحات من PTMs من قبل اوبيكويتين ، وأيضا من قبل السومو و Nedd8 ، وللكشف عن التعديلات المرتبطة بالعلاج⁷، استجابه ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag