خلايا بروجكتور التاجية والمؤشرات الحيوية القابلة للذوبان في تشخيص القلب والأوعية الدموية بعد رأب الأوعية التاجية

Summary

يتأثر تطور الأحداث القلبية الوعائية السلبية الرئيسية ، والتي تؤثر على تشخيص القلب والأوعية الدموية بعد رأب الأوعية التاجية ، بمدى الضرر التاجي وإصلاح الأوعية الدموية. استخدام المؤشرات الحيوية الخلوية التاجية وقابلة للذوبان جديدة، رد الفعل على تلف الأوعية الدموية وإصلاحها، هي مفيدة للتنبؤ تطور MACEs والتكهن.

Abstract

تؤثر الأحداث القلبية الوعائية السلبية الرئيسية (MACEs) سلبًا على تشخيص القلب والأوعية الدموية للمرضى الذين يخضعون لعملية رأب الأوعية التاجية بسبب الإصابة الإقفارية التاجية. مدى الضرر التاجي وآليات إصلاح الأوعية الدموية هي العوامل التي تؤثر على التنمية المستقبلية للMACEs. وقد أظهرت السمات الوعائية الجوهرية مثل خصائص البلاك وتعقيد الشريان التاجي معلومات التكهن لMACEs. ومع ذلك، فقد افترض أن استخدام المؤشرات الحيوية المتداولة داخل الرسياق ة هو طريقة ملائمة للتحديد المبكر للأجهزة النشطة الماسية وتشخيصها، لأنها تعكس على نحو أوثق الآليات الدينامية التي تنطوي على تلف الشريان التاجي وإصلاحه. تحديد المؤشرات الحيوية المتداولة التاجية أثناء رأب الأوعية ، مثل عدد الفئات السكانية الفرعية من خلايا السلف أحادية النواة (MPCs) ، وكذلك تركيز الجزيئات القابلة للذوبان التي تعكس الالتهاب ، التصاق الخلية ، وإصلاحها ، يسمح تقييم التطورات المستقبلية وتشخيص MACEs 6 أشهر بعد رأب الأوعية التاجية. وتبرز هذه الطريقة من خلال طبيعتها الانتقالية وأداء أفضل من الدم المحيطي المتداول المؤشرات الحيوية فيما يتعلق بالتنبؤ بالمواد الماسية وتأثير ذلك على تشخيص القلب والأوعية الدموية، والتي يمكن تطبيقها على مخاطر تقسيم المرضى مع مرض الشريان التاجي يخضع لعملية رأب الأوعية.

Introduction

تمثل رأب الأوعية التاجية والدعامات إجراء ً إنقاذًا للمرضى الذين يعانون من مرض الشريان التاجي (CAD). ومع ذلك، قد تحدث الأحداث القلبية الوعائية السلبية الرئيسية (MACEs)، بما في ذلك موت القلب والأوعية الدموية، واحتشاء عضلة القلب، والإصابة باضطراب الشريان التاجي، ونوبات الذبحة الصدرية أو عدم تعويض فشل القلب، بعد أشهر من التدخل التاجي، مما يؤدي إلى زيارات غير مقررة إلى المستشفى. الـ "مايس" شائعة في جميع أنحاء العالم ومعدل وفياتهم الـ(morbi) مرتفع¹.

الإصابة التاجية الدماغية يحفز استجابة الأوعية الدموية في وقت مبكر وآليات التعويض التي تنطوي على تعبئة MPCs بسبب قدرتها التمايز و / أو قدرة الانجيو - الانعكاسي، فضلا عن إنتاج جزيئات قابلة للذوبان مثل جزيئات الالتصاق بين الخلايا (ICAMs)، مصفوفة metalloproteinases (MMPs)، وأنواع الأكسجين التفاعلية، مما يعكس التصاق الخلية، وإعادة عرض الأنسجة، والإجهاد التأكسدي. على الرغم من أن السمات الوعائية الجوهرية مثل خصائص البلاك وتعقيد الشريان التاجي قد استخدمت للتنبؤ MACEs، وقد اقترحت بعض الدراسات أن المؤشرات الحيوية المتعلقة بآليات الإصابة والإصلاح التي تحدث في بطانة الشريان التاجي يمكن أن تكون مفيدة جدا لتحديد وتشخيص المبكر للأحداث القلب والأوعية الدموية في المرضى الذين يعانون من CAD المقدمة إلى رأب الأوعية التاجية^2،3،4،5.

وقد حفز الاهتمام المستمر في فهم الآليات الكامنة وراء إصابة كاد وإصلاح المحققين لدراسة المؤشرات الحيوية تعميم داخل التاجية، وذلك لأن أخذ العينات التاجية أكثر عن كثب يعكس تلف الأوعية الدموية وإصلاح⁶. ومع ذلك ، فإن توصيف المؤشرات الحيوية التاجية في الدراسات البشرية كان نادرًا^7،8،9. ولذلك، كان الغرض من هذه الدراسة لوصف طريقة لتحديد كمية MPCs تعميم التاجية والجزيئات القابلة للذوبان، مما يعكس كل من إصابة الأوعية الدموية وإصلاحها، وتبين ما إذا كانت هذه المؤشرات الحيوية ترتبط مع MACEs والتشخيص السريري لمرضى CAD التي خضعت لعملية رأب الأوعية التاجية. وتستند هذه الطريقة إلى استخدام مراكز إدارة الأنسجة المتعددة المؤشرات والمواد المتعددة المؤشرات والجزيئات القابلة للذوبان التي يتم الحصول عليها عن طريق مواقع أخذ العينات الأقرب إلى تلف السفينة. قد يكون مفيدًا أيضًا للدراسات السريرية لنقص التروية في الأطراف السفلية ، والسكتة الدماغية ، والتهاب الأوعية الدموية ، والتجلط الوريدي ، وغيرها من الإصابات التي تنطوي على إصابة الأوعية الدموية وإصلاحها.

Protocol

ويلبي هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية المؤسسية الواردة في لجنة أخلاقيات البحوث البشرية.

1. تصوير الأوعية التاجية، الموجات فوق الصوتية، وأخذ عينات الدم

1. طلب معلومات سريرية وديموغرافية أساسية قبل التدخل التاجي. جمع بيانات الفرد: العمر والجنس وحالة التدخين الحالية ومؤشر كتلة الجسم (BMI) وارتفاع ضغط الدم وdyslipidemia ومرض السكري والأدوية ، والإشارة إلى تصوير الأوعية التاجية الحالي.
2. إجراء تصوير الأوعية التاجية من خلال قسطرة القلب باستخدام نهج شعاعي. يجب إجراء هذا الإجراء تحت دليل تنظير الفلور في غرفة الهيموديناميك من قبل أطباء القلب الخبراء.
   ملاحظة: تحديد السفن القيمة. بالنسبة لهذه الدراسة، تم تعريف الأوعية القيّمة على أنها شرايين ذات أقسام أكبر من 1.5 مم وتنسل التجويف أكثر من 50٪.
3. تقدم القسطرة الموجات فوق الصوتية داخل الأوعية الدموية إلى المنطقة ذات الاهتمام وتسجيل الصور. استخدام البرمجيات المناسبة لتحديد وقياس أصغر منطقة مضيئة.
4. استخدم قسطرة تاجية لجمع 10 مل من الدم من أقرب موقع إلى البلاك.
5. بعد خروج المريض، قم بجدولة التقييمات الطبية الدورية لمتابعة نقاط نهاية الدراسة. إذا تعذر الاتصال الهاتفي أو تأخرت زيارة الطبيب لأكثر من شهرين، اطلب من شخص معتمد (تم تصميمه مسبقًا) التحقق من نقاط نهاية الدراسة.
   ملاحظة: النظر في أي من ما يلي MACE: 1) وفاة القلب والأوعية الدموية، 2) احتشاء عضلة القلب جديدة، 3) الذبحة الصدرية غير المستقرة مما دفع زيارة طبية غير مقررة في غضون 24 ساعة، 4) الدعامة كما يتضح من تصوير الأوعية التاجية، 5) حلقات من decompensateed فشل القلب التي تتطلب الاهتمام السريري.

2. تحديد MPCs المتداولة(الشكل 2)

1. معالجة الدم في غضون 1 ساعة من جمع. نقل 6 مل من الدم الذي تم جمعه إلى أنبوب مخروطي 15 مل وتمييع 1:1 (v/v) مع 1x الفوسفات المالحة العازلة (PBS)، درجة الحموضة = 7.4.
2. أضف 2 مل من متوسط تدرج الكثافة إلى ثلاثة أنابيب اختبار. نقل بعناية ثلاثة aliquots حجم متساو من الدم المخفف في كل أنبوب اختبار يحتوي على متوسط التدرج الكثافة.
   ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي للكثافة المتوسطة التدرج ية والدم المخفف ثلاثة أرباع القدرة القصوى لأنبوب الاختبار.
3. الطرد المركزي في 1800 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة نقل الفرقة في واجهة بين الطبقات إلى أنبوب جديد. إضافة 2 مل من PBS والطرد المركزي في 1800 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 6 دقيقة. سوف بيليه تحتوي على MPCs.
4. غسل بيليه عدة مرات. استشير قبالة الحل السابق وبلطف إعادة تعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني جديد. بالنسبة للعمليات اللاحقة، جهاز الطرد المركزي عند 1800 × ز، 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين. كرر العملية 6x.
5. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني. مزيج 20 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 0.4٪ trypan الأزرق، مخففة 1:1 (v/v). تطبيق قطرة على مقياس الهيموكيتومتر وحساب الخلايا غير الملطخة تحت المجهر الخفيف.
6. انتقل إلى تحديد MPCs. تسمية 5 مل تدفق أنابيب القياس الخلايا وaliquot من 1 × 10⁶ خلايا لكل أنبوب. إعداد الأجسام المضادة للتحكم المطابق للتحكم المتطابقة مع isotype. الطرد المركزي في 1800 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 6 دقيقة وتجاهل supernatant.
7. أضف الجسم المضاد الأولي المخفف في 100 ميكرولتر من محلول حضانة الأجسام المضادة يتكون من 1x PBS (درجة الحموضة = 7.4) ، 2 mM حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ، و0.05٪ من الزلال المصل البقري (BSA). إعادة تعليق لمدة 10 ق واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية، وخفيفة المحمية. قد يكون البروتوكول مؤقتا في هذه الخطوة عن طريق تحديد الخلايا الليمفاوية في 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني وتخزين عينات تصل إلى 24 ساعة في 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: كانت التركيزات النهائية للأجسام المضادة الأولية المستخدمة في البروتوكول الحالي CD45 1:50، CD34 1:20، KDR 1:50، CD184 1:20، CD133 1:50.
8. الطرد المركزي في 1800 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة والتخلص من supernatant. إعادة تعليق في 500 ميكرولتر من 1x PBS (درجة الحموضة = 7.4)، 2 MM EDTA.
9. إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. استخدم الأجسام المضادة للتحكم المتطابقة مع المطابقة مع isotype لإعداد تلطيخ الخلفية. ثم، حدد الخلايا الليمفاوية تنتشر في مؤامرة FSC / SSC، في محاولة لاستبعاد الحبيبات المتبقية، والحطام الخلوي، والجسيمات الأخرى، والتي تقع عادة في الأسفل، اليسار وزعت في المؤامرة. ويعتبر هذا التوزيع بنسبة 100 في المائة.
10. استخدام بوابة تحتوي على عدد كبير من الخلايا مع النمط المناعي المشترك CD45⁺ و CD34⁺. لأنماط المناعة الإيجابية المزدوجة، استخدم بوابة تحدد سابقا CD45⁺، CD34⁺، مع إضافة إما KDR (VEGFR-2)⁺، CD133⁺، أو CD184⁺. تحديد التجمعات الفرعية للجنة السياسة النقدية من خلال علامات سطح الخلية المحددة الخاصة بها. الإبلاغ عن النسبة المئوية للأحداث المسورة.
11. تحديد الفئات السكانية الفرعية الرئيسية للمراكز الاستراتيجية. في هذه الدراسة كانت أنواع المناعة الرئيسية CD45⁺CD34⁺CD133⁺، CD45⁺CD34⁺CD184⁺CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺، CD45⁺CD34 +CD34⁺CD34 + CD34 + CD34⁺CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CDDR + CD184.
    ملاحظة: كانت علامات سطح الخلية المستخدمة CD45 (الخلايا الليمفاوية)، CD34 (الخلايا البطانة و/أو الأوعية الدموية)، KDR (VEGFR-2، علامة غشاء الخلايا البطانة)، CD133 (الخلايا السلف البطانة)، وCD184 (الخلايا الجذعية الدموية والخلايا البطانة).

3. تحديد المؤشرات الحيوية للذوبان البلازما

1. استخدم جهاز ًا مناعيًا مرتبطًا بالإنزيم (ELISA) لتحديد تركيز SICAM-1 و MMP-9(الشكل 3، الصف العلوي).
   1. الطرد المركزي عينات الدم في 3000 × ز، ودرجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة وجمع البلازما.
   2. تسمية المعايير، وأنابيب العينة، وأنابيب التحكم. اربط الآبار المغلفة مسبقًا في لوحة العرافة عن طريق غسل 2x مع مخزن الغسيل المنصوص عليه في مجموعة ELISA.
   3. نقل المعايير والعينات والضوابط إلى الآبار. ختم واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
      ملاحظة: لا تدع الآبار تجف تماما.
   4. تجاهل المحتويات وإضافة الأجسام المضادة للكشف عن البيوتين. ختم واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
   5. تجاهل المحتويات وغسل 3x. ختم البلاك واحتضان بالتتابع مع حل العمل ستربتافيدين تليها الركيزة tetramethylbenzidine في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، والضوء المحمية. غسل 3x بين الحاضنات. عندما يتطور اللون، أضف حل الإيقاف، واقرأ امتصاص الكثافة البصرية في قارئ ELISA بلوحة دقيقة.
2. استخدم مُقايسة متعددة المكونات المغناطيسية للتحديد على تركيز عامل نخر الورم ألفا (TNFα) وinterleukin 1 بيتا (IL-1β)(الشكل 3،الصف السفلي).
   1. تسمية المعايير، وأنابيب العينة، وأنابيب التحكم.
   2. دوامة قوارير الخرز المغناطيسي لمدة 30 s. نقل تعليق حبة إلى أنابيب الحجم المناسب، ومن ثم إلى الآبار في لوحة اختبار متعددة. دوامة دورية يتجنب هطول الأمطار من الخرز.
   3. أدخل بشكل آمن المعقم المغناطيسي للصفيحة اليدوية. الانتظار 2 دقيقة للحبات تتراكم على الجزء السفلي من كل بئر وقلب بسرعة كل من الغسيل لوحة المغناطيسي باليد والتجميع لوحة، على بالوعة أو حاوية النفايات. تذكر استخدام الصحن المغناطيسي باليد السّاكر داخل الآبار.
   4. إضافة 150 ميكرولتر من العازلة غسل في كل بئر وانتظر 30 ق للسماح للحبات تتراكم في الجزء السفلي. تجاهل المحتويات كما في الخطوة 3.2.3. ثم أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص العالمي (المنصوص عليه في المجموعة) متبوعاً بـ 25 ميكرولتر من المعايير المعدة والعينات والضوابط.
   5. ختم لوحة واحتضان لمدة 60 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة، والضوء المحمية، مع اهتزاز مستمر في 500 دورة في الدقيقة. بدلا من ذلك، احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، والضوء المحمية، مع اهتزاز مستمر في 500 دورة في الدقيقة إذا كان ذلك ممكنا.
   6. غسل 2x عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من العازلة غسل وانتظر 30 s. تجاهل محتويات عن طريق إدراج غسالة لوحة مغناطيسية باليد. الانتظار 2 دقيقة وعكس أكثر من بالوعة أو حاوية النفايات.
   7. احتضان بالتتابع مع 25 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة للكشف متبوعاً بـ 25 ميكرولتر من محلول ستريبتفيفيالدين-PE في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، مختومة ومحمية بالضوء، مع اهتزاز مستمر عند 500 دورة في الدقيقة. غسل 2x بين الحاضنات، كما هو موضح في الخطوة 3.2.6.
   8. الحصول على القراءات. إضافة 120 ميكرولتر من ذاكرة القراءة المؤقتة. ختم لوحة واحتضان 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والضوء المحمية، مع اهتزاز مستمر في 500 دورة في الدقيقة. تشغيل القراءة على قارئ معين متعدد الإرسال. ضبط معلمات القراءة وفقا لكل analyte.

النتائج

تم جمع الشريان التاجي والجيوب الأنفية والوريد والدم المحيطي من 52 مريضًا خضعوا لتصوير الأوعية التاجية(الشكل 1)وأظهر وارتفعت نسبة انتشار ارتفاع ضغط الدم وdyslipidemia. في المتابعة السريرية، 11 (21.1%) حدث MACEs بعد 6 أشهر من تصوير الأوعية التاجية: الوفاة (n = 1) ، والذبحة ا...

Discussion

قد يكون جمع الدم من الشريان التاجي المصاب أمرًا صعبًا. في بعض الأحيان، الشريان التاجي بالكاد يمكن الوصول إليها. في هذه الحالة ، قد يكون أخذ العينات من الجيوب الأنفية الوفيدية بديلاً. قمنا بإجراء اختبارات التحقق من الصحة مقارنة المؤشرات الحيوية المتداولة في الشريان التاجي مقابل الجيوب الأ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm