المضادات الحيوية Dereplication باستخدام منصة مقاومه المضادات الحيوية

Summary

نحن وصف منصة التي تستخدم مكتبه من المضادات الحيوية القولونية المقاومة للمضادات الحيوية للحصول علي dereplication من المضادات. يمكن استنتاج هويه المضادات الحيوية التي تنتجها البكتيريا أو الفطريات من خلال نمو e. كولاي التي تعبر عن جين المقاومة الخاصة بها. وهذه المنصة فعاله اقتصاديا وذات كفاءه زمنيه.

Abstract

واحده من التحديات الرئيسية في البحث عن المضادات الحيوية الجديدة من مقتطفات المنتجات الطبيعية هو أعاده اكتشاف المركبات المشتركة. للتصدي لهذا التحدي ، يتم تنفيذ dereplication ، وهي عمليه تحديد المركبات المعروفة ، علي عينات من الفائدة. وأساليب الفصل بين الطرق ، مثل الانفصال التحليلي الذي يعقبه قياس الطيف الكتلي ، تستغرق وقتا طويلا وتستهلك الموارد بكثافة. لتحسين عمليه dereplication ، قمنا بتطوير منصة مقاومه المضادات الحيوية (ARP). و ARP هي مكتبه من حوالي 100 الجينات مقاومه المضادات الحيوية التي تم استنساخها بشكل فردي في القولونية. هذه المجموعة سلاله لديها العديد من التطبيقات ، بما في ذلك وسيله فعاله من حيث التكلفة وطريقه سهل لdereplication المضادات الحيوية. وتنطوي هذه العملية علي تخمير الميكروبات المنتجة للمضادات الحيوية علي سطح اطباق بتري المستطيلة التي تحتوي علي وسط صلب ، مما يسمح بإفراز ونشر نواتج الأيض الثانوية من خلال الوسط. بعد فتره التخمير 6 أيام, يتم أزاله الكتلة الحيوية الميكروبية, ويضاف أجار رقيقه تراكب إلى طبق بيتري لخلق سطح أملس وتمكين نمو سلالات المؤشر e. كولاي . ثم يتم تثبيت مجموعتنا من سلالات ARP علي سطح طبق بيتري الذي يحتوي علي المضادات الحيوية. يتم احتضان اللوحة التالية بين عشيه وضحيها للسماح للنمو e. كولاي علي سطح التراكب. فقط السلالات التي تحتوي علي مقاومه للمضادات حيوية معينه (أو فئة) تنمو علي هذا السطح مما يتيح التعرف السريع علي المجمع المنتج. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح للتعرف علي منتجي المضادات الحيوية المعروفة وكوسيلة للتعرف علي تلك التي تنتج المركبات الجديدة.

Introduction

منذ اكتشاف البنسلين في 1928 ، أثبتت المنتجات الطبيعية المستمدة من الكائنات المجهرية البيئية انها مصدر غني للمركبات المضادة للميكروبات¹. وتستمد حوالي 80 ٪ من المضادات الحيوية المنتجات الطبيعية من البكتيريا من جنس العقديات وغيرها من الاكاكتيميتيز ، في حين يتم إنتاج 20 ٪ المتبقية من الأنواع الفطرية¹. بعض السقالات المضادات الحيوية الأكثر شيوعا المستخدمة في العيادة مثل β-اكتام, التتراسيكلين, rifamycins, و الامينوغليكوسيدس, كانت في الأصل معزولة عن الميكروبات². ومع ذلك ، نظرا لارتفاع البكتيريا المقاومة للادويه المتعددة ، أصبحت اللوحة الحالية من المضادات الحيوية اقل فعاليه في العلاج^3،4. وتشمل هذه العوامل المسببة للامراض "ESKAPE" (اي ، فانكوميسين مقاومه المكورات المعوية والمكورات العنقوديةالذهبية المقاومة للاكتام ، klebsiella الرئوية، الزائفة الزنجاريه، والانتيفه باومانيي، و المعوية sp.) ، وهي مجموعه فرعيه من البكتيريا التي تعتبر مرتبطة باعلي المخاطر من قبل عدد من السلطات الصحية العامة الرئيسية مثل منظمه الصحة العالمية^3،4،5. ظهور وانتشار العالمي لهذه الممرضات المدرة للادويه يؤدي إلى حاجه مستمرة للمضادات الحيوية رواية^3,4,5. ومما يؤسف له ان العقدين الماضيين اثبتا ان اكتشاف المضادات الحيوية الجديدة من المصادر الميكروبية يزداد صعوبة⁶. وتشمل النهج الحالية لاكتشاف المخدرات الفحص عاليه الانتاجيه للمركبات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك المنتجات الطبيعية المكتبات استخراج ، مما يسمح للاف من مقتطفات ليتم اختبارها في وقت معين². ومع ذلك ، وبمجرد الكشف عن النشاط المضاد للميكروبات ، فان الخطوة التالية هي تحليل محتويات مستخرج الخام لتحديد المكون النشط والقضاء علي تلك التي تحتوي علي مركبات معروفه أو زائده عن الحاجة^7،8. هذه العملية ، التي يشار اليها باسم dereplication ، أمر حيوي لمنع و/أو خفض كبير في الوقت المستغرق في أعاده اكتشاف المضادات الحيوية المعروفة^7،9. علي الرغم من ان خطوه ضرورية في اكتشاف المخدرات المنتج الطبيعي ، dereplication المعروف شاقه وكثيفه الموارد¹⁰.

من اي وقت مضي منذ beutler et al. أولا صاغ مصطلح "dereplication" ، بذلت جهود واسعه لوضع استراتيجيات مبتكره للتعرف السريع علي المضادات الحيوية المعروفة^11،12. اليوم الاداات الأكثر شيوعا المستخدمة في dereplication تشمل النظم التحليلية الكروماتوغرافي مثل اللوني السائل عاليه الأداء ، والطيف الكتلي ، والنووية الرنين المغناطيسي القائم علي طرق الكشف^11،13. ومن المؤسف ان كلا من هذه الأساليب يتطلب استخدام معدات تحليليه باهظه التكاليف وتفسيرات متطورة للبيانات.

في محاولة لتطوير طريقه dereplication التي يمكن تنفيذها بسرعة دون المعدات المتخصصة ، انشانا منصة مقاومه المضادات الحيوية (ARP)¹⁰. يمكن استخدام ARP لاكتشاف المواد المضادة للمضادات الحيوية ، وتنميط مركبات المضادات الحيوية الجديدة ضد أليات المقاومة المعروفة ، و dereplication من المضادات الحيوية المعروفة في مقتطفات مشتقه من البكتيريا المخاطية والميكروبات الأخرى. هنا ، ونحن نركز علي تطبيقه في dereplication المضادات الحيوية. يستخدم ARP مكتبه من سلالات القولونية ايزوسيكيا التي تعبر عن جينات المقاومة الفردية التي تكون فعاله ضد المضادات الحيوية الأكثر شيوعا أعاده اكتشاف^14,15. عندما تزرع مكتبه e. القولونية في وجود كائن ثانوي المنتجة المستقلب, يمكن استنتاج هويه المجمع عن طريق نمو السلالات e. القولونية التي تعبر عن الجينات المقاومة المرتبطة بها¹⁰. عندما تم الإبلاغ عن ARP لأول مره ، كانت المكتبة تتكون من > 40 جينات تمنح مقاومه لفئات المضادات الحيوية 16. تم تصميم قالب dereplication الأصلي لتشمل مجموعه فرعيه من جينات المقاومة لكل فئة المضادات الحيوية لتوفير المعلومات المتعلقة بالمضادات الحيوية فئة فرعيه خلال عمليه dereplication. اليوم ، يتكون ARP من > 90 الجينات التي تمنح مقاومه لفئات المضادات الحيوية 18. باستخدام لدينا مجموعه واسعه من الجينات المقاومة ، وقد تم تطوير قالب dereplication الثانوية ويعرف باسم منصة مقاومه المضادات الحيوية الحد الأدنى (MARP). تم إنشاء هذا القالب للقضاء علي التكرار الجيني وببساطه توفير المعلومات المتعلقة بفئة المضادات الحيوية العامة التي ترتبط المستقلب dereplicated. بالاضافه إلى ذلك ، فان قالب MARP تمتلك كل من النوع البري وسلاله القصور الفائقة/efflux من e. كولاي BW25113 (e. كولاي BW25113 ΔbambΔtolc)، مقارنه بالتجسيد الأصلي لل ARP ، والتي فقط يستخدم سلاله فرط نفاذيه. هذا الجانب فريدة من نوعها يخلق الأنماط الظاهرية اضافيه اثناء dereplication ، مما يدل علي قدره المركبات لعبور الغشاء الخارجي للبكتيريا سلبيه الجرام. هنا ، ونحن وصف بروتوكول قويه ليتم اتباعها عند المراوغة مع اما ARP و/أو MARP ، تسليط الضوء علي الخطوات الأكثر اهميه لاتباعها ، ومناقشه مختلف النتائج الممكنة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. اعداد المكتبة القولونية الأسهم الجلسرين (من أجار slants)

1. خط السلالات ARP/MARP e. القولونية من مرق lysogeny (LB) أجار التعرجات علي اطباق بيتري التي تحتوي علي أجار LB وعلامة اختيار المناسبة (الجدول 1).
2. اعداد الثقافات لكل من سلالات e. القولونية عن طريق تطعيم 3 مل من LB تحتوي علي علامة اختيار المناسبة مع مستعمره واحده. تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع التهوية (250 دوره في الدقيقة).
3. الجمع بين 800 μL من الثقافة و 200 μL من الجلسرين 80 ٪ معقمه في كريوفيال 1.8 mL. مزيج من خلال عكس الأنابيب 3 − 4 مرات ، وتخزين في-80 درجه مئوية.

2. ARP/MARP المجمدة اعداد لوحه مكتبه الأوراق المالية

1. خط السلالات ARP/MARP من الأسهم الجلسرين التي أعدت في القسم 1 علي مجموعه جديده من اطباق بيتري التي تحتوي علي أجار LB وعلامة اختيار المناسبة. تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
2. باستخدام تقنيه العقيم ، ماصه 500 μL من الموجبة المعدلة مرق مولر هينتون (MHB) من خزان معقم في كل بئر من العقيمة 96 صفيحه بئر عميقة.
3. مع لوحات أعدت في الخطوة 2.1 ، استخدم عصا قضيب لتطعيم صفيحه البئر العميقة 96 وفقا لخريطة ARP/MARP (الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2). تاكد من أضافه علامة اختيار المناسبة لكل بئر. وضع غشاء الختم تنفس علي سطح لوحه البئر العميقة واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية (250 دوره في الدقيقة).
4. تاكد من عدم وجود ابار ملوثه بالاشاره إلى خريطة ARP/MARP. كرر إذا كانت ملوثه. باستخدام pipettor متعدد القناات ، نقل 100 μL من كل بئر من لوحه البئر العميق إلى لوحه القاع العقيمة 96-بئر الجولة. كرر هذه الخطوة لإنشاء العديد من لوحات مكتبه الأسهم المجمدة.
   ملاحظه: فمن الأفضل لاعداد ما لا يقل عن 5 لوحات مكتبه في وقت للحفاظ علي من تكرار الخطوات 2.1 − 2.4 في حاله التلوث لوحه مكتبه الأوراق المالية المجمدة.
5. الانتهاء من جعل ARP/MARP المجمدة لوحات مكتبه الأوراق المالية عن طريق التنضيد 100 μL من معقمه 50 ٪ الجلسرين في كل بئر ومزيج من الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا.
6. تغطيه لوحات مع الأختام ألومنيوم المعقمة وضمان ان كل بئر مختومه بشكل فردي.
7. عدد لوحات وتكريس واحد فقط المجمدة لوحه مكتبه الأوراق المالية لتطعيم قوالب جديده في وقت معين. الحفاظ علي الباقي كما النسخ الاحتياطي في حاله التلوث لوحه مكتبه الأوراق المالية المجمدة.
8. وضع غطاء لوحه علي راس ختم ألومنيوم وتخزين في-80 درجه مئوية.

3. البذور الثقافة واعداد لوحه Dereplication

1. باستخدام عصا قضيب ، تطعيم 3 مل من العقديات المضادات الحيوية المتوسطة (SAM) (أو المتوسطة المناسبة الأخرى للكائن الذي يجري اختباره) في أنبوب اختبار يحتوي علي حبه زجاجيه معقمه واحده (لتفتيت mycelium) مع سلاله المنتجة التي هي ان تكون [دربلاتيد]. بالنسبة للعقديات ، كشط الجراثيم برفق من سطح المستعمرة.
2. باستخدام نفس عصا القضيب الخشبية ، والسيطرة علي العقم علي طبق بيتري التي تحتوي علي أجار بينيت.
3. احتضان ثقافة البذور في 30 درجه مئوية مع التهوية لمده 6 أيام (250 دوره في الدقيقة) واحتضان لوحه التحكم في العقم في 30 درجه مئوية لمده 6 أيام.
   ملاحظه: يرجى الرجوع إلى الجدول 2 للحصول علي وصفات إعلاميه ل SAM و بينيت. التعليمات المذكورة أعلاه هي مناسبه لمعظم الاكاكتيميتيز. تغيير وسائل الاعلام النمو حسب الضرورة لغيرها من البكتيريا والفطريات.
4. اعداد لوحات dereplication عن طريق شفط 23 مل من أجار بينيت الدافئة في ماصه المصلية والاستغناء 20 مل بالتساوي عبر سطح طبق بيتري مستطيله (جدول المواد) ، تاركا ما تبقي من المتوسطة في الماصة لمنع تشكيل فقاعه الهواء.
   ملاحظه: تاكد من ان السطح المستخدمة لصب لوحات هو مستوي وتنفيذ هذه الخطوة قبل أجار قد يبرد كثيرا; سطح مستو أمر حتمي لتثبيت المكتبة في المراحل التالية.
5. قم بتدوير الصفيحة برفق حتى تغطي الوسط جميع مناطق الصفيحة ولا تزعجها حتى يتم ضبط أجارها تماما.
6. اعداد صفائح غشاء النيتروسليلوز (جدول المواد) باستخدام غطاء طبق بيتري مستطيل كقالب تتبع بحيث تناسب الأوراق سطح لوحه dereplication. قطع الأوراق والاوتوكلاف لهم في الحقيبة المعقمة.
   ملاحظه: يسمح هذا الغشاء للكائنات الحية للرياضية علي سطحه ، في حين قد تفرز نواتج الأيض الثانوية في الوسط أدناه. مره واحده نمت ، يتم أزاله الغشاء لتوفير سطح نظيف لdereplication. الأكثر ملاءمة ان ورقه غشاء لديه علي سطح أجار بينيت ، والأنظف نتيجة dereplication.
7. تحقق من لوحه التحكم في العقم للتاكد من عدم وجود ملوثات بعد 6 أيام من الحضانة. إذا كانت خاليه من التلوث ، وأزاله غطاء طبق بيتري مستطيله وماصه 200 μL من ثقافة البذور علي سطح أجار بينيت.
8. نشر الثقافة بالتساوي عبر سطح اللوحة بأكملها باستخدام مسحه قطنية معقمه.
9. وضع غشاء النيتروسليلوز أعدت في الخطوة 3.6 علي قمة الثقافة علي سطح طبق بيتري. تبدا من خلال محاذاة الحافة السفلية من الغشاء إلى الحافة السفلية من طبق بيتري ، وتطبيق ببطء الغشاء من الحافة السفلية إلى الحافة العليا من لوحه.
10. استخدام مسحه قطنية معقمه لتخفيف اي فقاعات الهواء التي قد تكون شكلت بين واجهه أجار الغشاء ، وضمان ان الغشاء هو تدفق إلى أجار.
11. وضع الغطاء مره أخرى علي صحن بيتري مستطيله ووضعه راسا علي عقب في كيس من البلاستيك مختومه. احتضان عند 30 درجه مئوية لمده 6 أيام.

4. dereplication لوحه MHB تراكب و ARP/MARP مكتبه اعداد اللوحة

1. بعد 6 أيام ، وأزاله لوحه dereplication من الحاضنة 30 درجه مئوية. باستخدام ملاقط معقمه (الاوتوكلاف أو رش جيدا مع 70 ٪ الايثانول) ، وأزاله بعناية غشاء النيتروسليلوز من سطح أجار بينيت.
   ملاحظه: هذه الخطوة سوف أزاله الجراثيم مسعور ونميت ميسليا علي سطح الغشاء لتوفير سطح نظيف لdereplication ، وتسهيل الخطوة 4.2.
2. كما هو موضح للخطوة 3.4 ، وضمان سطح العمل هو مستوي واستخدام ماصه المصلية ليستنشق 23 مل من الموجبة الدافئة أجار MHB المعدلة. إنشاء تراكب عن طريق الاستغناء عن 20 مل بالتساوي عبر سطح لوحه dereplication ، وترك ما تبقي من المتوسطة في ماصه لمنع تشكيل فقاعه الهواء.
3. قم بتدوير الصفيحة برفق حتى تغطي الوسط جميع المناطق ولا تزعجها حتى يتم ضبط أجارها تماما. مره واحده تبريدها وعززت ، والعودة لوحه dereplication إلى كيس من البلاستيك مختومه وتخزينها علي الراس في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
   ملاحظه: تسمح هذه الخطوة لنشر نواتج الأيض الثانوية من المتوسطة بينيت المخمرة في تراكب أجار MHB. إذا لم يتم اعداد غشاء النيتروسليلوز بشكل صحيح سيكون هناك نمو بوغ حول حواف لوحه ، والتي لديها خصائص مسعور ان صد أجار mhb. لا تصب التراكب فوق هذه الجراثيم لأنه يمكن ان يؤدي إلى تلوث التراكب.
4. في نفس اليوم الذي يتم سكب التراكب ، تطعيم قالب ARP/MARP الطازجة عن طريق التنضيد 100 μL من الموجبة المعدلة MHB في كل بئر من لوحه 96-حسنا.
   ملاحظه: للحد من فرصه لنشر التلوث اثناء dereplication ، واستخدام واحده ARP/MARP لوحه مكتبه فقط لdereplication 2 − 3 لوحات الدراويش. ولذلك ، تطعيم ما يكفي من 96-بئر ARP/MARP لوحات استنادا إلى عدد من السلالات التي سيتم dereplicated.
5. تاخذ الأسهم المجمدة ARP/MARP لوحه مكتبه من 80 درجه مئوية الفريزر. أزاله ختم ألومنيوم قبل ان يبدا التكثيف لتشكيل علي السفلي ، التالي تقليل فرصه لتلويث الآبار المجاورة في لوحه المكتبة.
6. باستخدام معقمه 96 أدوات تثبيت جيدا (أو اشكال أخرى من معدات التلقيح) ، دبوس بعناية من المجمدة الأسهم ARP/MARP لوحه المكتبة وتطعيم الطازجة MHB التي تحتوي علي لوحات 96-حسنا. للحد من التلوث اثناء dereplication ، واعداد العديد من لوحات المكتبة ARP أو MARP اللازمة لفقط dereplication 2 − 3 لوحات الدراويش لكل لوحه مكتبه. تعقيم أدوات تثبيت بين تطعيم كل لوحه.
7. وضع ختم ألومنيوم معقمه جديده علي قالب المجمدة مره واحده كامله والعودة إلى-80 درجه مئوية الفريزر. ضع التطعيمات ال96ه بشكل جيد داخل كيس من البلاستيك المختوم وحضن في 37 درجه مئوية مع التهوية (250 دوره في الدقيقة) لمده 18 ساعة.
   ملاحظه: يمكن اعداد لوحات مكتبه الأوراق المالية المجمدة الجديدة من هذه الخطوة بعد ضمان عدم وجود تلوث. أضافه الجلسرين إلى لوحه قبل تخزين في-80 درجه مئوية كما هو موضح في الخطوة 2.5.

5. الدراويش باستخدام ARP/MARP

1. قم بازاله القالب ARP/MARP من الحاضنة وتاكد من عدم وجود ملوثات. دائما الدراويش باستخدام قالب التي يتم اعدادها طازجه وليس مباشره من المخزون المجمدة.
2. أزاله لوحات dereplication من 4 درجه مئوية والسماح لتتوازن إلى درجه حرارة الغرفة. إذا كان هناك التكثيف ، وفتح الاغطيه والسماح لتجف في بيئة معقمه.
3. باستخدام أدوات تثبيت معقمه (أو غيرها من معدات التلقيح) ، دبوس من لوحه مكتبه ARP/MARP علي سطح تراكب أجار MHB من لوحات dereplication. يجب الحرص علي عدم اختراق أجار. تعقيم أدوات التثبيت في ما بين تطعيم كل لوحه dereplication.
4. بعد تثبيت القالب علي سطح لوحات dereplication ، والسماح للقالب القالب لتجف لمده 3 − 5 دقيقه. ضع لوحات التطعيم الملقحة راسا علي عقب في كيس من البلاستيك مختومه واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
5. تحليل نتائج dereplication في اليوم التالي عن طريق مقارنه النمو علي لوحه dereplication إلى الآبار التي تتوافق مع ARP/MARP الخريطة (الجدول 3 والجدول 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم الحصول علي النتائج التالية عندما تم تجميع مجموعه من سلالات الفوائد المنتجة للمضادات الحيوية باستخدام ARP و/أو MARP.

ويرد في الشكل 1رسم تخطيطي لسير العمل الخاص بالdereplication ARP/marp ، وتظهر خرائط لوحه المكتبة في الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2. ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يمكن تطبيق البروتوكول الموصوف أعلاه علي كل من اكتشاف المركبات المضادة للميكروبات الجديدة والمواد المضادة التي يمكن استخدامها بالاقتران مع الحيوية الموجودة لإنقاذ نشاطها. منصة يستفيد من خصوصية عاليه الركيزة من أليات المقاومة والمضادات الحيوية الخاصة بهم ، إلى مركبات التخلص من النفط داخ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Calcium Carbonate	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous	Commercial Alcohols	P016EAAN
Glass Beads, Solid	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Instant sealing sterilization pouch	Fisher Scientific	01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB Broth Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Fisher Scientific	264728	with lid, sterile, non treated
Petri dish 92 mm x 16 mm with cams	Sarstedt	82.1473.001
Pinning tools	ETH Zurich	-	Custom order
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potato starch	Bulk Barn	279
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium Nitrate	Fisher Scientific	S343-500
Wood Applicators	Dukal Corporation	9000
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2