JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لفصل الخلايا الانفية القرنية (CEC) من غشاء Descemet (DM) باستخدام النيوديميوم: YAG (Nd:YAG) ليزر كنموذج مرض الجسم الحي السابق لاعتلال القرنية المغرور (BK).

Abstract

وقد استخدمت ليزر YAG لإجراء جراحة داخل العين غير الغازية، مثل قطع المناظير لعدة عقود حتى الآن. يعتمد التأثير القاطع على الأعطال البصرية في التركيز بالليزر. يتم إنشاء موجات الصدمة الصوتية وفقاعات التجويف ، مما تسبب في تمزق الأنسجة. أحجام فقاعة ووسعة الضغط تختلف مع طاقة النبض وموقف النقطة المحورية. في هذه الدراسة، تم وضع عيون porcine enucleated أمام ليزر Nd:YAG المتاحة تجاريا. تم اختبار طاقات النبض المتغيرة وكذلك المواقف المختلفة للبقع البؤرية الخلفية للقرنية. تم تقييم الآفات الناتجة عن ذلك بواسطة المجهر الفوتون ين وعلم الأنسجة لتحديد أفضل المعلمات لمفرزة حصرية من الخلايا الانفية القرنية (CEC) مع الحد الأدنى من الأضرار الجانبية. مزايا هذه الطريقة هي الاستئصال الدقيق لCEC ، وتقليل الأضرار الجانبية ، وقبل كل شيء ، العلاج غير المتصل.

Introduction

شفافية القرنية أمر ضروري لنقل الضوء إلى شبكية العين ومستقبلاتها الضوئية1. في هذا الصدد ، فإن الحالة النسبية للجفاف أمر بالغ الأهمية للحفاظ على ألياف الكولاجين داخل ستروما القرنية محاذاة بشكل صحيح. يتم الحفاظ على هذا التوازن بواسطة خلايا بطانة القرنية (CEC) الموجودة على غشاء Descemet (DM)2. الإندوثيوليوم هو طبقة القرنية الأعمق. لديها حاجز مهم وظيفة مضخة، وهو أمر حاسم لشفافية القرنية3. على النقيض من ظهارة ، البطانة ليست قادرة على تجديد الذات4. لذلك ، فإن أي تلف في الخلايا يسببه المرض أو الصدمة يحفز الخلايا الانهوفية المتبقية على التكبير والهجرة ، لتغطية العيوب الناتجة والحفاظ على وظائف القرنية5. ومع ذلك ، إذا كانت كثافة CEC تقع تحت عتبة حرجة ، فإن فك تعويض البطانة يؤدي إلى وذمة ، مما يؤدي إلى عدم وضوح الرؤية وعدم الراحة أو حتى الألم الشديد4. على الرغم من توافر الأدوية لتخفيف الأعراض ، إلا أن العلاج النهائي الوحيد في هذه الحالات هو زرع القرنية ، والتي يمكن إجراؤها في شكل ترقيع كامل السماكة أو زرع الانهوثيلية الأعرج. الإجراء الأخير متاح كما Descemet الغشاء القرنية البطانة (DMEK) وكذلك Descemet تجريد الآلي بطانة القرنية (DSAEK)6. ومع ذلك، فإن حماية ما تبقى من لجنة CEC وتعزيز بقائها يمكن أن يكون هدفا بديلا، الذي يحتاج إلى نموذج مرض مناسب لاختبار الأدوية العلاجية المحتملة.

تركز نماذج مرض فقدان CEC الحالية على تدمير البطانة من خلال حقن العوامل السامة (على سبيل المثال، كلوريد البنزالكونيوم) في الغرفة الرضعة أو عن طريق الكشط الميكانيكي للخلايا باستخدام تقنية descemetorhexis الغازية7،8. وفي حين أن هذه النماذج راسخة، فإن هناك مساوئ مثل الاستجابة الالتهابية العامة والأضرار الجانبية غير الدقيقة. لذلك ، من المرجح أن تمثل هذه النماذج المراحل النهائية للمرض ، عندما تكون الخيارات الجراحية المذكورة أعلاه حتمية.

مع التقدم في استراتيجيات العلاج الخلوي مثل الخلايا الجذعية والعلاج الجيني ، يمكن أن يكون تطبيق هذه العلاجات الخلوية مفيدًا في المراحل المبكرة من خسارة CEC9. وفي وقت لاحق، نحتاج إلى نموذج يمثل هذه المراحل المبكرة من المرض على نحو أكثر ملاءمة. في هذا الصدد، وقد تحسنت نماذج ثقافة الخلية على مدى العقد الماضي ولكن لا تزال محدودة في صحتها، والخلايا في المختبر لا يمكن أن تقترب من تكرار التفاعلات المعقدة التي تحدث بين أنواع الخلايا المختلفة داخل القرنية10. لذلك ، لا تزال نماذج المرض على سبيل الفيو وفي الجسم الحي في ارتفاع الطلب وتحسين النماذج الموجودة هو من أقصى الأهمية.

غير الغازية, جراحة داخل العين عن طريق photodisruption باستخدام النيوديميوم: YAG (Nd:YAG) أصبح الليزر إجراء روتيني لأطباء العيون في جميع أنحاء العالم منذ عرضه في أواخر 1970s11. يعتمد التعطيل الضوئي على امتصاص الضوء غير الخطي مما يؤدي إلى تشكيل البلازما ، وتوليد موجات الصدمة الصوتية ، وإنشاء فقاعات التجويف ، كلما يقع موقع التطبيق في بيئة سائلة12. بشكل عام ، تساهم هذه العمليات في التأثير المقصود لقطع الأنسجة الدقيقة. ومع ذلك ، فإنها يمكن أيضا أن تكون مصدرا للأضرار الجانبية غير الضرورية التي تحد من الحبس المحلي لجراحة الليزر13.

وقد تحسن التنبؤ بالآثار الميكانيكية الناتجة بشكل كبير من خلال توصيف مسار انتشار موجة الصدمة والتجويف. هدفنا هو استهداف CEC بأقل قدر ممكن من الضرر للأنسجة المحيطة لتوفير نموذج مرض تجريبي غير باضع بمساعدة الليزر للمراحل المبكرة من فقدان CEC. لهذا الغرض ، من الضروري تحديد طاقات النبض المثلى ومواقف البقع البؤرية للليزر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وتتبع جميع الإجراءات المتعلقة بالأنسجة الحيوانية المبادئ التوجيهية للجنة المحلية لرعاية الحيوان وأخلاقياته.

1. إعداد ثقافة الجهاز والعلاج بالليزر

  1. الحصول على عيون porcine المهول ة الطازجة من المسلخ المحلي. الاحتفاظ بها باردة (4 درجات مئوية) في جلوج جلكو المعدلة المتوسطة (DMEM) مع ارتفاع الجلوكوز, تستكمل مع L-الجلوتامين, بيروفات الصوديوم, البنسلين / streptomycin (1%), ومصل بورسين (10%), ومن الآن فصاعدا يشار إليها في هذه المقالة بأنها متوسطة كاملة.
  2. إزالة الأنسجة خارج الخلية مع مقص ونقع العينين في 5٪ محلول العيون اليود povidone اليود لمدة 5 دقائق قبل وضعها في محلول محلول ملافي معقم الفوسفات المخزنة (PBS) حتى الاستخدام.
  3. عيون الشاشة لأمراض الجزء الأمامي الرئيسية ، مثل ندبات القرنية والوذمة وغيرها من الأوماتين مع جهاز التصوير المقطعي البصري الطيفي المجال(جدول المواد).
  4. ضع العينين أمام وحدة مصباح الشق المجهزة بليزر Nd:YAG(جدول المواد)، والذي يبلغ الطول الموجي 1064 نانومتر وقطر بقعة بؤرية يبلغ 10 ميكرومتر في الهواء.
    ملاحظة: لتحديد المواقع الأمثل يتم استخدام جهاز عقد 3D المطبوعة، والتي تم تصميمها لعقد شركة العين، دون وضع الكثير من الضغط على ذلك(الشكل 1).
  5. استخدام التكبير من 12x وحرف الإضاءة لتصور طبقات القرنية الفردية.
  6. تعيين طاقة النبض (على سبيل المثال، 1.6 ملج) ونقطة التركيز (على سبيل المثال، 0.16 مم) للاستئصال الانتقائي للخلايا الانهويلية.
  7. وضع paracentesis القرنية واضحة قريبة من أطرافه وحقن اللزوجة(جدول المواد)لتحقيق الاستقرار في الغرفة الأمامية.
  8. استئصال القرنية المركزية المعالجة بالليزر باستخدام تريفين 8 مم.
  9. ضع القرنية المكوس في بئر من لوحة 12 بئر مع موقع الأنبوالية التي تواجه صعودا واحتضان العينة في 3 مل من المتوسط الكامل في 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.
    ملاحظة: يمكن إضافة عوامل الحماية الخلايا المحتملة إلى الوسط أثناء هذه الخطوة.

2. التحضير لعلم الأنسجة

  1. إعداد المخزن المؤقت سورنسن مع درجة الحموضة من 7.4 تحتوي على 19.6 مل من 133 mM KH2PO4 و 80.4 مل من 133 mM Na2HPO4.
  2. قم بإزالة الوسط من البئر المحتوي على القرنية وأصلح الأنسجة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام الفورمالديهايد الخالي من الميثانول (4%) في عازل سورنسن
  3. وضع الأنسجة في 20٪ السكروز في برنامج تلفزيوني حتى المصارف الأنسجة (1 ح) ومن ثم في السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في RT. الحرص على تجنب الاتصال مع فقاعات واجهة سطح الهواء. تضمين الأنسجة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  4. قطع أقسام 10 ميكرومتر سميكة باستخدام cryostat في -27 درجة مئوية.
    ملاحظة: فرشاة شعر الإبل مفيدة للمساعدة في توجيه المقطع الناشئ على شفرة السكين.
  5. نقل القسم إلى شريحة المجهر عن طريق لمس الشريحة إلى الأنسجة في غضون 1 دقيقة من قطعه لتجنب تجميد تجفيف الأنسجة. تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية.

3. الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) تلطيخ

  1. أقسام الهواء الجافة لعدة دقائق لإزالة الرطوبة.
  2. وصمة عار مع تصفية 0.1٪ مايزر hematoxylin لمدة 10 دقيقة في أنبوب 50 مل.
  3. في جرة كوبلين، شطف في ddH2O تشغيل بارد لمدة 5 دقيقة وتراجع في 0.5٪ إيوسين 10x.
  4. تراجع في ddH2O حتى توقف إيوسين عن المتتالية ثم تراجع في 50٪ (10x) بالإضافة إلى 70٪ (10x) EtOH.
  5. Equilibrate في 95٪ EtOH (30 s) و 100٪ EtOH (60 ق) قبل غمس في الزيلين عدة مرات.
  6. أخيرا جبل وcoverslip العينة قبل التقاط الصور باستخدام المجهر الخفيف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

باستخدام الإجراء المعروض هنا، عالجنا العينين بليزر Nd:YAG، وتقييم طاقات النبض المختلفة (1.0-4.6 مليون جول) ومواقف النقاط المحورية (المسافة من السطح الخلفي للقرنية: 0.0-0.2 مم) للعثور على المعلمات المثلى. تم تقييم النسخ المتماثلة المتعددة (n = 3) لكل كوكبة من معلمات الليزر (12 × 21).

بالإضا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تشير نتائج هذه الدراسة التجريبية إلى أنه يمكن استخدام ليزر Nd:YAG لإزالة الخلايا الانهوائية القرنية بشكل انتقائي عند اختيار المعلمات المناسبة لجرعة الطاقة ووضع نقطة التركيز.

بما أن وظيفة الانهوبيليال مهمة لشفافية القرنية وحماية القرنية من الوذمة سترومال ، تلعب نماذج الخلل ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر كريستين أورين ويان أ. م. سوشوريك على مساعدتهما في الأساليب التجريبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BARRON VACUUM TREPHINEKatenaK20-2058
CryostatLeicaCM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucosePAAE-15009
Eye holderSelfN/A
Inverted MicroscopeLeicaDMI 6000 B
KH2PO4Merck529568
Na2HPO4Merck1065860500
Nd:YAG laserZeiss MeditecvisuLAS YAG II plus
OCT Tissue TekSakura Finetechnical4583
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco10010056
Porcine serumSigma-Aldrich12736C
Spectral-domain optical coherence tomographHeidelberg EngineeringSpectralis
Tissue culture plate 12-wellSarstedt833921
Two-Photon MicroscopeJenLabDermaInspect
ViscoelasticOmniVisionMethocel

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
  3. Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
  4. Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
  5. He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047(2016).
  6. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  7. Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
  8. Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
  9. Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
  10. Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
  11. Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
  12. Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
  13. Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
  14. Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
  15. Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
  16. Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
  17. Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
  18. Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).
  19. Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
  20. Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
  21. McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
  22. Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

158 Nd YAG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved