في المختبر نموذج الأوعية التاجية

Summary

في المختبر يمكن استخدام نماذج تولد الأوعية التاجية لاكتشاف الآليات الخلوية والجزيئية لتولد الأوعية التاجية. في المختبر الثقافات الاستئصالية من الأنسجة الودينة والشغاف تظهر نموا قويا استجابة لVEGF-A وعرض نمط مماثل من التعبير COUP-TFII كما هو الحال في الجسم الحي.

Abstract

هنا، نصف في المختبر الثقافة الزرع لدراسة الأوعية التاجية. الأوعية التاجية تغذية عضلة القلب وذات أهمية سريرية. العيوب في هذه الأوعية تمثل مخاطر صحية شديدة مثل تصلب الشرايين، والتي يمكن أن تؤدي إلى احتشاء عضلة القلب وفشل القلب في المرضى. وبالتالي، فإن مرض الشريان التاجي هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. على الرغم من أهميتها السريرية، لم يتم إحراز تقدم يذكر نسبيا في كيفية تجديد الشرايين التاجية التالفة. ومع ذلك، فقد أُحرز تقدم في الآونة الأخيرة في فهم المنشأ الخلوي ومسارات التمايز لتطوير الأوعية التاجية. وكان ظهور الأدوات والتكنولوجيات التي تسمح للباحثين لتسمية خلايا السلف الفلورسنت، ومتابعة مصيرها، وتصور progenies في الجسم الحي، تلعب دورا ً أساسياً في فهم تطور الأوعية التاجية. في دراسات الجسم الحي قيمة، ولكن لها قيود من حيث السرعة، وسهولة الوصول، والمرونة في التصميم التجريبي. بدلا من ذلك، يمكن للنماذج الدقيقة في المختبر لتولد الأوعية التاجية التحايل على هذه القيود والسماح للباحثين لاستجواب الأسئلة البيولوجية الهامة بسرعة ومرونة. قد يكون عدم وجود أنظمة نموذج في المختبر المناسب قد أعاق التقدم في فهم الآليات الخلوية والجزيئية لنمو الأوعية التاجية. هنا ، نصف نظام الاستزراع في المختبر لزراعة الأوعية التاجية من الوريد الالجيوب الأنفية (SV) وendocardium (Endo)، وهما أنسجة السلف التي تنشأ منها العديد من الأوعية التاجية. كما أكدنا أن الثقافات تُلخص بدقة بعض الآليات المعروفة في الجسم الحي. على سبيل المثال، نحن نظهر أن براعم الأوعية في الثقافة من SV downregulate COUP-TFII التعبير مماثلة لما لوحظ في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أن VEGF-A ، وهو عامل أنجيوجينيك معروف في الجسم الحي ، يحفز بقوة تولد الأوعية من كل من ثقافات SV و Endo. بشكل جماعي ، ابتكرنا نموذجًا دقيقًا في الثقافة المختبرية لدراسة تولد الأوعية التاجية.

Introduction

تسمى الأوعية الدموية للقلب عادة الأوعية التاجية. تتكون هذه الأوعية من الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية. أثناء التطوير ، يتم إنشاء الشعيرات الدموية المتفرعة للغاية أولاً ، والتي تعيد تشكيلها بعد ذلك في الشرايين التاجية والأوردة^1،2،^3،4،5. يتم بناء هذه الشعيرات الدموية الأولية من الخلايا السلف البوالجينية الموجودة في proepicardium ، ووينوس الجيوب الأنفية (SV) ، وأنسجة الشغاف (Endo)^1،6،7،8. SV هو عضو تدفق القلب الجنينية وإندو هو البطانة الداخلية للتجويف القلب. الخلايا السلف الاندوري وجدت في SV وEndo بناء غالبية الأوعية الدموية التاجية، في حين أن proepicardium يساهم في جزء صغير نسبيا منه². وتسمى العملية التي تنمو بها الشبكة الشعرية للأوعية التاجية في القلب من خلاياها السليفة الموجودة مسبقًا تولد الأوعية التاجية. مرض الشريان التاجي هو واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم وحتى الآن لا يوجد علاج فعال لهذا المرض. يمكن أن يكون فهم الآليات الخلوية والجزيئية التفصيلية لتكوين الأوعية التاجية مفيدًا في تصميم علاجات جديدة وفعالة لإصلاح الشرايين التاجية التالفة وتجديدها.

في الآونة الأخيرة، تم تحقيق طفرة في فهمنا لكيفية تطور الأوعية التاجية جزئيا من خلال تطوير أدوات وتقنيات جديدة. على وجه الخصوص ، في تسمية النسب الحي وتقنيات التصوير المتقدمة كانت مفيدة للغاية في الكشف عن المنشأ الخلوي ومسارات التمايز للأوعية التاجية^{9،10،11،12.} على الرغم من مزايا هذه في أدوات الجسم الحي ، هناك قيود من حيث السرعة والمرونة وسهولة الوصول. لذلك ، يمكن أن تكمل أنظمة النموذج المختبري القوية في أنظمة الجسم الحي لتوضيح الآليات الخلوية والجزيئية لتكوين الأوعية التاجية بطريقة عالية الإنتاجية.

هنا، نصف نموذج في المختبر من تولد الأوعية التاجية. لقد قمنا بتطوير نظام زراعة الاستئصال في المختبر لزراعة الأوعية التاجية من اثنين من أنسجة السلف، SV وEndo. مع هذا النموذج، ونحن نظهر أن الثقافات في الأنسجة المختبرية explant تنمو براعم الأوعية التاجية عندما حفزت من قبل متوسط النمو. بالإضافة إلى ذلك، تنمو الثقافات النباتية بسرعة مقارنة بالتحكم عندما يحفزها عامل النمو البائي A (VEGF-A)، وهو بروتين أنجيوجينيك قوي للغاية. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن براعم الأوعية من ثقافة SV الخضوع إزالة التمايز وينوب (فقدان التعبير COUP-TFII)، وهي آلية مماثلة لتولد الأوعية SV في الجسم الحي¹. هذه البيانات تشير إلى أن نظام الثقافة في المختبر explant يعيد بأمانة الأحداث الوعائية التي تحدث في الجسم الحي. بشكل جماعي ، في نماذج المختبر من تولد الأوعية التي يتم وصفها هنا مثالية للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية لتولد الأوعية التاجية بطريقة عالية الإنتاجية ويمكن الوصول إليها.

Protocol

استخدام جميع الحيوانات في هذا البروتوكول يتبع جامعة ولاية الكرة المؤسسية رعاية الحيوانات ولجنة الاستخدام (IACUC) المبادئ التوجيهية.

1. إنشاء مربي الفئران والكشف عن المقابس المهبلية للحمل في الوقت المناسب

1. إعداد قفص تربية الفئران مع الفئران نوع البرية الذكور والإناث. تأكد من أن عمر الفئران الخصبة بين 6-8 أسابيع. قم بإعداد إما زوج (ذكر واحد وأنثى واحدة) أو كثلاثي (ذكر واحد وأنثى 2) للتكاثر.
2. تحقق من وجود قابس مهبلي في صباح اليوم التالي. استخدم مسبارًا معدنيًا بزاوية للكشف عن قابس عميق عن طريق إدخاله في فتحة المهبل. عيّن صباح القابس المهبلي الإيجابي ليكون يومًا جنينيًا 0.5 (e0.5).
   ملاحظة: يمكن أن تكون المكونات المهبلية إما سطحية (والتي يمكن رؤيتها بسهولة ، انظر الشكل 1)أو عميقة (والتي لا يمكن رؤيتها بسهولة). وجود قابس عميق سيمنع الإدراج الكامل للمسبار في حين أن عدم وجود قابس سيسمح بالإدراج الكامل دون مقاومة.
3. الحفاظ على الحمل في الوقت المناسب حتى تصل الأجنة e11.5 التي سيتم حصادها. لتأكيد الحمل قبل حصاد الأجنة، سجل وزن الفئران الأنثوية بين e7.5 و e11.5.
   ملاحظة: الزيادة اليومية في وزن الأم ستشير إلى نجاح الحمل، في حين أن أي تغيير في الوزن لن يشير إلى فشل الحمل.

2. حصاد الأجنة من الفئران الحامل

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون المعدات والكواشف التالية: غرفة القتل الرحيم_{CO 2،} 70٪ الإيثانول، المناشف الورقية، ملقط العادية، ملقط غرامة، مقص، 1x محلول ة مالحة معقمة الفوسفات (PBS)، 10 سم أطباق بيتري العقيمة، حاوية مع الثلج، ملعقة مثقبة، استئصال المجسم.

1. وضع الماوس الحامل e11.5 في غرفة نظيفة CO₂ القتل الرحيم للتضحية به. أغلق غطاء الغرفة لمنع الماوس من الهروب.
2. بعد أن يتم تأمين الماوس في غرفة القتل الرحيم، بدوره على CO₂. تأكد من تنظيم معدل تدفق_ثاني أكسيد الكربون لكل توصيات IACUC (أي 10-30٪ إزاحة في الدقيقة). بعد أن يتم قتل الفأر ة بالكامل، قم بخلع عنق الرحم لضمان الوفاة.
3. رش الماوس مع الإيثانول 70٪. رفع الجلد فوق البطن باستخدام ملقط، وجعل شق صغير باستخدام زوج من مقص وتمديد شق الاحقا. تكبير الشق الأمامي حتى الحجاب الحاجز وفضح قرن الرحم الذي يحتوي على الأجنة(الشكل 2).
4. اسحب سلسلة الأجنة (قرن الرحم + الأجنة) عن طريق الإمساك بالرحم وقطعه مجانًا. ضع سلسلة الأجنة في الثلج البارد معقم 1x PBS.
5. تشريح الأجنة الفردية من قرن الرحم عن طريق تقشير عضلة الرحم ، كيس الصفار ، وamnion واحدا تلو الآخر(الشكل 3A -F)تحت مجهري. نقل الأجنة تنظيفها باستخدام ملعقة مثقبة إلى طبق بيتري يحتوي على 1x مقسم تلفزيوني معقم على الجليد. تأكد من الحفاظ على الأجنة الباردة.

3. عزل القلوب من الأجنة e11.5

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون لديك المعدات والكواشف التالية: ملقط العادية، ملقط غرامة، 1x PBS العقيمة، 10 سم طبق بيتري المعقم، 6 سم طبق بيتري المعقم، حاوية مع الثلج، ملعقة مثقبة، تشريح المجسم.

1. إعداد طبق بيتري جديد مع الجليد الباردة العقيمة 1x PBS تحت ستيريواستيرايمر. نقل الجنين من الخطوة 2.5 إلى طبق بيتري لتشريح خارج القلب.
2. إزالة رأس الجنين باستخدام ملقط. أولا، اضغط على الرأس بين ملقط بيد واحدة ثم إزالة الرأس عن طريق كشط بعيدا مع اليد الأخرى باستخدام ملقط مغلقة(الشكل 4A-C).
3. بعد إزالة الرأس ، قم بتوجيه الجنين بجانبه البطني لأعلى عن طريق الضغط على الجنين مع ملقط في بطنه بيد واحدة(الشكل 4D).
4. مع جهة أخرى، فتح جدار الصدر من الجنين عن طريق إجراء أول شق صغير في الصدر قليلا فوق الحجاب الحاجز باستخدام ملقط غرامة. ثم تكبير شق بعناية فائقة عن طريق إدراج ملقط مغلقة وتمزيق جدار الصدر عن طريق فتح ملقط. تأكد من عدم دفع عميق جدا، والتي يمكن أن تلحق الضرر القلب. مع مساعدة من ملقط، والحفاظ على جدار الصدر مفتوحة على مصراعيها لفضح القلب والرئتين في تجويف الصدر(الشكل 4E).
5. باستخدام ملقط ناعم، حرك القلب بلطف بشكل عرضي (90 درجة) وفضح الأورطا الظهري/الوريد. سحب القلب / الرئتين الأمامي عن طريق التقاط الأورطا الرُقّابة / الوريد عند قاعدة القلب(الشكل 4F-H).
   ملاحظة: كن لطيفًا أثناء سحب القلب / الرئتين لتجنب تمزق SV ، والذي يقع في الجانب الظهري من القلب.
6. شطف القلب / الرئتين مع 1x الباردة PBS لإزالة خلايا الدم.
7. كرر الخطوات 3.1-3.6 لإزالة القلب / الرئتين من الأجنة المتبقية. تأكد من الحفاظ على عزل القلب / الرئتين على الجليد.

4. عزل SVs وVentricles من e11.5 قلوب الفأر الجنينية

1. ضع طبق بيتري مع القلب / الرئتين من الخطوة 3.7 تحت المجهر لعزل SVs والبطينين كله. قشر قبالة الفصوص المرفقة من الرئتين واحدا تلو الآخر من جذورها باستخدام ملقط غرامة.
2. توجيه القلب على الجانب الظهري وإزالة الأذينين والأنسجة المجاورة التي تحيط SV الأمامي دون تمزيق SV. إزالة الأذين الأيمن والأيسر من القلب عن طريق عقد في قاعدتها وكشط تشغيله باستخدام ملقط غرامة(الشكل 5B). إزالة الأنسجة المجاورة المحيطة SV باستخدام تقنية مماثلة(الشكل 5C).
   ملاحظة: ضع في اعتبارك أن الأذين الأيمن متصل بـ SV، لذا كن حذراً لإزالة الأذين فقط.
3. لعزل SV، أول توجيه القلب مع الجانب الظهري التي تواجه لأعلى (لأن SV هو على الجانب الظهري) والحفاظ على القلب لا يزال في هذا الموقف عن طريق عقد بلطف القلب في البطينين مع ملقط.
   ملاحظة: SV هو عضو تدفق القلب الجنينية التي تقع بين الأذينين على الجانب الظهري من القلب.
4. إزالة SV بعناية عن طريق تقشير قبالة القلب حيث يتم إرفاقه أو عن طريق عقد SV في قاعدة مرفقها مع ملقط غرامة وكشط تشغيله مع ملقط مغلقة(الشكل 5D, E).
5. نقل SV معزولة في طبق بيتري جديد 6 سم مع الجليد الباردة العقيمة 1x PBS على الجليد باستخدام ماصة نقل معقمة وتسمية طبق بيتري كما SV.
6. لعزل البطينين كله، وإزالة القناة الخارج (الشريان الأورطان والجذع الرئوي) من القلب بعد إزالة SV(الشكل 5F، G).
7. نقل البطينين كله في طبق بيتري جديد 6 سم تحتوي على 1x PBS معقمة على الجليد باستخدام ماصة نقل معقمة وتسمية طبق بيتري والبطينين. الحفاظ على SV معزولة والبطينين على الجليد.
8. كرر الخطوات 4.1-4.7 لعزل SVs والبطينين من القلوب المتبقية.

5. إعداد لوحات زراعة الأنسجة مع إدراج وطلاء مصفوفة خارج الخلية

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من الحصول على المعدات والكواشف التالية: محلول مصفوفة خارج الخلية التجارية (ECM؛ على سبيل المثال، Matrigel)، 8.0 ميكرومتر البولي إيثيلين terephthalate (PET) إدراج الثقافة، 24 لوحات بئر، 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ حاضنة.

1. دع محلول ECM يذوب على الجليد. الحفاظ على حل ECM على الجليد لتجنب التصلب.
2. ضع الكائنات البوزيتائية البوزيترونية (حجم المسام = 8.0 ميكرومتر، منطقة الترشيح = 0.3 سم^2،قطر المرشح = 6.5 مم) في آبار الثقافة غير النسيجية المعالجة 24 لوحة بئر. قم بتسمية اللوحات على أنها SV أو البطينين لـ SV أو تنظير تكوين الأوعية في البُرِح، على التوالي.
   ملاحظة: قم بإعداد الإدراجات في لوحات منفصلة لـ SV والبطينين عند تنفيذ كلا الثقافتين في وقت واحد. تأكد من إعداد ما يكفي من الآبار لجميع العينات التجريبية والضوابط.
3. بعد إذابة محلول ECM، قم على الفور بتخفيف ECM 1:2 في وسط القاعدي ة مسبقالتبريد (أي، وسط القاعدي EBM-2، انظر جدول المواد)إلى حجم كاف (100 ميكرولتر/إدراج عدد من الإدراجات).
   ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان هناك ستة إدراجات، فإن الحجم الإجمالي سيكون 100 ميكرولتر × 6 = 600 ميكرولتر. أضف 200 ميكرولتر من ECM إلى 400 ميكرولتر من الوسط القاعدي.
4. معطف إدراج مع 100 ميكرولتر من ECM المخفف حديثا عن طريق إضافته مباشرة على رأس الغشاء. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للECM لترسيخ.
   ملاحظة: يجب أن يتم ذلك تحت غطاء الأنسجة تدفق لامينار لتجنب التلوث.

6. SVs وكامل Ventricles الثقافات

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون المعدات والكواشف التالية: الإيثانول 70٪، نقل ماصة، stereomicroscope، ملقط، اللامي تدفق الأنسجة الأنسجة الثقافة هود، طقم تكملة الخلية الانثنائي الأوعية الدقيقة(جدول المواد)،المتوسطة القاعدية، 1x مقسم معقم). يوضح الشكل 6 سير عمل ثقافة SV والبطين.

1. إذابة محتويات مجموعة الملحق على الجليد. إعداد المتوسطة كاملة عن طريق إضافة جميع محتويات عدة الملحق في 500 مل من المتوسطة القاعدية تحت غطاء الأنسجة تدفق لامير معتمدة. مزيج جيدا المتوسطة وتوزيعها في 50 مل aliquots.
2. قم بتعقيم قاعدة المجهر المجسم ومنطقة العمل المحيطة به مع الإيثانول بنسبة 70٪.
3. الحصول على لوحات زراعة الأنسجة من الخطوة 5.4. مع المعونة من ماصة نقل، ونقل بعناية explants من الخطوة 4.7 على رأس غشاء إدراج. تحت المجسم وبمساعدة ملقط نظيفة، ضع الإكساب في وسط الغرز لضمان عدم وجود هازفير في زاوية الغرز أو تعلق على الجدران الجانبية.
4. بعد وضع explants وتركزت على إدراج، وإزالة بعناية أي PBS إضافية من إدراج وإغلاق أغطية لوحات.
5. تحت غطاء الأنسجة تدفق laminar الأنسجة، إضافة 100 ميكرولتر من الوسط الكامل prewarmed على رأس إدراج و 200 ميكرولتر في الآبار لثقافة explants في واجهة الهواء السائل بحيث السطح القاعدي للإدراج هو في اتصال مع المتوسطة ، ولكن السطح العلوي يتعرض للهواء.
   ملاحظة: تأكد من ضبط مستوى الصوت للحصول على واجهة سائل ة هوائية إذا كنت تستخدم أحجام ًا مختلفة / لوحات جيدة.
6. أضف 300 ميكرولتر من PBS إلى الآبار غير المستخدمة من لوحات الآبار الـ 24 وغطيها بالغطاء. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ حاضنة، وتنمو الثقافات لمدة 5 أيام.
7. في الأيام التالية ، لاحظ بشكل روتيني الثقافات تحت مجهر الضوء المقلوب لتقييم حالة الثقافات الطاردة. تأكد من أن explants عرض الضرب انقباض وأن تعلق جميع explants إلى الجزء السفلي من الغشاء جزءا لا يتجزأ من ECM. يحيط علما بأي explants العائمة.
   ملاحظة: يشير الانكماش الدوري للنباتات الخارجية إلى أنها على قيد الحياة. وينبغي حذف النباتات العائمة من التحليل.
8. بعد تقييم حالة الثقافة، وضع لوحة الثقافة مرة أخرى في الحاضنة والاستمرار في تنمية الثقافة لمدة تصل إلى 5 أيام.

7. علاج الثقافات مع VEGF-A (التحكم الإيجابي)

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون المعدات والكواشف التالية: غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة تدفق التصفيمي، 1x PBS، المتوسطة القاعدية + 1٪ مصل الأبقار الجنين (FBS)، المتوسطة القاعدية + VEGF-A، ماصة، ونصائح ماصة.

1. إعداد المتوسطة القاعدية + 1٪ FBS والمتوسطة القاعدية + VEGF-A.
   1. لإعداد الوسيط القاعدي + 1٪ FBS، أولاً تحديد عدد آبار التحكم المطلوبة. على سبيل المثال، إذا كان هناك ثلاثة آبار التحكم، ثم 300 ميكرولتر / بئر × 3 = 900 ميكرولتر هو الحجم الإجمالي اللازم. أضف 9 ميكرولتر من FBS إلى 891 ميكرولتر من الوسط القاعدي لجعل الوسط القاعدي + 1٪ FBS.
   2. لإعداد الوسط القاعدي + VEGF-A، حدد أولاً العدد الإجمالي للآبار التي تحتاج إلى وسيط VEGF-A. إذا كان هناك ثلاثة آبار، ثم 300 ميكرولتر / بئر × 3 = 900 ميكرولتر هو الحجم الإجمالي و 50 نانوغرام / جيد × 3 = 150 نانوغرام VEGF-A. إضافة 150 نانوغرام من VEGF-A إلى 900 ميكرولتر من المتوسطة القاعدية لجعل المتوسطة القاعدية + VEGF-A.
      ملاحظة: تجميع هذا الحل في وحدة تخزين أكبر من المحسوبة لتأمين عدد كاف من aliquots أصغر لكل تجربة.
2. في اليوم الثاني، قم بإزالة الوسائط من الغرفتين (الإدراجات والآبار). غسل الثقافات مع 300 ميكرولتر من 1x PBS عن طريق إضافة 100 ميكرولتر إلى إدراج و 200 ميكرولتر في الآبار. دوامة بحزم لوحات عدة مرات وإزالة برنامج تلفزيوني.
3. أضف 300 ميكرولتر من المتوسط القاعدي + 1% FBS (100 ميكرولتر في الإدراج و200 ميكرولتر في الآبار) لتجويع الثقافات لمدة 24 ساعة.
4. في اليوم الثالث، بعد المجاعة، أضف 300 ميكرولتر من المتوسط القاعدي + 1% FBS (100 ميكرولتر في الإدراج و200 ميكرولتر في الآبار) إلى آبار التحكم والمتوسطة القاعدية + VEGF-A (50 نانوغرام/بئر) في آبار العلاج، على التوالي.
5. بعد العلاج، ومواصلة تنمية الثقافات في الحاضنة.

8. التثبيت وتلطيخ المناعة

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من الحصول على المعدات والكواشف التالية: 4٪ بارافورمالديهايد (PFA)، 1x PBS، الأجسام المضادة الأولية والثانوية، شاكر، 0.5٪ خافض للتوتر السطحي غير الأيوني في PBS (PBT).

1. في اليوم السادس من الزراعة، وإزالة الثقافات المتوسطة وغسل مع 1x PBS في درجة حرارة الغرفة (RT).
   1. إصلاح الثقافات عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من محلول PFA بنسبة 4٪ في الآبار و 100 ميكرولتر في الإدراج. إصلاح الثقافات في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أثناء الهزاز.
   2. بعد تثبيت 20 دقيقة، وإزالة PFA من الثقافات في غطاء الدخان وغسل الثقافات مع 1x PBS عن طريق إضافة 200 ميكرولتر في الآبار و 100 ميكرولتر في إدراج.
   3. تكرار غسل 3x، 10 دقيقة لكل منهما، في حين هزاز. ثم المضي قدما لأداء المناعة.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الغسيل على سطح البدلاء في RT.
2. تمييع الأجسام المضادة الأولية (المضادة VE-Cadherin، المضادة ERG 1/2/3) في حل حجب (5٪ مصل حمار، 0.5٪ PBT). أضف 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (200 ميكرولتر في الآبار السفلية و100 ميكرولتر في الإدراجات). احتضان الثقافات في الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حين هزاز.
   ملاحظة: يستخدم المضادة VE-كادهيرين لتسمية غشاء الخلية البطانة ومكافحة ERG 1/2/3 يستخدم لتسمية نواة الخلية البطانة من أجل تصور براعم الأوعية من الخلايا البطانة.
3. في اليوم التالي، وغسل والصخور لوحات الثقافة 10x في 0.5٪ PBT، وتغيير PBT كل 10 دقيقة.
4. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (الحمار المضادة للفئران اليكسا فلور 488 والحمار المضادة للأرنب اليكسا فلور 555) في حل منع. أضف 300 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي كما هو الحال في الخطوة 8.2 واحتضان الثقافات بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية أثناء الهزاز. في اليوم التالي، اغسل الأجسام المضادة الثانوية 10x في PBT، وتغيير PBT كل 10 دقيقة.
   ملاحظة: غسل ما لا يقل عن 10x ولكن أكثر يغسل هي أفضل. بعد اكتمال السُلم، يمكن تخزين الثقافات مع 1x PBS حتى يتم تركيبها على الشرائح.

9. تصاعد الثقافات على الشرائح والتصوير والتحليل

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون المعدات والكواشف التالية: ملقط غرامة، والشرائح، وتركيب المتوسطة مع 4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)، coverslips، والمجهر البؤري. بعد تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية، قم بتركيب الثقافات على الشرائح للتصوير باستخدام الخطوات التالية.

1. قشر قبالة الغشاء بعناية من إدراج باستخدام ملقط غرامة ونقله إلى الشرائح عن طريق وضع الجانب الغشاء إلى أسفل ووضع الثقافات explant صعودا. ضع عينات النسخ المتماثل في نفس الشرائح وتسمية الشرائح كتحكم أو VEGF-A. إضافة بضع قطرات من وسط تصاعد مع DAPI مباشرة على الغشاء وتغطية الشرائح مع زلات الغطاء.
   ملاحظة: تأكد من تجنب فقاعات الهواء أثناء وضع القسائم.
2. ختم قبالة حواف الشرائح مع طلاء الأظافر واضحة والسماح الجافة.
   ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
3. شرائح الصورة باستخدام المجهر البؤري.
4. إجراء تحليل لقياس طول النمو الوعائي. قياس طول النمو الوعائي عن طريق قياس مسافة الخلايا الفيوليلية (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) الممتدة من الحدود الداخلية لخلايا ERG 1/2/3+ في ثقافات البطين ومن مركز explants SV في ثقافات SV.
   1. لإجراء القياس الكمي باستخدام فيجي/ ImageJ، قم أولاً بتنزيل برنامج فيجي.
   2. فتح ملفات الصور في فيجي: انتقل إلى ملف | فتح | مجلد | اسم الملف | فتح.
   3. انتقل إلى تحليل | تعيين القياسات | حدد المحيط.
   4. حدد أداة الخط المستقيم من النافذة الرئيسية.
   5. رسم خط عبر طول براعم كما هو مقترح في الخطوة 9.4.
   6. انتقل إلى تحليل | قياس.
      ملاحظة: يتم عرض قياسات الطول في الإطار الجديد.
   7. تنفيذ القياس الكمي في الصور التي تمثل ثلاثة حقول عرض محددة عشوائيًا على الأقل. متوسط قياسات طول براعم والإبلاغ عنها كمتوسط ± الانحراف المعياري.

النتائج

واحدة من السمات الأكثر لفتا للتولد الوعائي SV في الجسم الحي هو أنه يتبع مسارمحدد وينطوي على إزالة التمايز الخلية والأحداث التي تحدث في الأوقات النمطية والمواقف¹. كما تنمو خلايا SV الأولية على البطين القلب، فإنها تتوقف عن إنتاج علامات وينوية مثل COUP-TFII

Discussion

بعض الخطوات الأكثر أهمية لزراعة الأوعية التاجية بنجاح من أنسجة السلف SV وEndo هي: 1) تحديد وعزل أنسجة SV بشكل صحيح لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحدي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 x 20 MM Tissue Culture Dish	Fisher Scientific	877222	Referred in the protocol as Petri dish
24-well plates	Fisher Scientific	08-772-51
8.0 uM PET membrane culture inserts	Millipore Sigma	MCEP24H48
Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555	Fisher Scientific	A31572	Secondary antibody
Alexa Fluor Donkey anti-rat 488	Fisher Scientific	A21206	Secondary antibody
Angled Metal Probe	Fine science tools	10088-15	Angled 45 degree, used for detecting deep plugs
Anti- ERG 1/2/3 antibody	Abcam	Ab92513	Primary antibody
Anti- VE-Cadherin antibody	Fisher Scientific	BDB550548	Primary antibody, manufacturer BD BioSciences
CO2 gas tank	Various suppliers	N/A
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13998223	For 37 °C, 5% CO2 incubation
Dissection stereomicrosope	Leica	S9i	Leica S9i Stereomicroscope
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156	Endothelial cell growth basal media
ECM solution	Corning	354230	Commercially known as Matrigel
EGM-2 MV Singlequots Kit	Lonza	CC-4147	Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007003IR
FiJi	NIH	NA	Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Fine Forceps	Fine science tools	11412-11	Used for embryo dissection
Fisherbrand Straight-Blade operating scissors	Fisher Scientific	13-808-4
Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	SH-302-5601LR
Laminar flow tissue culture hood	Fisher Scientific	various models available
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1200	Vectashield with DAPI
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy/Fisher	50-980-494	This is available at 32%; needs to be diluted to 4%
Perforated spoon	Fine science tools	10370-18	Useful in removing embryo/tissues from a solution
Recombinant Murine VEGF-A 165	PeproTech	450-32
Standard forceps, Dumont #5	Fine science tools	11251-30
Sure-Seal Mouse/Rat chamber	Easysysteminc	EZ-1785	Euthanasia chamber