JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم نظام ًا قويًا وقابلًا للنقل وتنبؤيًا في المختبر لفحص ورصد الجسيمات المحمولة جواً فيما يتعلق بسميتها الرئوية الرئوية الحادة من خلال تعريض خلايا الرئة البشرية المزروعة في واجهة الهواء السائل (ALI).

Abstract

هنا ، نقدم نظام ًا نمطيًا مصممًا خصيصًا في المختبر يتيح التعرض المتجانس لخلايا الرئة البشرية المزروعة في ALI للغازات أو الجسيمات أو الأجواء المعقدة (مثل دخان السجائر) ، مما يوفر واقعية فسيولوجية التعرض للسطح apical من منطقة السنخية الإنسان إلى الهواء. وعلى النقيض من نماذج التعرض المتتابعة مع توجيه الهباء الجوي الخطي، فإن التصميم المعياري لنظام التدفق الشعاعي يفي بجميع متطلبات التوليد المستمر ونقل الغلاف الجوي للاختبار إلى الخلايا، وتوزيع وترسب متجانسين الجسيمات والإزالة المستمرة للغلاف الجوي. تم تصميم طريقة التعرض هذه في المقام الأول لتعرض الخلايا للجسيمات المحمولة جواً، ولكن يمكن تكييفها مع تعرض الهباء الجوي السائل والغازات شديدة السمية والعدوانية اعتماداً على طريقة توليد الهباء الجوي ومواد وحدات التعرض .

وفي إطار دراسة التحقق التي أُنجزت مؤخراً، ثبت أن نظام التعرض هذا هو طريقة فحص قابلة للتحويل وقابلة للاستنساخ وتنبؤية للتقييم النوعي للسمية السيسارية الحادة للجسيمات المحمولة جواً، وبالتالي يحتمل أن تقلل أو تحل محل التجارب الحيوانية التي من شأنها أن توفر عادة هذا التقييم السمية.

Introduction

استنشاق الجسيمات السامة المحمولة جوا هو مصدر قلق الصحة العامة، مما يؤدي إلى العديد من المخاطر الصحية في جميع أنحاء العالم وعدة ملايين من الوفيات سنويا1،2. وقد ساهم تغير المناخ والتنمية الصناعية الجارية والطلب المتزايد على الطاقة والمنتجات الزراعية والاستهلاكية في زيادة الأمراض الرئوية خلال السنواتالماضية3و4و5و6. توفر المعرفة والتقييم للمواد القابلة للاستنشاق فيما يتعلق بسميتها الحادة عن طريق الاستنشاق الأساس لتقييم المخاطر وإدارة المخاطر، ولكن هذه المعلومات لا تزال غير موجودة لمجموعة واسعة من هذه المواد7و8. ومنذ عام 2006، يشترط التشريع الكيميائي للاتحاد الأوروبي REACH (تسجيل المواد الكيميائية وتقييمها والإذن بها وتقييدها) أن تخضع المنتجات الموجودة بالفعل والجديدة لتوصيف سمي بما في ذلك طريق الاستنشاق قبل طرحها في السوق. ولذلك ، يركز REACH على الأساليب البديلة والخالية من الحيوانات ، وتنفيذ مبدأ "3R" (استبدال ، وصقل ، والحد من التجارب الحيوانية) واستخدام النماذج المناسبة في المختبر9. في السنوات الأخيرة ، تم تطوير العديد من نماذج اختبار سمية الاستنشاق غير الحيوانية المختلفة والكافية (على سبيل المثال ، في زراعة الخلايا المختبرية ، ونماذج الرئة على رقاقة ، وشرائح الرئة الدقيقة (PCLS)) من أجل تقييم سمية الاستنشاق الحاد للجسيمات المحمولةجوا5،7،10،11. من حيث نماذج زراعة الخلايا المختبرية ، يمكن كشف الخلايا المزروعة تحت ظروف مغمورة أو في ALI(الشكل 1). غير أن صحة دراسات التعرض المغمورة محدودة فيما يتعلق بتقييم سمية المركبات المحمولة جواً ولا سيما الجسيمات. تقنيات التعرض المغمورة لا تتوافق مع الإنسان في حالة الجسم الحي; قد تؤثر وسط ثقافة الخلية التي تغطي الخلايا على الخصائص الفيزيائية الكيميائية وبالتالي ، فإن الخصائص السامة لمادة الاختبار12،13. تسمح نماذج استنشاق الخلايا في المختبر بالتعرض المباشر للخلايا للمواد الاختبارية دون تدخل وسط ثقافة الخلية مع جزيئات الاختبار ، وبالتالي ، تحاكي التعرض البشري بتشابه فسيولوجي وبيولوجي أعلى من التعرض المغمور12،14.

أما بالنسبة للعمليات التنظيمية مثل REACH، فإن النماذج الحيوانية فقط هي المتاحة في مجال علم السموم الاستنشاقي الحاد، حيث لم يتم التحقق من صحة أي طرق بديلة في المختبر بشكل كاف ٍ وقبولها رسمياً حتى الآن14. ولهذا الغرض، يجب التحقق من صحة نماذج الاختبار وفقاً لمتطلبات المختبر المرجعي للاتحاد الأوروبي لبدائل اختبار الحيوانات (EURL-ECVAM) بشأن صلاحية الاختبار15.

أثبتت دراسة سابقة قبل التحقق ودراسة التحقق التي تم الانتهاء منها مؤخرًا بنجاح مجال تطبيق نظام التعرض لـ CULTEX RFS وقابليته للنقل والاستقرار وقابلية التكاثر13. نظام التعرّض هذا هو نظام تعرض للخلايا في المختبر يمكّن من تعرض الخلايا المتجانس للغازات أو الجسيمات أو الأجواء المعقدة (مثل دخان السجائر) في ALI بسبب مفهوم توزيع الهباء الجوي الشعاعي والتوصيل للرذاذ الاختباري في تدفق مستمر فوق الخلايا16. تتكون الوحدة الأساسية لنظام التدفق الشعاعي هذا من محول الدخول ، ووحدة توجيه الهباء الجوي مع توزيع الهباء الجوي الشعاعي ، ووحدة أخذ العينات والمقبس ، ووحدة تأمين مع عجلة اليد(الشكل 2). تصل الجسيمات المولدة إلى الخلايا عبر محول المنافذ ووحدة توجيه الهباء الجوي ويتم إيداعها على إدراجات زراعة الخلايا ، والتي تقع في غرف التعرض الثلاث مرتبة شعاعيًا لوحدة أخذ العينات. يمكن تسخين وحدة توجيه الهباء الجوي وكذلك وحدة أخذ العينات عن طريق الاتصال بحمام مائي خارجي17.

وفي إطار كلتا الدراستين، استُخدمت خلايا A549 في جميع تجارب التعرض. خط الخلية A549 هو خط خلية ظهارية خالدة الإنسان الذي هو جيد التوصيف جدا، وقد استخدمت كنموذج في المختبر للخلايا الظهارية من النوع الثاني السنخية في العديد من الدراسات السمية. تتميز الخلايا بأجسام lamellar ، وإنتاج السطحي وعدد من العوامل ذات الصلة بالالتهاب18. كما أنها تظهر خصائص الخلايا الظهارية الشعب الهوائية بسبب إنتاجها المخاط19. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون مثقفة في ALI. على الرغم من أن هذا الخط الخلية هو نقص في بناء الاتصالات الخلية الخلية، وزراعة هذه الخلايا هو أكثر ملاءمة بكثير، وأقل تكلفة باهظة والنتائج المستمدة منها هي المانحة مستقلة بالمقارنة مع الخلايا الأولية20.

تم بذر خلايا A549 في 6 بئر إدراج الخلايا (غشاء PET، 4.67 سم2،حجم المسام 0.4 ملم) بكثافة 3.0 × 105 خلايا لكل إدراج وزرعت لمدة 24 ساعة في ظل ظروف مغمورة. ثم تم الكشف عن الخلايا في ثلاثة مختبرات مستقلة للهواء النقي وثلاث جرعات تعرض مختلفة (25 و50 و100 ميكروغرام/سم2)من 20 مادة اختبارية في نظام الاستجابة البيئية. وترتبط جرعة التعرض بوقت الترسيب مما يؤدي إلى معدل جسيمات ثابت يبلغ 25 ميكروغرام/سم2و50 ميكروغرام/سم2 و100 ميكروغرام/سم2 على الخلايا بعد 15 أو 30 أو 60 دقيقة على التوالي. ومع ذلك، لم يتم غسل الجسيمات المترسبة بعد الترسيب، ولكنها بقيت على الخلايا لمدة 24 ساعة. وكانت أوقات ترسب الجسيمات بالتالي 15 و30 و60 دقيقة، ولكن تعرض الخلايا استمر لمدة 24 ساعة في المجموع. تم تحديد معدل ترسب المواد الاختبارية في التجارب الأولية وفقا للأساليب السابقة17.

تم تقييم صلاحية الخلية كمؤشر للسمية بعد 24 ساعة من ترسب الجسيمات باستخدام جهاز تقييم قابلية صلاحية الخلية. وتم التركيز بشكل خاص على نوعية ضوابط الهواء النظيف، وتحسين وتحسين بروتوكول التعرض، وإمكانية الاستنساخ داخل المختبرات وفيما بينها، وإنشاء نموذج للتنبؤ. المواد التي أدت إلى انخفاض قدرة الخلية على البقاء أقل من 50٪ (PM 50٪) أو 75% (بعد الظهر 75%) وفي أي من جرعات التعرض الثلاث اعتُبرت ممارسة خطر استنشاق حاد. ثم تمت مقارنة النتائج بالبيانات الموجودة في الجسم الحي (استنادًا إلى دراسة واحدة موثوقة على الأقل وفقًا للدليل الاختباري لمنظمة التعاون الاقتصادي والتنمية (TG) 403 أو TG 43621،22) ، مما أدى إلى توافق عام بنسبة 85٪ ، مع خصوصية 83٪ وحساسية 88٪23.

وإلى جانب قياس صلاحية الخلية، يمكن تقييم نقاط النهاية الأخرى مثل إطلاق السيتوكين أو فحص خلية الخلايا أو سلامة الأغشية عن طريق فحص LDH ولكنها لم تكن مطلوبة لدراسة التحقق من الصحة. وهكذا، ثبت أن نظام التعرض (مثل نظام CULTEX RFS) هو نظام فحص تنبؤي للتقييم النوعي لسمية الاستنشاق الحادة للجسيمات المحمولة جواً التي تم اختبارها، مما يمثل طريقة بديلة واعدة لاختبار الحيوانات. ويوصى بالبروتوكول التالي لتجارب التعرض للجسيمات المحمولة جواً باستخدام نظام التعريض هذا.

Protocol

ملاحظة: يغطي بروتوكول تجربة تعرض واحدة فترة ثلاثة أيام.

اليوم الأول

1- الاستعدادات العامة وزراعة الخلايا

ملاحظة: تم استخدام خط الخلية الظهارية للرئة البشرية A549 لتجارب التعرض. يجب التعامل مع الخلايا في ظروف معقمة. ويمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى التي هي مناسبة للزراعة في ALI.

  1. إعداد متوسط النمو (الحد الأدنى من المتوسط الأساسي لدولبيكو (DMEM)، مع استكمال 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 5 ميكروغرام /مل جنتاميسين) ومتوسط التعرض (DMEM، مع استكمال 5 ميكروغرام /مل جنتاميسين وتركيز نهائي HEPES من 100 مM).
  2. خلايا A549 الثقافة في وسط النمو عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ CO2.
  3. زراعة الخلايا في قارورة زراعة الخلايا من 75 سم2 (T-75) في 14 مل من متوسط النمو حتى التقاء 80-90٪ قبل تقسيم (كل 2-3 أيام) ومرور 35.
  4. حساب حجم التعليق والعدد المطلوب من إدراج ثقافة الخلية (ثلاثة إدراج ثقافة الخلية كضوابط حاضنة وثقافة الخلية إدراج للهواء النقي والتعرض للجسيمات) ولوحات ثقافة الخلية.
  5. قبل التبذير والبذر من الخلايا، إضافة 2.5 مل من متوسط النمو خفف إلى كل بئر من لوحة 6-جيدا. وضع الخلايا الثقافة إدراج دون خلايا بعناية داخل الآبار وإضافة 1 مل نمو المتوسطة إلى كل خلية إدراج الثقافة. احتضان لوحات 6-well لمدة 30 دقيقة على الأقل في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).

2. التربسينة من الخلايا

  1. خفف الفوسفات المالحة (PBS) ومتوسط النمو في 37 درجة مئوية والتربسين / EDTA (0.05٪/ 0.02%) الحل في درجة حرارة الغرفة.
  2. اسشق وسط ثقافة الخلية من قارورة ثقافة الخلية وغسل الخلايا بعناية مع 8 مل من برنامج تلفزيوني ساخن مسبقا.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني ، إضافة 2 مل من التربسين / EDTA (0.05 ٪/ 0.02%) حل للخلايا واحتضان لأقصى 6 دقيقة في الحاضنة في 37 درجة مئوية. السيطرة على عملية الانفصال تحت المجهر.
  4. تحييد نشاط التربسين عن طريق إضافة 8 مل متوسطة النمو ساخنة مسبقا، وفصل الخلايا عن طريق النقر بلطف جانبية على قارورة وإعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب المتكررة صعودا وهبوطا.
  5. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 مل. تحديد رقم الخلية لمزيد من الإجراءات (على سبيل المثال، البذر من الخلايا، ومرور الخلايا).

3- تحديد رقم الخلية

ملاحظة: تم تحديد تركيز الخلية باستخدام عداد الخلية أو غرف العد.

  1. تمييع 100 ميكرولتر من تعليق زراعة الخلايا في كوب مليء بـ 10 مل من المحلول متساوي التوتر. إمالة الكأس ببطء دون اهتزاز.
  2. تحديد عدد الخلايا القابلة للحياة/مل وقابلية صلاحية الخلية استنادًا إلى معلمات القياس الخاصة بالخلية لخلايا A549.

4. البذر من الخلايا على الأغشية الدقيقة في إدراج ثقافة الخلية

ملاحظة: تم تجهيز نظام التعرض مع محولات خاصة لتمكين استخدام إدراج التجارية من موردين مختلفين وأحجام مختلفة. وبالنسبة لتجارب التعرض هذه، استُخدمت لوحات 6 آبار وإدراجات زراعة الخلايا المقابلة لها. ويتعين القيام بجميع خطوات العمل في ظل ظروف عقيمة.

  1. توفير متوسط نمو ساخن مسبقًا في ظل ظروف زراعة الخلايا المعقمة (تدفق اللامي).
  2. إعداد حجم مرتفع بما فيه الكفاية من تعليق الخلية مع تركيز الخلية من 3.0 × 105 خلايا / مل.
  3. بعد تخفيف لوحات لمدة 30 دقيقة، يستنشق المتوسطة داخل خلية الثقافة إدراج والبذور 1 مل من خلايا A549 مع كثافة 3.0 × 105 خلايا / مل في كل خلية إدراج الثقافة. توزيع تعليق الخلية عن طريق هزاز لطيف.
  4. احتضان ثقافة الخلية إدراج مع تعليق الخلية لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).

5. الضغط على المواد الاختبارية

ملاحظة: تم الضغط على مواد الاختبار في كعك مسحوق باستخدام الصحافة الهيدروليكية التي يمكن التحكم فيها بالكامل. يمكن للحزمة الصحفية تطبيق قوة قصوى قدرها 18 كيلو طن ، والتي يتم عرضها كضغط الزيت الحالي (في شريط) من حزمة الصحافة. يجب تحديد الظروف الصحفية (الضغط الملح ، وقت الضغط) من مواد الاختبار غير المعروفة وتوصيفها في الاختبارات الأولية. اعتمادا على خصائص الصحافة من مادة، يمكن استخدام مختلف المعلمات الملحة وأنواع المكبس الملحة.

تنبيه: ارتداء معدات الحماية عند الضغط على المواد السامة أو الخطرة.

  1. تعيين الوقت الضغط عبر التحكم في الوقت على الجانب الأمامي من الصحافة.
  2. افتح مصدر الهواء المضغوط في صمام الهواء المضغوط. قم بتعيين ضغط الهواء المضغوط إلى ما يقرب من 2 بار (يشار إليه بواسطة مقياس الضغط على الجانب الأمامي) باستخدام منظم الضغط على الجانب الأمامي من الصحافة أو على صمام الهواء المضغوط لإمدادات الهواء المضغوط. اسحب الدرج واضغط على زر الضغط واقرأ الضغط الملح على مفتاح الضغط الرقمي.
    1. قراءة فقط الضغط في منظم الضغط إذا كان الضغط مرتفع جدا أو منخفض جدا.
  3. تجميع حاوية المادة والتأكد من أن يتم توسيط الاسطوانة الزجاجية بشكل صحيح(الشكل التكميلي 1). ملء حاوية المادة مع كمية صغيرة من مادة الاختبار. أدخل المكبس في حاوية المادة وأدرها قليلاً ذهاباً وإياباً لتوزيع المسحوق بالتساوي في الحاوية.
  4. ضع حاوية المادة مع المكبس في الدرج واضغط على زر الضغط. المكبس الهيدروليكي للصحافة يتحرك على المكبس ويمارس ضغطا على مادة الاختبار للمجموعة وقت الضغط. فتح الدرج وإزالة المكبس.
  5. كرر الخطوتين 5.3 و 5.4 حتى تكون حاوية المادة نصف ممتلئة على الأقل.
  6. بعد الانتهاء من العمل الملحة، وإزالة حاوية مادة من الدرج وتحويلها رأسا على عقب لإزالة الجسيمات فضفاضة والمودعة.
  7. إذا لم تكن هناك حاجة إلى حاوية المادة في نفس اليوم ، قم بإغلاق حاوية المادة بمادة بارافيلم من أجل منع مادة الاختبار من الجفاف أو امتصاص الرطوبة.

اليوم الثاني

6. تجميع نظام التعرض وربط المعدات الطرفية

ملاحظة: يتم توفير عرض أكثر تفصيلاً في الشكل 3والشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3. تجميع كل من وحدات ومولد الهباء الجوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

  1. وضع نظام التعرض على سطح صلب وحتى، مع إمدادات المياه التي تواجه إلى الأمام. قم بتوصيل وحدات التحكم في التدفق الجماعي مع مولد الهباء الجوي وزجاجة ثلاثية الرقبة متصلة بالوحدة النمطية للتعرض للهواء النظيف.
  2. قم بتوصيل وحدة تحكم التدفق ومضخة التفريغ. قم بتوصيل الأنابيب من وحدات التحكم في التدفق بموصل الأنبوب على مرفقات وحدة توجيه الهباء الجوي. قم بتوصيل الأنابيب على الجانب الآخر من وحدات التحكم في التدفق مع مضخة الفراغ. تأكد من أن التدفق يسير من الوحدة من خلال وحدات تحكم التدفق إلى مضخة الفراغ.
  3. ربط حمام الماء مع إمدادات المياه التدفئة. إمدادات المياه تسير من حمام الماء إلى مقبل المياه على وحدة توجيه الهباء الجوي. قم بتوصيل مأخذ المياه لوحدة توجيه الهباء الجوي بمأخذ المياه لوحدة أخذ العينات. أغلق الدائرة باتصال من مأخذ المياه لوحدة أخذ العينات إلى حمام الماء.
  4. ضع مولد الهباء الجوي بما في ذلك elutriator بالقرب من وحدة التعرض وقم بتوصيل الخطوط الزائدة للelutriator ووحدة التعرض والهواء النظيف مع مرشحات صغيرة كبيرة ، وشفط غرف التعرض مع مرشحات صغيرة صغيرة (على سبيل المثال ، مرشحات المتاح). يعمل الإلوترياتور كخزان للغلاف الجوي للجسيمات المتولدة ويحتفظ بجسيمات أكبر من حوالي 7 ميكرومتر، في حين يتم نقل الجسيمات الأصغر إلى وحدة التعرض.
  5. قم بتوصيل الكمبيوتر المستخدم للتحكم في توليد الهباء الجوي بمنفذ USB الخاص بأعلى مولد الهباء الجوي عبر كابل USB وإمدادات الطاقة إلى منفذ إمدادات الطاقة. قم بتوصيل قابس طاقة التيار المتردد لوحدة إمداد الطاقة بمقبس (220-240 V).
  6. توصيل الأنابيب للإمدادات المتوسطة وإزالتها مع مضختين. بدلا من استخدام مضخة للإمدادات المتوسطة، يمكن أيضا أن تملأ المتوسطة يدويا.

7. التحضير للهواء النقي والتعرض للجسيمات

  1. قم بتشغيل المضخة الفراغية ووحدات التحكم في التدفق وحمام الماء (37 درجة مئوية) لفترة إحماء لا تقل عن 30 دقيقة.
  2. افتح إمدادات الهواء المضغوط. تعيين وحدات تحكم تدفق الكتلة إلى 8 لتر / دقيقة لخط الإمداد إلى مولد الهباء الجوي وإلى 3 لتر / دقيقة لخط الإمداد إلى زجاجة ثلاثة العنق. أغلق علامات التبويب لوحدات تحكم التدفق الجماعي.
    ملاحظة: قد تختلف هذه القيم اعتماداً على خصائص مادة الاختبار.
  3. ضبط وحدات تحكم التدفق عبر الكمبيوتر لتنظيم تدفق الوحدة (1.5 لتر/دقيقة) وشفط الغرفة (30 مل/دقيقة).

8. اختبار تسرب نظام التدفق الشعاعي

ملاحظة: يجب إجراء فحص التسرب تحت فراغ ولكلا الوحدتين (التعرض ووحدة الهواء النظيف) من أجل ضمان إعادة تجميع الوحدة بشكل صحيح.

  1. قم بإزالة محول الدخول وعاكس المكثفات من وحدة توجيه الهباء الجوي. أغلق المملون الثلاثة لتغذية الهباء الجوي في وحدة توجيه الهباء الجوي مع المقابس وتوصيلات الإمداد المتوسطة في وحدة أخذ العينات مع اللوحات الوهمية.
  2. قم بتوصيل خطوط الفراغ بدون الفلتر بموصل الأنبوب لوحدة توجيه الهباء الجوي. أغلق الوحدة باستخدام عجلة اليد ومقياس قيمة وحدات تحكم التدفق. يجب أن تنخفض القيم بعد بضع دقائق من الإغلاق أقل من 5 مل/دقيقة.
  3. بعد التحقق من نفاذية، وإزالة جميع المقابس واللوحات وهمية، وإدراج محول دخول وعاكس المكثفات في وحدة توجيه الهباء الجوي وتوصيل الأنابيب لإمدادات متوسطة وإزالة.

9- توليد الهباء الجوي

  1. بدء تشغيل الكمبيوتر والبرنامج(الشكل التكميلي 4). بدء تشغيل برنامج مولد الهباء الجوي عن طريق النقر المزدوج على زر بدء مولد الهباء الجوي على سطح المكتب من الكمبيوتر. تظهر نافذة رسالة وتسأل عما إذا كان يجب إعادة تعيين الإعدادات أم لا. انقر على نعم إذا تم بدء تشغيل البرنامج لأول مرة في ذلك اليوم. تعيين قيم موضع الشريحة وموضع الكشط إلى القيم الافتراضية. انقر فوق لا للحفاظ على قيم موضع الشريحة وموضع المكشطة أو الشريحة ليست في موضع البداية.
  2. المسمار مكشطة مادة في الأنابيب، والذي يقع في الفتحة المركزية من أعلى مولد الهباء الجوي.
    ملاحظة: اعتمادا على خصائص الصحافة، يمكن استخدام أنواع متميزة من مكشطة المواد.
  3. استخدام زر وضع Homing إذا لم يكن مكشطة المادة في أدنى موضع.
  4. ضع حاوية المادة مع مادة الاختبار المضغوطة رأسًا على رأسًا على مكشطة المادة. تأكد من أن زجاج حاوية المادة يواجه الجبهة. تأكد من أن اثنين من الثقوب في حاوية مادة تناسب على اثنين من دبابيس أعلى مولد الهباء الجوي. وضع لوحة قفل في فتحة على حاوية مادة وتشديد المسمار الأسود.
  5. تغيير قيم الأعلاف (0.24 إلى 20 مم/ساعة) والتدوير (1 إلى 800 ريفس/ساعة) إلى الإعدادات المطلوبة. يمكن تعديل تركيز الجسيمات عن طريق زيادة أو تقليل قيمة الأعلاف أو معدل تدفق الغاز الناقل.
  6. استخدام الأسهم الهبوطية لدفع أسفل الشريحة مع حاوية مادة حتى مكشطة مادة بالقرب من المادة الضغط.
  7. افتح مصدر الهواء المضغوط لمولد الهباء الجوي بنقرة من وحدة تحكم التدفق الشامل وابدأ توليد الهباء الجوي بالنقر على زر البدء. قم بتعيين معدل التغذية إلى 15-20 مم/ساعة لتجنب فترات الانتظار الطويلة.
  8. التحكم في توليد الجسيمات الصحيحة من خلال مراقبة سحابة الغبار الدقيقة مع مصباح يدوي صغير (وضعه من الأسفل خلف الأنبوب الزجاجي لـ Elutriator). قم بتغيير قيمة Feed مرة أخرى إلى الإعدادات المطلوبة عندما يصل بخار الهباء الجوي الأول باستمرار إلى Elutriator وانقر على زر الإيقاف.

10- تجارب التعرض

  1. بدء العرض المتوسط مع منتصف التعرض قبل تسخينها وملء وحدات أخذ العينات حتى يتم تغطية downpipes بينما وحدة مفتوحة. استخدم المضخة المتوسطة أو املأ الوسط يدويًا (25 مل لكل غرفة تعرض فردية).
  2. إدراج إدراج ثقافة الخلية العمياء (إدراج بدون خلايا) في وحدة التعرض. ضخ المتوسطة التعرض لأسفل حتى يتم تغطية downpipes مع المتوسطة والجانب السفلي من إدراج هي في اتصال مع المتوسطة.
  3. بدء مولد الهباء الجوي، وإغلاق وحدة التعرض وربط وحدة التعرض إلى منفذ وحدة التعرض لمولد الهباء الجوي. إعطاء مولد الهباء الجوي مهلة من 20-30 دقيقة على الأقل قبل بدء التعرض من أجل تمكين جيل مستقر من الجسيمات.
  4. إعداد لوحات ما بعد الحضانة لعناصر التحكم في الحاضنة وزراعة الخلايا المكشوفة تدرج خلال الفترة الزمنية. إضافة 1.5 مل من متوسط النمو لكل بئر واحتضان لوحات في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
  5. بعد المهلة، ختم منفذ وحدة التعرض من Elutriator مع المكونات المطاطية وإزالة إدراج أعمى. إعادة ملء المتوسطة التعرض (باستخدام المضخة أو يدويا) حتى يتم تغطية downpipes مع المتوسطة. الآن، فتح أيضا إمدادات الهواء المضغوط إلى وحدة الهواء النظيف مع الاستفادة من وحدة تحكم تدفق الشامل (3 لتر / دقيقة)
  6. إزالة الخلايا الثقافة إدراج من لوحات 6-well بمساعدة ملاقط. صب متوسط النمو بعناية من خلية الزرع إدراج قبالة عن طريق إسقاط إدراج واستنشاق والتخلص من السائل المتبقية باستخدام ماصة. وضع إدراج في غرف التعرض لكلا وحدات، والتعرض ووحدة الهواء النقي.
  7. إغلاق الوحدات وبدء تجارب التعرض عن طريق ربط وحدة التعرض إلى منفذ وحدة التعرض لمولد الهباء الجوي ووحدة الهواء النظيف إلى إمدادات الغاز الناقل في وقت واحد.
    ملاحظة: يمكن تعديل تركيز الجسيمات عن طريق زيادة / خفض قيمة الأعلاف ، ومعدل تدفق الغاز الناقل أو وقت التعرض.
  8. فصل التعرض والهواء النقي وحدات بعد الانتهاء من التجربة وختم منفذ وحدة التعرض.
  9. إيقاف إمدادات الهواء المضغوط ومولد الهباء الجوي عن طريق النقر على زر إيقاف.
  10. افتح وحدة التعرض والهواء النقي ونقل إدراج اتّزل الخلايا إلى لوحات ما بعد الحضانة المعدة باستخدام ملاقط. احتضان لوحات 6-well لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)في ALI.
    ملاحظة: كرر الخطوات 10.5-10.10 إذا تم التخطيط لمزيد من تجارب التعرض.
  11. رفع إدراج ثقافة الخلية، التي تستخدم كضوابط حاضنة لعلي في ظل نفس الظروف كما إدراج ثقافة الخلية المكشوفة واحتضانها لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)في ALI.
  12. استخدم وضع التوجيه لإزالة حاوية المادة. أغلق برنامج مولد الهباء الجوي بالنقر على X في الزاوية اليمنى العليا وأغلق الكمبيوتر.
  13. بعد الانتهاء من جميع تجارب التعرض، تنظيف مولد الهباء الجوي وكلا وحدات التعرض. إغلاق حاوية المادة مع parafilm إذا كان سيتم استخدام مادة الاختبار كذلك في غضون الأيام المقبلة.

اليوم الثالث

11- قابلية الخلايا للحياة

ملاحظة: تم تحديد صلاحية الخلية بعد 24 ساعة من ترسب الجسيمات عن طريق قياس نشاط الميتوكوندريا باستخدام معينات WST-1. تم إجراء الوطبقاً للمحضر ة التصنيع. يمكن أيضًا تحديد صلاحية الخلية باستخدام اختبارات صلاحية الخلية الأخرى (على سبيل المثال، XTT).

  1. خفف من متوسط النمو عند 37 درجة مئوية وذاب حل WST-1 المحمي من الضوء. إعداد عدد مناسب من لوحات جديدة 6-well مع 2.5 مل متوسط النمو لكل بئر واحتضان لوحات في الحاضنة.
  2. إعداد تخفيف WST-1 عن طريق تخفيف كمية كافية من WST-1 1:7 في وسط النمو
  3. إدراج ثقافة الخلية إدراج 24 ساعة بعد التعرض في لوحات جديدة أعدت 6-جيدا. أضف 1 مل من محلول WST-1 المعد حديثًا لكل إدراج ثقافة خلية. صخرة لوحات بعناية من أجل توزيع الحل متجانسة على الخلايا. احتضان لوحات 6-well مع إدراج ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
  4. نقل 100 ميكرولتر من السوبرناستان في ثلاثية من كل 6-well إلى لوحة 96-well. قياس الامتصاص في 450 نانومتر مع الطول الموجي المرجعي من 650 نانومتر باستخدام قارئ microplate.

12 - الإحصاءات

  1. تطبيع قدرة الخلية على البقاء من الضوابط حاضنة الفردية إلى 100٪.
  2. التعبير عن صلاحية الخلايا المكشوفة فيما يتعلق بضوابط الحاضنة الفردية. وقورنت السمية السيتومية للمواد الاختبارية بضوابط الحاضنة المعنية واستخدمت كمؤشر على السمية.

النتائج

وRFS CULTEX هو وحدات مصممة خصيصا في نظام التعرض للأشعة الكفية التي تمكن من التعرض المباشر ومتجانسة من الخلايا في ALI. وفي إطار دراسة سابقة سابقة قبل التحقق، تم بنجاح إثبات التطبيق العام لنظام التعرض هذا وقابليته للتحويل والاستقرار وقابلية الاستنساخ. وفي مشروع بحثي حديث مولته ?...

Discussion

وقد تم تطوير العديد من نماذج اختبار سمية الاستنشاق غير الحيوانية في السنوات الأخيرة من أجل الحصول على معلومات حول خطر الاستنشاق الحاد للجسيمات القابلة للاستنشاق والحد من التجارب على الحيوانات واستبدالها وفقًا لمبدأ 3R25.

من حيث نماذج زراعة الخلايا ، يمكن أن يتم...

Disclosures

المؤلفين AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT و DS ليس لديهم ما يكشف. تنتج شركة Cultex Technology GmbH (مختبرات Cultex GmbH سابقاً) أدوات (على سبيل المثال، CULTEX RFS، CULTEX DG) المستخدمة في هذه المقالة. وكان NM موظف في مختبرات Cultex GmbH خلال هذه الدراسة. موافق هو موظف في Cultex التكنولوجيا GmbH (سابقا مختبرات Cultex GmbH). براءة البراءات PCT/EP2009/007054 للجهاز هو عقد من قبل مؤسس Cultex التكنولوجيا GmbH البروفيسور الدكتور أولريش مور (سابقا مختبرات Cultex GmbH).

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والبحث الاتحادية الألمانية (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, ألمانيا (المنحة 031A581, المشروع الفرعي A-D)) ومؤسسة البحوث الألمانية (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, مجموعة التدريب البحثي GRK 2338).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
A549ATCCCCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEMBiochrom, Berlin, GermanyFG 0415used as growth medium
DMEMGibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany22320used as exposure medium
FBS superiorBiochrom, Berlin, GermanyS 0615
Gentamycin (10mg/mL)Biochrom, Berlin, GermanyA 2710
HEPES 1MTh. Geyer, Renningen, GermanyL 0180
PBSBiochrom, Berlin, GermanyL 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)Biochrom, Berlin, GermanyL 2143
Cell culture material
CASY CupsRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, GermanyREF 05651794
Cell culture platesCorning, Wiesbaden, Germany35166­-well plates
Corning Transwell cell culture insertsCorning, Wiesbaden, Germany345024mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYtonRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, GermanyREF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021)Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany2290152
WST-1Abcam, Cambridge, United Kingdomab155902
Instruments + equipment
CASY Cell CounterSchärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostatLAUDA, Lauda-Königshofen, GermanyEcoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic PressCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeveCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large)Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, GermanyLP-050Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small)Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany9933-05-DQBalston disposable filter
Medium pumpCole-Parmer GmbH, Wertheim, GermanyIsmatec IPC High Precision Multichannel Dispenserdigital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 ProTecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pumpKNF, Freiburg, GermanyN86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/minTrigasFI GmbHVögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water BathLAUDA, Lauda-Königshofen, GermanyEcoline Staredition RE 104

References

  1. Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
  2. De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
  3. LANUV Nordrhein-Westfalen. . Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
  4. Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
  5. Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
  6. Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
  7. Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
  8. Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
  9. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  10. Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  11. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
  12. Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  13. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  14. Eskes, C., Whelan, M. . Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).
  15. Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
  16. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
  17. Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
  18. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
  19. Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
  20. OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).
  21. OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).
  22. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
  23. Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
  24. Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
  25. Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
  26. OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).
  27. OECD. . Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved