JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولًا للكشف عن الأجسام المضادة الفلورية بوساطة البروتينات في الاستعدادات الكاملة لأجنة ويرقات سمك الحمار الوحشي.

Abstract

المناعة هي تقنية تستخدم على نطاق واسع لاستكشاف التعبير عن البروتين وتوطينه خلال كل من حالات النمو والأمراض الطبيعية. على الرغم من أن العديد من بروتوكولات الكيمياء المناعية قد تم تحسينها لأنسجة الثدييات وأقسام الأنسجة ، فإن هذه البروتوكولات غالبًا ما تتطلب التعديل والتحسين للكائنات النموذجية غير الثديية. تستخدم سمكة الحمار الوحشي بشكل متزايد كنظام نموذجي في البحوث الأساسية والطبية الحيوية والانتقالية للتحقيق في الآليات الجزيئية والوراثية والبيولوجية للخلايا في عمليات التطوير. حمار وحشي تقدم العديد من المزايا كنظام نموذجي ولكن أيضا تتطلب تقنيات معدلة للكشف عن البروتين الأمثل. هنا ، نقدم بروتوكولنا لكامل جبل الفلورالكيمياء المناعية في أجنة حمار وحشي واليرقات. ويصف هذا البروتوكول بالإضافة إلى ذلك عدة استراتيجيات مختلفة للتركيب يمكن استخدامها ونظرة عامة على المزايا والعيوب التي توفرها كل استراتيجية. كما نصف أيضًا التعديلات المدخلة على هذا البروتوكول للسماح بالكشف عن ركائز الكروموجين في أنسجة اليتصاعد الكاملة والكشف عن الفلورسينس في أنسجة اليرقات المقطعة. ينطبق هذا البروتوكول بشكل عام على دراسة العديد من مراحل النمو والهياكل الجنينية.

Introduction

ظهر سمك الحمار الوحشي(Danio rerio)كنموذج قوي لدراسة العمليات البيولوجية لعدة أسباب بما في ذلك وقت الجيل القصير ، والتطور السريع ، وسهولة التقنيات الوراثية. ونتيجة لذلك، تستخدم عادة حمار وحشي في المستويات العالية من الإنتاجية الصغيرة الجزيئات شاشات للبحوث السمية واكتشاف المخدرات. كما أن سمك الحمار الوحشي هو نموذج جذاب لدراسة عمليات النمو بالنظر إلى أن أنثى واحدة يمكنها إنتاج 50-300 بيضة بشكل روتيني في كل مرة، وأن الأجنة الواضحة بصريًا تتطور خارجيًا مما يسمح بالتصور الفعال لعمليات النمو. ومع ذلك، اعتمدت الأبحاث المبكرة في الغالب على الشاشات الوراثية الأمامية باستخدام N-إيثيل-ن-نيتروسوريا (ENU) أو غيرها من المغيرات بسبب التحديات في إنشاء تقنيات وراثية عكسية. منذ ما يقرب من عقدين من الزمان ، تم استخدام موربولينو لأول مرة في حمار وحشي لضرب الجينات المستهدفة1. مورفولينوس هي قلة القلة المضادة للشعور الصغيرة التي تمنع ترجمة مرنا المستهدفة بعد الحقن المجهري في الجنين في مرحلة مبكرة من النمو. نقطة ضعف رئيسية من موربولينوس هو أنها مخففة كما تنقسم الخلايا وتفقد فعاليتها عموما من قبل 72 ساعة بعد الإخصاب (hpf). في حين أن morpholinos لا تزال أداة قوية لتعطيل الجينات حمار وحشي، النسخ المنشط مثل تأثير nucleases (TALENs)، nucleases الزنك الإصبع (ZFNs)، ومتجمعة بانتظام يكرر palindromic قصيرة (CRISPRs) يتم استخدامها في الآونة الأخيرة لاستهداف الجينوم حمار وحشي مباشرة2،3. وقد أنشأت هذه الاستراتيجيات الجينية العكسية، إلى جانب علم الوراثة إلى الأمام وشاشات الإنتاجية العالية، سمك الحمار الوحشي كنموذج قوي لدراسة التعبير الجيني والوظيفة.

تتطلب القدرة على دراسة وظيفة الجينات بشكل عام تقييمًا للتوزيع المكاني والزمني للتعبير عن الجينات أو المنتجات الجينية. الأسلوبان الأكثر استخداماً لتصور أنماط التعبير هذه أثناء التطوير المبكر هما التهجين في الموقع (ISH) وكيمياء الهيستوكيميائية الكاملة (IHC). في الموقع تم تطوير التهجين لأول مرة في عام 1969 ويعتمد على استخدام مسابير الحمض النووي الريبي المضادة للتحسس للكشف عن تعبير مرنا في كائن حي4. في المقابل، يتم استخدام الأجسام المضادة المسماة في الكيمياء المناعية لتصور التعبير البروتيني. تعود فكرة وضع العلامات على البروتينات للكشف عنها إلىعام 1930 و5 وتم نشر أول تجربة للسنة الدولية للخدمات الإنسانية في عام 1941 عندما تم استخدام الأجسام المضادة المسماة FITC للكشف عن البكتيريا المسببة للأمراض في الأنسجة المصابة6. وقد تطورت ISH وIHC بشكل ملحوظ على مدى العقود اللاحقة ، وتستخدم الآن على حد سواء بشكل روتيني في مختبر البحوث الجزيئية والتشخيصية7،8،9،10،11. في حين أن كلا التقنيتين لها مزايا وعيوب ، تقدم المدينة العالمية للخدمات الإنسانية العديد من الفوائد على ISH. عمليا ، هو أقل بكثير من الوقت المستهلكة من ISH وعموما أقل تكلفة اعتمادا على تكلفة الأجسام المضادة الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، التعبير مرنا ليست دائما مقياس موثوق به من التعبير البروتين كما ثبت في الفئران والبشر أن حوالي ثلث فقط من البروتين وفرة الاختلاف يمكن تفسيره من قبل وفرة مرنا12. لهذا السبب، تعد المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مكملاً هاماً لتأكيد بيانات ISH، عندما يكون ذلك ممكناً. وأخيراً، يمكن أن توفر المدينة العالمية للخدمات الإنسانية بيانات دون خلوية وبيانات توطين مشترك لا يمكن تحديدها بواسطة ISH13و14و15. هنا ، نصف طريقة خطوة بخطوة للكشف الموثوق عن البروتينات عن طريق الكيمياء المناعية في أجنة ويرقات حمار وحشي جبل كامل. الهدف من هذه التقنية هو تحديد التعبير المكاني والزماني لبروتين مهم في الجنين بأكمله. تستخدم هذه التقنية الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالمستضدات والأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلور. البروتوكول قابل للتكيف بسهولة للاستخدام على أقسام الأنسجة المثبتة على الشرائح وللاستخدام مع ركائز كروموجينية بدلاً من الفلورسينس. باستخدام هذا البروتوكول, ونحن نثبت أن تطوير حمار وحشي العضلات الهيكل العظمي يعبر عن مستقبلات الغلوتامات ionotropic, بالإضافة إلى مستقبلات أستيل. NMDA من نوع الغلوتامات مستقبلات الوحدات الفرعية يمكن الكشف عنها على العضلات الطولية في 23 hpf.

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات العمل مع البالغين والمستثرين من تربية سمك الحمار الوحشي الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات في جامعة ولاية موراي.

1. جمع الأجنة والتثبيت

  1. إعداد خزانات التفريخ عن طريق وضع أزواج الجنس المختلط حمار وحشي الكبار أو مجموعات في خزانات مع بطانة شبكة أو مشقوق مليئة بمياه النظام بين عشية وضحاها.
  2. عند تشغيل الأضواء، قم بتغيير مياه خزان التفريخ للحصول على مياه النظام العذبة لإزالة البراز. استخدم دورة داكنة فاتحة 14 ساعة/ساعة مع أضواء قادمة في الساعة 9 صباحًا.
  3. بمجرد وضع البيض، أعد البالغين إلى الخزانات المنزلية.
  4. جمع البيض عن طريق رسم لهم حتى باستخدام أنبوب نقل أو صب لهم في مصفاة شبكة.
  5. نقل البيض إلى أطباق بيتري مليئة في منتصف الطريق مع وسط الجنين (مثل 30٪ دانيو أو E2 وسط الجنين مع 0.5 ملغ / لتر الميثيلين الأزرق)، والحد من عدد الأجنة لكل طبق إلى 50.
  6. إزالة أي البيض التي هي ميتة أو تفشل في الانقسام.
    ملاحظة: يمكن التعرف بسهولة على الأجنة الميتة لأنها تصبح معتمة وغالباً ما تظهر "غائمة". إذا تمت إضافة الأزرق الميثيلين إلى وسط الجنين، فإن الأجنة الميتة تأخذ مظهرًا أزرق داكنًا.
  7. احتضان أطباق البيض عند 28.5 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة المطلوبة. لهذه التجربة، ارفع الأجنة حتى 23 ح. بف.
  8. اختياري) نقل الأجنة في 24 hpf إلى 200 ميكرومتر 1-الفينيل 2-thiourea (PTU) في وسط الجنين لمنع تكوين الميلانينوسيس16،17. بدلاً من ذلك، الأجنة المبيضة بعد التثبيت (انظر القسم الاختياري 5).
  9. تغيير متوسط الجنين أو PTU المتوسط يوميا.
  10. Dechorionate الأجنة غير المفقسة باستخدام ملقط فائقة الدقيقة تلميح تحت المجهر. بدلا من ذلك، الأجنة dechorionate كيميائيا عن طريق احتضان في 1 ملغ / مل بروناس في وسط الجنين لعدة دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة الأجنة من بروناس وغسل ثلاث مرات مع وسط الجنين.
  11. الأجنة الديشورية سوف تلتصق بالبلاستيك الاحتفاظ بها في الزجاج أو البلاستيك بيتري أطباق مغلفة 1-2٪ agarose المذابفية في وسط الجنين. نقل الأجنة dechorionated باستخدام الأنابيب باستور المصقول النار للحد من الضرر.
  12. نقل الأجنة إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي باستخدام البلاستيك أو أنبوب مصقول النار.
  13. إزالة وسط الجنين مع ميكروبيبيت. اترك سائلًا كافيًا فقط لتغطية الأجنة بعد كل تغيير في السوائل.
  14. إعداد 4٪ paraformaldehyde (PFA) في 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) في غطاء الدخان الكيميائية.
    تنبيه: PFA هو مادة خطرة. ارتداء القفازات والتخلص من السوائل والمواد الصلبة الملوثة في المناطق المحددة.
  15. إصلاح الأجنة في 4٪ PFA لمدة 1-2 ساعة مع هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك، إصلاح الأجنة 4 ساعات إلى بين عشية وضحاها في 4 °C.
  16. غسل ثلاث مرات في 1x PBS + 1٪ تريتون-X (PBTriton) لمدة 5 دقيقة.
  17. استخدم الأجنة على الفور أو تخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  18. للتخزين على المدى الطويل، وتجفيف الأجنة في الميثانول 100٪ (MeOH) 2 ساعة أو بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية. تخزين الأجنة في -20 درجة مئوية في MeOH لعدة أشهر.
    تنبيه: MeOH هي مادة خطرة. ارتداء القفازات والتخلص من السوائل والمواد الصلبة الملوثة في المناطق المحددة.

2. إعداد الجنين

  1. إعادة ترطيب الأجنة من خلال الاحتضان التسلسلي في درجة حرارة الغرفة.
    1. احتضان في 75 ٪ MeOH / 25 ٪ 1x PBS لمدة 5 دقيقة ، هزاز.
    2. احتضان في 50 ٪ MeOH / 50 ٪ 1x PBS لمدة 5 دقيقة ، هزاز.
    3. احتضان في 25 ٪ MeOH / 75 ٪ 1x PBS لمدة 5 دقيقة ، هزاز.
    4. احتضان في 100٪ PBTriton لمدة 5 دقيقة، هزاز.
  2. (اختياري) إعداد محلول عمل بروتينات K طازج (10 ميكروغرام/مل في PBTriton) على الثلج عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من مخزون البروتينات K المذاب ة حديثًا (10 ملغم/مل).
    1. Permeabilize الأجنة عن طريق هضم ما يصل إلى 30 دقيقة في بروتينات K.
      ملاحظة: التوقيت المقترح هو < 24 hpf: لا الهضم; 24 hpf: 15 دقيقة الهضم; و 7 أيام من العمر: 30 دقيقة الهضم.
    2. شطف الأجنة permeabilized في PBTriton وإعادة إصلاح في 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. غسل الأجنة ثلاث مرات في PBTriton لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.

3. حضانة الأجسام المضادة الأولية

  1. حدد محلول حظر تجاري أو مصل يطابق الأنواع المضيفة الثانوية للأجسام المضادة (على سبيل الـ 10٪ مصل الماعز في PBTriton) مع أو بدون 2 ملغ /مل بومبلس البقري الألبومين (BSA).
  2. منع الأجنة في حل حجب لمدة 1-3 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية أثناء هزاز.
  3. احتضان في الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب أو 1٪ مصل في PBTriton بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حين هزاز. في هذه التجربة، كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة المضادة NMDAR1، ومستقبلات مكافحة عموم AMPA، ومكافحة فوسفو-هيستون H3، كل المخفف إلى تركيز نهائي من 1:500 في 1٪ مصل الماعز في PBTriton.
  4. يغسل خمس مرات في PBTriton لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أثناء الهزاز.

4. حضانة الأجسام المضادة الثانوية

  1. حدد جسمًا مضادًا ثانويًا استنادًا إلى الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي والطول الموجي المطلوب.
  2. احتضان في الأجسام المضادة الثانوية المخفف في محلول الحجب أو 1٪ مصل لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية) أثناء هزاز.
    ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية الفلورية حساسة للضوء. استخدمنا 1:500 الماعز المضادة للفأرة Alexa488 المخفف في 1٪ مصل الماعز في PBTriton.
  3. تغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم أو تغطية مع مربع حجب الضوء لهذا وجميع الخطوات اللاحقة.
  4. يغسل ثلاث مرات في PBTriton لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء الهزاز.
  5. نقل الأجنة إلى محلول الجلسرين 50٪ في برنامج تلفزيوني على سرير من 2٪ أغاروز في وسط الجنين والمضي قدما في التوثيق أو المضي قدما في مزيد من خطوات المعالجة أدناه.

خطوات اختيارية

5- التبييض

  1. إعداد محلول التبييض في أنبوب 1.5 مل عن طريق إضافة 810.7 ميكرولتر من ddH2O، 89.3 ميكرولتر من 2 م كوه، و 100 ميكرولتر من 30٪ H2O2.
  2. عكس الأنبوب ثلاث مرات لخلط.
  3. ماسيت 1 مل من اتجاه محلول التبييض إلى الأجنة.
  4. افتح غطاء أنبوب الجنين للسماح للغاز بالهروب. اضغط بلطف على الأنبوب على مقاعد البدلاء لطرد الفقاعات.
  5. مراقبة عملية التبييض (استخدام المجهر إذا لزم الأمر) ووقف رد الفعل عندما تتم إزالة الصباغ بما فيه الكفاية (حوالي 5 دقيقة ل24 hpf أو 10 دقيقة ل72 hpf).
  6. قم بإزالة محلول التبييض بعناية باستخدام ميكروبيبت وشطف الأجنة ثلاث مرات في 1 مل من PBTriton.
    ملاحظة: الأجنة لزجة في هذه الخطوة.
  7. انتقل إلى الوثائق أو المزيد من خطوات المعالجة أدناه.

6. تشريح الجنين وإزالة الصفار

  1. لإزالة صفار، نقل كمية صغيرة (~ 200 ميكرولتر أو ما يكفي لتغطية الجنين تماما ولكن تقييدية بما يكفي للحد من حيث يمكن أن تطفو) من 1x PBS إلى شريحة الاكتئاب أو شريحة الزجاج العادي.
  2. استخدام أنبوب نقل البلاستيك لنقل 1 أو أكثر من الأجنة إلى قطرات PBS.
  3. استخدام ملقط فائقة الدقة و00 دبابيس الحشرات لكسر صفار وبلطف جدا كشط حبيبات صفار من السطح البطني للجنين (انظر أيضا تشنغ وآخرون، 2014)18.
  4. إزالة حبيبات صفار وتجديد برنامج تلفزيوني حسب الحاجة.
  5. كرر حتى الجنين خالية بما فيه الكفاية من صفار.

7. تركيب شقة على الشرائح

  1. نقل الأجنة المنقطع عنها إلى شريحة زجاجية مشحونة مع ماصة بلاستيكية أو ميكروبيبات 1 مل مع طرف مشذب (للحد من إجهاد القص). الشرق على النحو المطلوب مع 200 ميكروبيبات تلميح ميكروبيبأو دبوس الحشرات.
  2. الفتيل بعيدا برنامج تلفزيوني الزائدة مع مسح كيم أو منشفة ورقية.
  3. أضف 2-3 قطرات من الوسائط المتصاعدة إلى الشريحة وقسيمة الغطاء.
  4. الهواء الجاف لمدة 5 إلى 10 دقيقة تقريبا.
  5. ختم الزجاج غطاء على الشريحة مع طلاء الأظافر واضحة.
    ملاحظة: يجب تغطية حواف زجاج الغلاف بالكامل بطبقة رقيقة ومستمرة من طلاء الأظافر.
  6. السماح لتجف ما يقرب من 10 دقيقة قبل التصوير.

8. تصاعد في أغاروز

  1. إعداد 1٪ أغاروز في وسط الجنين عن طريق إضافة 0.5 غرام من أغاروز إلى 50 مل من وسط الجنين في قارورة آمنة من الميكروويف أو كوب من حجم 3x على الأقل أكبر من المطلوب.
  2. الحرارة في الميكروويف، يحوم كل 30 s، حتى يذوب أغاروز تماما.
  3. جعل 1 مل aliquots في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي. تخزين aliquots في درجة حرارة الغرفة.
  4. تغطية قبعات أنبوب مع أقفال غطاء قبل التدفئة.
  5. ضع أنابيب أغاروز في حامل أنبوب عائم في كوب نصف مملوء بالماء.
  6. الميكروويف الكأس مع أنابيب عائمة لمدة 2-3 دقيقة، أو حتى يذوب أغاروز تماما.
  7. نقل جنين إلى الشريحة المجسرة باماصة بلاستيكية أو ميكروبيبة 200 ميكروبيت مع طرف مشذب (للحد من إجهاد القص).
  8. ضع الجنين على غطاء مستطيل باستخدام دبابيس الحشرات وأضف ما يقرب من 20 ميكرولتر من الأغروس اصهر مباشرة إلى الجنين.
  9. توجيه بسرعة المنطقة ذات الاهتمام الأقرب إلى قسيمة الغلاف باستخدام 00 دبابيس الحشرات.
    ملاحظة: هذا هو جبل رأسا على عقب.
  10. إعادة أنبوب agarose إلى أنبوب الماء الساخن تطفو بين كل استخدام والميكروويف حسب الحاجة.
  11. الصورة باستخدام المجهر عندما يتصلب الأغروس. حافظ على الجنين المركب رأسًا على عقب لاستخدامه على المجهر المقلوب. الوجه أكثر من قسيمة الغطاء (حتى agarose تحت غطاء) للاستخدام على المجاهر تستقيم.

9. تصاعد على الشرائح جسر

  1. لجعل الشرائح جسر، الغراء القسائم المربعة إلى الشريحة الزجاجية باستخدام نقطة صغيرة من superglue.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك حوض صغير على الأقل 5 مم واسعة بين القسائم. اثنين #1 coverslips عالية عادة ما تكون مناسبة ل24-48 hPF الأجنة في حين أن ثلاثة coverslips عالية قد تكون ضرورية ل72 hpf.
  2. نقل 1-2 الأجنة deyolked إلى الشريحة جسر مع ماصة بلاستيكية أو ميكروبيب200 ميكروبيب مع طرف قلصت (للحد من الإجهاد القص).
  3. الفتيل بعيدا السوائل الزائدة مع مسح كيم أو منشفة ورقية.
  4. إضافة قطرة من الجلسرين ≥ 80٪ مباشرة إلى الجنين.
  5. تغطية مع الزجاج غطاء مستطيلة. وينبغي أن قطرة من الجلسرين لمس الزجاج الغطاء.
  6. إضافة المزيد من الجلسرين إلى المسافة بين الزجاج الغطاء والشريحة حسب الحاجة لتغطية الجنين تماما مع هامش من الجلسرين على جانبي الجنين.
  7. حرك زجاج الغطاء المستطيل بلطف للفة الجنين في موضعه للتصوير.

10. DAB تلطيخ

ملاحظة: يبدأ هذا القسم بعد الخطوة 4.2 أعلاه ويحل محل بقية الخطوة 4.

  1. احتضان الأجنة في محلول مانع مع جسم مضاد ثانوي مترافق مع البيروكسيديز لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية أثناء الهزاز.
  2. يغسل ثلاث مرات في PBTriton لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. نقل الأجنة إلى لوحة الثقافة أو شريحة الاكتئاب مع ماصة نقل.
  4. مزيج 50 ميكرولتر من 1٪ DAB (3,3'-diaminobenzidine) المذابة في ddH2O و 50 μL من بيروكسيد الهيدروجين 0.3٪ وتقديمهم إلى 1 مل مع PBS.
    تنبيه: DAB هو مادة خطرة. ارتداء القفازات والتخلص من السوائل والمواد الصلبة الملوثة DAB في المناطق المحددة.
  5. قم بتغطية الأجنة الملطخة بـ HRP باستخدام محلول DAB المعد أعلاه ومراقبة تطور الألوان (عادة ً 1-5 دقيقة) تحت المجهر.
  6. بعد الوصول إلى المستوى المطلوب من تطور اللون ، شطف الأجنة لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني.
  7. نقل الأجنة مرة أخرى إلى أنبوب 1.5 مل قبل التثبيت.
  8. إعادة إصلاح الأجنة لمدة 15-20 دقيقة في 4٪ PFA في درجة حرارة الغرفة.
  9. غسل الأجنة ثلاث مرات في PBTriton لمدة 5 دقيقة.
  10. انتقل إلى الوثائق.

11. بروتوكول تعديل لتلطيخ الأنسجة المقطعة التي يتم تركيبها على الشرائح

  1. تطويق الأنسجة لتكون ملطخة مع قلم باب.
  2. نقل الشرائح إلى غرفة رطبة.
  3. إضافة 1 مل من PBS مباشرة إلى الشريحة.
  4. احتضان 7 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة تضمين المتوسطة.
  5. صب قبالة برنامج تلفزيوني عن طريق عكس الشريحة.
  6. Rehydrate 1 دقيقة في ما يصل إلى 1 مل من العازلة TNT (100 mM تريس درجة الحموضة 8.0، 150 mM NaCl، 0.1٪ Tween20).
  7. كتلة في ما يصل إلى 1 مل من حل الحجب (التجاري أو 10٪ مصل + 2٪ BSA) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. احتضان بين عشية وضحاها في الأجسام المضادة الأولية المخففة في 1٪ مصل أو منع الحل في 4 درجة مئوية.
  9. غسل خمس مرات في ما يصل إلى 1 مل من العازلة TNT في درجة حرارة الغرفة.
  10. احتضان في الأجسام المضادة الثانوية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C. تغطية الغرفة مع احباط أو استخدام غطاء داكن.
  11. يغسل خمس مرات في TNT في درجة حرارة الغرفة. صب قبالة غسل الماضي.
  12. جبل مع 2-3 قطرات من المتوسطة المتصاعدة وغطاء. اسمحوا الجلوس 5-10 دقيقة.
  13. ختم الزجاج غطاء على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة. السماح لتجف تماما قبل التصوير.

12 - الوثائق

  1. تسجيل الإجراء الكامل وأية انحرافات في دفتر ملاحظات المختبر.
  2. تسجيل التركيز والاسم ورقم الكتالوج والشركة المصنعة ورقم اللوط للجسم المضاد الأساسي.
  3. ضع عينة محمولة بشكل مناسب على مسرح المجهر. تحديد موقع المنطقة ذات الاهتمام.
  4. حدد مثالًا ساطعًا نسبيًا. تعيين التعرض للكاميرا وكسب بحيث إشارة مشرقة بما فيه الكفاية دون تشبع.
  5. قارن شدة تلطيخ نفس المنطقة ذات الاهتمام باستخدام إعدادات التعرض نفسها عند المقارنة بين الأجنة التجريبية المسماة بالأجسام المضادة وخلايا الأجسام المضادة للتحكم (مثل IgG).

النتائج

كامل جبل المناعةhistochemistry يستخدم الأجسام المضادة للكشف عن النمط المكاني للتعبير البروتين في الحيوان سليمة. سير العمل الأساسي للكيمياء المناعية (الموضحة في الشكل 1)ينطوي على تربية سمك الحمار الوحشي ، ورفع وإعداد الأجنة ، ومنع المستضدات غير محددة ، وذلك باس?...

Discussion

المناعة هي أداة متعددة الاستخدامات التي يمكن استخدامها لتوصيف التعبير المكاني والزماني من أي بروتين تقريبا من الفائدة في كائن حي. يستخدم الكيمياء المناعية على مجموعة واسعة من الأنسجة والكائنات الحية النموذجية. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام في حمار وحشي. قد تتطلب الكيمياء المناع?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي معلومات للكشف عنها.

Acknowledgements

التمويل من المعاهد القومية للصحة منحة 8P20GM103436 14.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseFisher ScientificBP160-100
Aluminum foil, heavy dutyKirklandAny brand may be substituted
Anti-NMDA antibodyMillipore SigmaMAB363
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002Millipore Sigma05-598
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)Millipore SigmaMABN832
Bovine serum albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]Sigma AldrichC4955
Centrifuge tubes, 1.5 mLAxygenMCT150C
Clear nail polishSally HansonAny nail polish or hardener may be subsituted
Depression (concavity) slideElectron Miscroscopy Sciences71878-01
DiaminobenzidineThermo Scientific1855920
Embryo medium, Danieau, 30%17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.
Embryo medium, E27.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue
Floating tube holderThermo Scientific59744015
Fluorescence compound microscopeLeica BiosystemsDMi8
Fluorescence stereomicroscopeLeica BiosystemsM165-FC
Glass coverslips 18 mm x 18 mmCorning284518
Glass coverslips 22 mm x 60 mmThermo Scientific22-050-222
Glass slidesFisher Scientific12-544-4
GlycerolFisher ScientificBP229-1
Goat anti-mouse IgG Alexa 488InvitrogenA11001
HEPES solutionSigma AldrichH0887
Humid chamber with lidSimportM920-2
Hydrogen peroxide, 30%Fisher ScientificH325-500
Immunedge pap penVector labsH-4000
Insect pins, size 00Stoelting5213323
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O)Sigma Aldrich63138
Mesh strainerOneidaAny brand may be substituted
MethanolSigma Aldrich34860
Methylene blueSigma AldrichM9140
Micro-tube cap lockResearch Products International145062
Microwave ovenToastmaster
Mouse IgGSigma AldrichI8765
Normal goat serumMillipore SigmaS02L1ML
Nutating mixerFisher Scientific88-861-044
ParaformaldehydeFisher Scientific04042-500
Pasteur pipettesFisher Scientific13-678-20C
PBTriton1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount mounting mediumFisher ChemicalSP15-500
Petri dish (glass)Pyrex3160100
Petri dish (plastic)Fisher ScientificFB0875713
1-phenyl 2-thioureaAcros Organics207250250
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4Gibco70011-044
Phosphate buffered saline (PBS), 1x1x made from 10x stock diluted in dH2O
Potassium Chloride (KCl)Sigma AldrichP9333
Potassium Hydroxide (KOH)FisherP250-500
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
PronaseSigma Aldrich10165921001
Proteinase KInvitrogenAM2544
Sodium Chloride (NaCl)Sigma AldrichS7653
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)Sigma AldrichS7907
Spawning tank with lid and insertAquaneeringZHCT100
SuperBlock PBSThermo Scientific37515
Superfrost + slidesFisher Scientific12-550-15
Superglue gel3M Scotch
TNT100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O
Transfer pipetteFisher13-711-7M
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)Sigma AldrichT6399
Tris BaseFisher ScientificS374-500
TritonX-100Sigma AldrichT9284
Tween20Fisher ScientificBP337-500
Ultrafine forcepsFisher Scientific16-100-121
Water, ultrapure/double distilledFisher ScientificW2-20

References

  1. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  4. van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
  5. Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
  6. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  7. Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
  8. Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
  9. Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
  10. Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).
  11. Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  13. Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
  14. Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
  15. Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
  16. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
  17. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
  18. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  19. Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
  20. Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
  21. Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
  22. Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
  23. Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
  24. Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
  25. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  26. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
  27. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  29. Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
  30. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
  31. Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved