تحليل متعدد النطاقات لنمو البكتيريا تحت علاج الإجهاد

Summary

يتيح هذا البروتوكول وصفا لنمو البكتيريا في ظروف الإجهاد في الخلية الواحدة ومستويات الخلايا السكانية.

Abstract

تحليل القدرة البكتيرية علي النمو والبقاء علي قيد الحياة في ظل ظروف الإجهاد أمر ضروري لمجموعه واسعه من دراسات علم الاحياء المجهرية. ومن المهم ان تميز استجابه الخلايا البكتيرية لعلاجات تحفز الإجهاد مثل التعرض للمضادات الحيوية أو غيرها من المركبات المضادة للميكروبات ، والتشعيع ، والحموضة غير الفسيولوجية ، ودرجه الحرارة ، أو تركيز الملح. قد تزعج علاجات الإجهاد المختلفة العمليات الخلوية المختلفة ، بما في ذلك انقسام الخلايا ، وتكرار الحمض النووي ، وتخليق البروتين ، وسلامه الغشاء ، أو تنظيم دوره الخلية. ترتبط هذه التاثيرات عاده بالأنماط الظاهرية المحددة علي النطاق الخلوي. ولذلك ، فان فهم مدي وسببيه النمو المستحث بالإجهاد أو أوجه القصور في القدرة علي البقاء يتطلب تحليلا دقيقا لعده بارامترات ، سواء علي صعيد الخلية الواحدة أو علي مستوي السكان. الاستراتيجية التجريبية المعروضة هنا تجمع بين رصد الكثافة البصرية التقليدية والطلاء الاختبارات مع تقنيات تحليل خليه واحده مثل تدفق الخلوي والتصوير المجهري في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. ويتيح هذا الإطار المتعدد المقاييس وصفا لأثر ظروف الإجهاد علي مصير السكان البكتيريين.

Introduction

الغرض العام من هذا البروتوكول هو تحليل سلوك الخلايا البكتيرية المعرضة للعلاجات الإجهاد علي السكان وعلي مستويات خليه واحده. البكتيريا النمو والقدرة علي البقاء وتعالج تقليديا علي مستوي السكان باستخدام الرصد الكثافة البصرية (OD_600nm) ، والذي هو وكيل لتوليف الخلايا البكتيرية الشامل ، أو عن طريق اختبارات الطلاء لتحديد تركيز خلايا قابله للحياة في الثقافة (مستعمره تشكيل وحده في المليلتر ، كفو/مل). في ظل ظروف النمو العادية (غير المجهدة) ، يتم ربط القياسات الOD_600nm و CFU/mL بدقه لان الوقت المضاعف البكتيري يعتمد مباشره علي زيادة كتله الخلية^1،2. ومع ذلك ، غالبا ما تتعطل هذه العلاقة في ظل الظروف التي تؤثر علي الخلية التوليف الشامل³، خليه تقسيم⁴، أو ان الزناد خليه تحلل. قدمت مثال بسيطه بإجهاد معالجه ان يمنع خليه تقسيم, اي ينتج في التشكيل من خلايا جرثوميه [فيلوكمننوس]^5,6. أطاله الخلايا الخيطية عاده لان التوليف الشامل للخلايا لا يتاثر ، ولكنها غير قادره علي التقسيم إلى خلايا قابله للحياة. الثقافة بصريه كثافة بالتالي سيزيد مع وقت في معدل عادية غير ان لا التركيز من خلايا قابل للحياة يحدد بطليه اختبارات ([وت]/[مل]). في هذه الحالة ، كما هو الحال في العديد من الآخرين ، والكثافة البصرية وقياسات الطلاء هي مفيده ولكنها تفشل في توفير فهم شامل للتاثير الناجم عن الإجهاد المرصود. هذه الاختبارات الفرقة تحتاج إلى الجمع بين تقنيات تحليل خليه واحده للسماح لتوصيف متعمق لنقص النمو الناجم عن الإجهاد.

ويرد هنا وصف لاجراء يجمع بين أربعه نهج تجريبية تكميليه: (1) اختبارات الطلاء التقليدية ورصد الكثافة البصرية الاساسيه لرصد قابليه الخلية للاستمرار وتوليف الخلايا علي التوالي ؛ (2) قياس التدفق الخلوي لتقييم حجم الخلية ومعلمات محتوي الحمض النووي علي اعداد كبيره من الخلايا ؛ (3) التصوير المجهري لقطه لتحليل المورفولوجية الخلية. و (4) التصوير بالخلايا الاحاديه الفاصلة زمنيا في الغرف الصغيرة لفحص الديناميكيات الزمانيه لمصير الخلية. ويسمح هذا الإطار المتعدد النطاقات بتفسير الآثار العالمية علي نمو الخلايا وقابليتها للاستمرار في ضوء سلوك الخلايا الفردية. ويمكن تطبيق هذا الاجراء علي فك الاستجابة من الأنواع البكتيرية المتنوعة لأي إجهاد تقريبا من الفائدة ، بما في ذلك النمو في ظل ظروف معينه (اي ، متوسط النمو ، الأس الهيدروجيني ، درجه الحرارة ، تركيز الملح) ، أو التعرض للمضادات الحيوية أو غيرها مركبات مضاده للميكروبات.

Protocol

1. ثقافة الخلية ، والحث علي الإجهاد ، واجراء أخذ العينات

ملاحظه: استخدام الأواني الزجاجية المعقمة الثقافة ، ونصائح ماصه ، ومتوسط النمو المصفاة في 0.22 μm لتجنب جزيئات الخلفية. هنا ، تزرع الثقافات الخلية في انخفاض الفلورية المتوسطة الغنية المعرفة (انظر جدول المواد)^7،8.

1. خط السلالة البكتيرية من الفائدة من الأسهم المجمدة الجلسرين علي صفيحه المرق (LB) اجنشا (مع المضادات الحيوية الانتقائية إذا لزم الأمر) واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها (17 ح).
   ملاحظه: المثال التجربة المقدمة هنا يستخدم القولونية MG1655 Hupa-mcherry. وتنتج هذه السلالة الوحدة الفرعية فلوريسسينتلي الموسومة α من البروتين المرتبط النيونويد HU ، مما يسمح التصور المجهري الضوء من الكروموسوم في الخلايا الحية⁹.
2. تطعيم 5 مل من المتوسطة مع مستعمره واحده وتنمو في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 140 دوران في الدقيقة (rpm) بين عشيه وضحيها (17 ساعة). قوارير (≥ 50 mL) أو قطرها كبيره (≥ 2 سم) أنابيب الاختبار يجب ان تستخدم لضمان تهويه مرضيه من الثقافة المهتاج.
3. يقيس الصباح تالي الكثافة بصريه في 600 [نم] ([د] [_{600 نم}]) وتمييع الثقافة داخل اختبار أنبوب يحتوي متوسطه طازجه إلى OD_600nm من 0.01. ويلزم تعديل الحجم الإجمالي للثقافة تبعا لعدد النقاط الزمنيه التي يتعين تحليلها اثناء التجربة.
4. تحميل 200 μL عينه من الثقافة في ميكروبلايت (0.2 mL لكل بئر من حجم العمل مع أسفل شفافة واضحة) ووضعه في قارئ لوحه الألى (انظر جدول المواد) لمراقبه OD_600nm خلال الحضانة في 37 درجه مئوية.
5. احتضان أنبوب اختبار تطعيم في 37 درجه مئوية مع اهتزاز (140 دوره في الدقيقة) OD_600nm = 0.2 ، المقابلة للمرحلة الاسيه الكاملة في وسط غني.
   ملاحظه: من الاهميه بمكان ان تنمو الخلايا لمده لا تقل عن 4 − 5 أجيال قبل تحقيق النمو الاسي المناسب. الاولي المستخدمة في الخطوة 1.3 (OD_600nm = 0.01) يحتاج إلى تكييفها في حاله النمو في الوسط الأفقر (اي ، حيث يتم التوصل إلى المرحلة الاسيه أدناه OD 0.2) ، أو إذا كان هناك المزيد من الأجيال مطلوبه (علي سبيل المثال ، للدراسات الفسيولوجية محدده أو لعلاجات الإجهاد الموسعة).
6. في OD_600nm = 0.2 ، تاخذ عينات الثقافة التالية المقابلة ل t₀ نقطه الوقت (خلايا تنمو اضعافا مضاعفه قبل الحث الإجهاد): (1) 150 μl عينه ليتم تحميلها علي الفور في الجهاز ميكروفلويديك للتصوير المجهري الوقت الفاصل (انظر القسم 2) ؛ (2) عينه 200 μL لفحص التخفيف والطلاء (انظر القسم 3) ؛ (3) عينه من 250 μL توضع علي الجليد لتحليل التدفق الخلوي (القسم 4) ؛ (4) يتم إيداع عينه من 10 μL علي الفور علي شريحة مثبته علي المركبة لتصوير لقطه مجهريه (انظر القسم 5).
7. فضح ثقافة الخلية المتبقية في أنبوب الاختبار لعلاج الإجهاد محدده تريد التحقيق واحتضان في 37 درجه مئوية مع الاهتزاز (140 دوره في الدقيقة).
   ملاحظه: الثقافة المتنامية في القارئ لوحه الألى ل OD_600nm الرصد ينبغي أيضا ان تخضع لعلاج الإجهاد.
8. في النقاط الزمنيه ذات الصلة بعد علاج الإجهاد (t₁، t₂، t₃، الخ) ، تاخذ عينات الخلية التالية من الثقافة المجهدة: (1) عينه 200 μl لفحص التخفيف والطلاء (انظر القسم 2) ؛ (2) عينه 250 μL لوضعها علي الجليد لتحليل التدفق الخلوي (القسم 3) ؛ (4) يتم إيداع عينه من 10 μL علي الفور علي شريحة مثبته علي المركبة لتصوير لقطه مجهريه (انظر القسم 4).
   ملاحظه: كل علاج يحفز الإجهاد لديه كفاءه التي هي الجرعة وتعتمد علي الوقت. التالي ، قد يكون من الضروري اجراء الاختبارات الاوليه لتحديد الجرعة ومده العلاج لاستخدامها لتحقيق أفضل النتائج. ويمكن القيام بذلك عن طريق اجراء مراقبه OD باستخدام قارئ لوحات مؤتمت (يحتمل ان يكون مرتبطا باختبارات الطلاء) لثقافة الخلية المعالجة بمجموعه من الجرعات وأوقات التعرض. في التجربة المعروضة هنا ، تم التعامل مع ثقافة الخلية مع الخلايا الحيوية تثبيط الانقسام الخلوي سيفالكسين (Ceph.) في 5 ميكروغرام/مل التركيز النهائي لمده 60 دقيقه. ثم جرفت سيفاليكسين بعيدا عن طريق التكوير الخلايا في أنبوب 15 مل باستخدام طرد (475 ز ، 5 دقيقه) ، وأزاله supernatant ، وأعاده تعليق بيليه الخلية في حجم متساو من المتوسطة الطازجة بواسطة الأنابيب لطيف ، ونقل إلى أنبوب نظيف. تم احتضان الخلايا المغسولة عند 37 درجه مئوية مع الاهتزاز (140 دوره في الدقيقة) للسماح بالانتعاش. وقد اتخذت العينة في t₆₀ (60 دقيقه بعد سيفاليكسين بالاضافه المقابلة ل ' سيفاليكسين-60min-معالجه ' عينه) ، t₁₂₀ (60 دقيقه بعد الغسيل) ، و t₁₈₀ (120 دقيقه بعد الغسيل).

2. الطلاء المقايسة

ملاحظه: فحص الطلاء يسمح لقياس تركيز الخلايا قادره علي توليد CFU في عينات الثقافة. ويكشف هذا الاجراء عن المعدل الذي تقسم فيه خليه واحده إلى خليتين قابلتين للحياة وتسمح بالكشف عن الاعتقالات في قسم الخلايا (علي سبيل المثال ، زيادة وقت توليد البكتيريا لتحلل الخلوية).

1. اعداد المخففات التسلسلية 10 اضعاف تصل إلى 10^-7 من 200 μl من عينه الثقافة في المتوسطة الطازجة. لوحه 100 μL من التخفيف المناسب علي لوحات LB غير انتقائية من أجل الحصول علي ما بين 3 − 300 مستعمرات بعد الحضانة بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
   ملاحظه: يجب تنفيذ التخفيف التسلسلي في الوسط الطازج بسرعة للحد من الانقسامات البكتيرية. وبدلا من ذلك ، قد ينظر الباحثون في استخدام محلول ملحي بدون مصدر للكربون لمنع انقسامات الخلايا اثناء عمليه التخفيف.
2. في اليوم التالي ، عد عدد المستعمرات لتحديد تركيز الخلايا القابلة للحياة (CFU/مل) في كل عينه الثقافة. ارسم وحده كفو/mL كداله للوقت لثقافات الخلايا غير المعالجة والمعالجة.

3. تدفق الخلوي

ملاحظه: يصف القسم التالي اعداد عينات الخلية لتحليل التدفق الخلوي. وتكشف تقنيه التحليل هذه عن توزيع حجم الخلية ومحتوي الحمض النووي لعدد كبير من الخلايا. عندما يكون ذلك ممكنا ، فمن المستحسن لمعالجه عينات تدفق الخلوي علي الفور. بدلا من ذلك ، يمكن الاحتفاظ بالعينات علي الجليد (لمده تصل إلى 6 ساعات) وتحليلها في وقت واحد في نهاية اليوم ، مره واحده وقد أجريت الطلاء والتصوير المجهري.

1. تمييع 250 μL من عينه الثقافة للحصول علي 250 μL في تركيز ~ 15,000 الخلايا/μL (المقابلة ل OD_600nm ~ 0.06) في المتوسطة الطازجة في 4 ° c.
   ملاحظه: الحضانة علي الجليد سوف تحد من النمو والتحوير المورفولوجية للخلايا. بدلا من ذلك ، قد يفكر المستخدم في تنفيذ تثبيت الخلايا في 75 ٪ الايثانول ، كما هو موصي به عاده للتدفق الخلوي¹⁰.
2. لتلطيخ الحمض النووي ، امزج العينة البكتيرية مع محلول 10 ميكروغرام/مل من صبغ الفلورسنت DNA (نسبه 1:1) وحضن في الظلام لمده 15 دقيقه قبل تحليل العينة.
3. تمرير العينة في تدفق الخلوي مع ~ 120,000 خلايا/دقيقه معدل التدفق. الحصول علي الامامي-متناثرة (FSC) والجانب المتناثرة (SSC) الخفيفة وكذلك الحمض النووي الفلورسنت الفلورية اشاره فلوري (FL-1) مع الإعدادات المناسبة.
4. ارسم الرسوم البيانية لكثافة خلايا FSC و FL-1 لتمثيل توزيع حجم الخلية ومحتوي الحمض النووي في عدد الخلايا.

4. لقطه التصوير المجهري

ملاحظه: يصف الجزء التالي اعداد الشرائح المجهرية واكتساب الصور لتحليل لقطه السكان. سيوفر هذا الاجراء معلومات تتعلق بشكل الخلايا (طول الخلية ، العرض ، الصورة) والتنظيم الداخلي للحمض النووي النيونويد.

1. سخن غرفه المجهر حراريا في 37 درجه مئوية لتحقيق الاستقرار في درجه الحرارة قبل البدء في الملاحظات. هذه الغرفة يسمح لتعديل درجه الحرارة من البصريات المجهر ومرحله العينة خلال التجارب الفاصلة الزمنيه.
2. اعداد الشرائح التي شنت اجبرزت كما هو موضح في Lesterlin و Dubarry⁷.
   1. أزاله الفيلم من البلاستيك من الجزء السفلي من الإطار الأزرق (انظر جدول المواد) ، وترك الفيلم البلاستيكية المجوفة علي الجانب الآخر. عصا الإطار الأزرق علي الشريحة الزجاج المجهر.
   2. ماصه ~ 150 μL من ذاب 1% اجنشا محلول متوسط وتصب داخل مقصوره الإطار الأزرق. تغطيه سريعة مع كوفيرسليب نظيفه لأزاله السائل الزائد والانتظار لمده دقيقه قليله للوحه اجبرزت ليصلب في درجه حرارة الغرفة.
   3. عندما تكون عينه الخلية جاهزه ، قم بازاله الشريط المطاطي والفيلم البلاستيكي من الإطار الأزرق. صب 10 μL من عينه الخلية علي وساده اجبرز وأماله الشريحة الزجاجية بلطف لنشر قطره. عندما تم تكثيف كل السائل ، والعصا كوفيرسليب نظيفه علي الإطار الأزرق لختم العينة. الشريحة المجهرية جاهزه الآن لمجهر.
3. وضع الشريحة علي مرحله المجهر وأداء اكتساب الصورة باستخدام الضوء المرسل (مع الهدف النقيض من المرحلة) ومع الاثاره مصدر الضوء في الأطوال الموجية المناسبة (560 nm ل mCherry).
4. حدد حقول العرض التي تحتوي علي خلايا معزولة من أجل تسهيل الكشف التلقائي عن الخلايا اثناء تحليل الصور. تاكد من ان ما لا يقل عن 300 خلايا يتم الحد منها للسماح بتحليل إحصائي قوي لعدد الخلايا.

5. ميكروفلويديكس التصوير المجهري الفاصل الزمني

ملاحظه: يشرح الجزء التالي اعداد لوحات ميكروفلويدريك (انظر جدول المواد) ، تحميل الخلايا ، برنامج ميكروفلويديكس ، والحصول علي صوره الفاصل الزمني. هذا الاجراء التصوير يكشف عن سلوك الخلايا الفردية في الوقت الحقيقي.

1. أزاله حل الحفظ من لوحه ميكروفلويدريك واستبدالها مع المتوسطة الطازجة مسخن إلى 37 درجه مئوية ، كما هو موضح في دليل المستخدم البرمجيات ميكروفلويديك.
2. ختم لوحه ميكروفلويديك إلى نظام متعددة وانقر علي زر فتيله .
3. وضع لوحه ميكروفلويديك مع نظام مشعب علي مرحله المجهر وسخن في 37 درجه مئوية ل ~ 2 ح قبل البدء في اكتساب المجهر.
   ملاحظه: هذه الخطوة ما قبل التسخين أمر بالغ الاهميه لتجنب تمدد الغرفة ميكروفلويديك ، والتي من شانها ان تغير تركيز المجهر خلال التجربة الفاصلة الزمنيه والمساومة اكتساب الصورة.
4. اغلق الصفيحة الصغيرة استبدلت الوسط من بئر 8 مع 150 μL من ثقافة عينه واستبدلت الوسط من بئر 1 إلى 5 بالمتوسطة مرغوبة مع أو دون ال [كرب-فل] كاشفه.
5. ختم لوحه ميكروفلويديك ووضعه علي مرحله المجهر.
6. علي البرمجيات ميكروفلويديك (انظر جدول المواد) تشغيل اجراء تحميل الخلية. تحقق من ان تحميل الخلايا مرضيه من خلال النظر تحت المجهر في الضوء المنقول. قم بتشغيل اجراء تحميل الخلية مره ثانيه إذا كانت كثافة الخلية في الغرفة غير كافيه.
7. قم بالتركيز بعناية في وضع الضوء المرسل وحدد العديد من مجالات الرؤية التي تظهر البكتيريا المعزولة. من المهم لتحديد الحقول التي ليست مكتظة لتكون قادره علي مراقبه نمو الخلايا المعزولة مع مرور الوقت (~ 10 − 20 خلايا لكل 100 μm² ينصح). وهذا سيسهل أيضا الكشف عن الخلايا اثناء تحليل الصور.
8. علي البرنامج ميكروفلويديك ، انقر فوق الزر إنشاء بروتوكول. برنامج حقن المتوسطة النمو ل 1 − 2 الجيل مكافئات الوقت للسماح للخلايا للتكيف (اختياري). ثم برنامج حقن المتوسطة التي تحفز الإجهاد خلال 10 دقيقه في 2 psi ، تليها الحقن في 1 psi لمده المطلوبين من العلاج الإجهاد. إذا كنت تنوي تحليل الانتعاش من الخلايا بعد الإجهاد ، وبرنامج حقن متوسط النمو الطازج لمده المطلوبين.
   ملاحظه: في التجربة المقدمة هنا ، تم حقن سيفالكسين لمده 10 دقيقه في 2 psi ، تليها 50 دقيقه في 1 psi. ثم, تم حقن متوسط النمو الطازج في 2 psi لمده 10 دقيقه, تليها 3 ح في 1 psi.
9. اجراء التصوير المجهري في وضع الفاصل الزمني مع 1 الإطار كل 10 دقيقه باستخدام التباين المرحلة في ضوء المرسلة ومصدر ضوء الاثاره 560 nm للاشاره mCherry إذا لزم الأمر.
   ملاحظه: من المهم البدء في اكتساب الصور المجهرية في نفس الوقت بدءا من بروتوكول حقن ميكروفلويدريك.

6-تحليل الصور

ملاحظه: يصف هذا القسم بإيجاز الخطوات الرئيسية لمعالجه وتحليل اللقطات والصور المجهرية الفاصلة الزمنيه. يتم فتح وتصور الصور المجهرية مع المصدر المفتوح ImageJ/فيجي (https://fiji.sc/)¹¹. يتم اجراء تحليل الصورة الكمية باستخدام المصدر المفتوح ImageJ/فيجي البرمجيات مع البرنامج المساعد MicrobeJ الحرة¹² (https://microbej.com). يستخدم هذا البروتوكول إصدار MicrobeJ 5-13 I.

1. فتح البرمجيات فيجي والبرنامج المساعد MicrobeJ.
2. لتحليل لقطه ، إسقاط جميع الصور المقابلة لشريحة المجهر واحد (عينه واحده) في شريط التحميل MicrobeJ لسلسله الصور وحفظ ملف مكدسات الصور التي تم الحصول عليها. لبيانات الفاصل الزمني ، مجرد إسقاط كومه الصورة في شريط التحميل من MicrobeJ.
3. تشغيل الكشف الألى للخطوط العريضة للخلايا استنادا إلى تقسيم صوره التباين المرحلة ، وإذا كان ذلك مناسبا ، من النونويدات استنادا إلى تجزئه اشاره فلوري الحمض النووي الملون. تحقق من دقه الكشف عن الخلية بصريا واستخدام أداه التحرير MicrobeJ للتصحيح إذا لزم الأمر. حفظ ملف النتيجة الذي تم الحصول عليه.
   ملاحظه: يتم الاشاره إلى الإعدادات المستخدمة للكشف عن الخلايا e. كولاي في جدول المواد (انظر التعليقات/الوصف عمود microbej). للأنواع البكتيرية الأخرى (وخاصه بالنسبة للبكتيريا غير قضيب الشكل) ، يجب علي المستخدم صقل الإعدادات قبل الكشف (انظر البرنامج التعليمي MicrobeJ). للصور الفاصلة الزمنيه ، قد يفضل تشغيل الكشف شبه الألى للخلايا باستخدام أداه التحرير MicrobeJ للسماح بالتركيز علي مصير الخلايا الفردية (انظر البرنامج التعليمي MicrobeJ).
4. انقر فوق الرمز لإكمال التحليل والحصول علي الإطار ريسريتي . يمكن إنشاء العديد من أنواع مختلفه من الرسوم البيانية الإخراج من تلك النقطة. ارسم الرسوم البيانية المعدلة لشكل/طول الخلية ويعني رقم النونويد لكل خليه.

النتائج

تم استخدام الاجراء الموصوف لتحليل سلوك الخلايا الK12ه القولونية اثناء التعرض العابر للسيفاليكسين ، وهو مضاد حيوي يمنع تقسيم الخلايا علي وجه التحديد (الشكل 1ا)¹³. وقد استخدمت سلاله hupa-mcherry e. القولونية التي تنتج فلوريسسينتلي المسمي البروتين هو جين تاو المرتبطة بالحمض النووي الصبغي للتحقيق في ديناميات الكروموسوم في جميع انحاء هذا العلاج^8,9. وقد تم تحليل الخلايا القولونية Hupa-mCherry المتزايدة باطراد من قبل (t₀) و 60 دقيقه بعد الاحتضان مع سيفالكسين (t₆₀). ثم ، تم غسل المضادات الحيوية بعيدا وتم تحليل الانتعاش من سكان الخلية بعد 1 h (t₁₂₀) و 2 h (t₁₈₀) (الشكل 1ب).

الشكل 1: إجراءات تحليل الاستجابة البكتيرية لعلاجات الإجهاد. (ا) تخطيطي للأسلوب. (ب) رسوم متحركة توضح شكل الخلية اثناء النمو الطبيعي في الوسط الغني واثناء التعرض العابر إلى سيفاليكسين (ceph.) ، من الاضافه في (t₀) وبعد الغسيل سيفالكسين من (t₆₀) إلى (t₁₈₀). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

التطور الموازي لل OD و كفو/mL هو المؤشر الأول الذي يساعد علي فهم تاثير العلاجات الإجهاد. هذه المعلمات اثنين ترتبط ارتباطا وثيقا خلال النمو غير المضطرب ولكن غالبا ما تكون غير مقترنة وتتطور بشكل مستقل تحت الإجهاد. الثقافات الخلية المتنامية في وجود سيفالكسين عرضت الزيادات OD_600nm مماثله كما الثقافات غير المجهدة (الشكل 2ا), تبين ان المخدرات لا تؤثر علي توليف الخلية الشامل. غير ان تركيز الخلايا القابلة للاستمرار لم يرتفع عندما كان سيفاليكسين موجودا بسبب التثبيط الصارم لانقسام الخلايا (الشكل 2ب). بدات الخلايا تقسيم مره أخرى عندما تم أزاله سيفالكسين ووصلت في نهاية المطاف إلى تركيز ما يعادل الثقافة غير المجهدة في (t₁₈₀). وتعكس هذه النتائج تاثير الجراثيم من سيفالكسين, الذي يحفز تثبيط عكسها تماما من انقسام الخلايا. ستؤدي الضغوط المختلفة إلى إلغاء اقتران مختلف لمنحنيات OD و CFU/mL ، اعتمادا علي التاثير المستحث (علي سبيل المثال ، تعديل شكل الخلية مثل التغذية أو الانتفاخ ، وموت الخلايا مع أو بدون تحلل). وترد في الشكل 2(ج) قائمه غير حصريه بالنتائج المحتملة للنتائج التي تدل علي مختلف الآثار الناجمة عن الإجهاد.

الشكل 2: رصد نمو البكتيريا للخلايا المعالجة والسيفالكسين المعالجة علي مستوي السكان. (ا) رصد الكثافة البصرية (OD_600nm/مل). (ب) تركيز الخلية القابلة للاستمرار (CFU/mL) داخل الثقافات المعالجة و سيفالكسين-60min. تشير أشرطه الخطا إلى الانحراف المعياري لثلاث نسخ تجريبية. (ج) خطط للنتائج المحتملة وما يرتبط بها من اثار الإجهاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

ويعد تحليل الخلايا الاحاديه ضروريا لتفسير استجابه الإجهاد التي لوحظت علي مستوي السكان بدقه. يسمح قياس التدفق الخلوي بفحص حجم الخلية ومحتوي الحمض النووي لعده آلاف من الخلايا^14،15 (الشكل 3). اثار التعرض للسيفالكسين الزيادة الموازية في حجم الخلية ومحتوي الحمض النووي (t₆₀). عندما تمت أزاله سيفالكسين, حجم الخلية السكانية ومحتوي الحمض النووي انخفضت تدريجيا لتصبح مماثله للسكان غير المجهدة في t₁₈₀. وتبين هذه النتائج ان سيفالكسين لم تمنع تكرار الحمض النووي وأثارت تشكيل الخلايا الخيطية التي تحتوي علي العديد من معادلات الكروموسومات. هذه الخيوط تنقسم إلى خلايا مع حجم الخلية العادية ومحتوي الحمض النووي عندما تم غسلها المخدرات بعيدا. ستكون نتائج قياس التدفق الخلوي مختلفه جدا بالنسبة للضغوط التي تمنع تخليق الحمض النووي ، والتي تؤدي إلى تشكيل الخلايا الخيطية التي تحتوي علي كروموسوم واحد غير متماثل فقط. في هذه الحالة ، سيزيد حجم الخلية بشكل مماثل ولكن لن يقترن بزيادة في محتوي الحمض النووي.

الشكل 3: تحليل التدفق الخلوي التمثيلي للخلايا غير المعالجة والخلايا المعالجة من سيفالكسين 60 دقيقه. (ا) توزيع حجم الخلية الرسوم البيانية (FSC-H). (ب) الرسوم البيانية لمحتوي الحمض النووي (FL1-SYTO9). ن = 120,000 الخلايا التي تم تحليلها. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

واستخدمت التصوير المجهري لفحص الشكل الخلوي والتنظيم داخل الخلايا من الحمض النووي الذي يظهره التوطين هو جين تاو-mCherry (الشكل 4ا). اثار سيفاليكسين تشكيل خلايا طويلة مع عرض الخلية العادية وعدم وجود حاجز القسمة. هذه الخيوط الناعمة التي تحتوي علي هياكل الحمض النووي متباعدة بانتظام تسمي النيونويدات ، مؤكدا ان سيفالكسين لا يؤثر علي النسخ المتماثل الكروموسوم والعزل. وقد أكد تحليل الصور الكمي إلى حد كبير حجم الخلية وزيادة محتوي الحمض النووي التي لوحظت سابقا مع قياس التدفق الخلوي (الشكل 4ب ، ج). ستكون النتائج مختلفه جدا بالنسبة للضغوط التي تحفز الحمض النووي-الضرر ، والتي تؤدي إلى تشكيل الخلايا الخيطية التي يستمر فيها التكرار ولكن العزل يضعف. في هذه الحالة ، سيزيد حجم الخلية ومحتوي الحمض النووي بشكل مماثل ، ولكن الخلايا ستؤوي كتله واحده غير مهيكله من الحمض النووي. صور لقطه يمكن أيضا ان تكشف عن نوع آخر من اشكال الخلايا الشاذة أو وجود الخلايا الصغيرة ، انوكلينات ، أو تفكيك (خلايا الأشباح).

الشكل 4: تحليل اللقطة المجهرية للخلايا المعالجة والتي لا تعالج والتي تتم معالجتها بنسبه 60 دقيقه. (ا) الصور المجهرية التمثيلية التي تظهر تباين المرحلة (الرمادي) واشاره هو-mcherry (الأحمر). (ب) الرسوم البيانية لتوزيع طول الخلية. شريط مقياس = 5 μm. (ج) الرسوم البيانية لعدد النيونويد لكل خليه. بين 800 و 2,000 تم تحليل الخلايا لكل عينه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

وقد ساعد المجهر الفاصل الزمني المرتبط بالجهاز الصغير¹⁶ علي تحديد الأنماط الظاهرية التي لوحظت سابقا ويوفر رؤى اضافيه بشان تطور وسببيه نقص النمو. وأكدت الصور الفاصلة الزمنيه (الشكل 5ا والفيلم 1) ان استطاله الخلية (توليف كتله الخلية) ، والنسخ المتماثل الكروموسوم والعزل لم تثبط بالتعرض للسيفاليكسين. الاضافه إلى ذلك ، كشفت عمليه الانتعاش عند أزاله سيفالكسين. واظهر تحليل سلاله الخلايا الخيطية ان تقسيم الخلية أعاده تشغيل ~ 20 دقيقه بعد غسل بعيدا المخدرات (الشكل 5ب). وكانت الخلايا المقسمة الناتجة قابله للحياة ، لأنها تنقسم بدورها ، مما يؤدي في النهاية إلى تشكيل خلايا 33 التي تظهر الحجم الطبيعي ومحتوي الحمض النووي. هذا يسمح حساب الوقت الجيل الكلي من ~ 31 دقيقه علي 180 دقيقه من التجربة ، والذي يشبه الجيل الوقت محسوبة للسكان غير المجهدة من القياسات كفو/مل (~ 33 دقيقه).

الشكل 5: تحليل الفترة الزمنيه المجهرية للخلايا المعالجة سيفاليكسين-60min. (ا) الصور المجهرية التمثيلية التي تظهر تباين المرحلة (الرمادي) واشاره هو-mcherry (الأحمر). يشار إلى الخلية الخيطية المراقبة بواسطة الخطوط العريضة البيضاء ، وتقسم الخلايا بألوان مختلفه. شريط مقياس = 5 μm. (ب) التمثيل التخطيطي لسلاله الخلية الخيطية المقابلة للفريق (ا) وللفيلم 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1: Microfluidic فيلم من e. القولونية هو-mcherry تعامل مع سيفالكسين. تم حقن سيفاليكسين بعد 60 دقيقه ، تليها حقن المتوسطة RDM الطازجة لمده 3 ساعات. الوقت المشار اليه باللون الأصفر (1 اطار كل 10 دقائق). شريط مقياس = 5 μm. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

Discussion

من الضروري ان تولي اهتماما لحاله نمو الخلايا اثناء العملية. تنمو الخلايا علي مدي عده أجيال قبل الوصول إلى مرحله الاسي الكامل. لنجاح هذه الطريقة ، من المهم ان يتم جمع جميع عينات الخلايا في وقت واحد ، وانه من الأفضل لتحليل واحد فقط المعالجة والثقافة غير المعالجة واحده في نفس الوقت. يجب الحفاظ علي عينات الخلايا للتصوير المجهري عند درجه الحرارة التجريبية طوال العملية. ومن ثم من الضروري لتسخين غرفه المجهر وغرفه ميكروفلويدريك قبل بداية التجربة. إذا كانت عينات الخلية لقياس التدفق الخلوي لا يمكن تحليلها بسهوله ، فانها يمكن ان تبقي علي الجليد لمده تصل إلى 6 ساعات. الحضانة علي الجليد سوف تحد من النمو والتحوير المورفولوجية للخلايا. بدلا من ذلك ، قد يفكر المستخدم في استخدام تثبيت الخلايا في الايثانول 75 ٪ ، والذي ينصح عاده لتدفق الخلوي¹⁰. إذا كان البروتوكول يتطلب غسل محرض الإجهاد من المتوسطة ، والطرد المركزي وخلايا ماصه بعناية فائقه لتجنب اتلاف الخلايا الشاذة المحتملة.

كل من قياس التدفق الخلوي وتحليل لقطه تعطي الوصول إلى حجم الخلية والمعلمات محتوي الحمض النووي ، مع لقطات توفير مراقبه اضافيه لمورفولوجية الخلية. تلطيخ الحمض النووي مع DAPI¹⁰ (4 ' ، 6-diamidino-2-فينيلانديول) أو غيرها من الاصباغ الحمض النووي مستقره يمكن ان يؤديها إذا لم يكن الانصهار الفلورية المتاحة لمراقبه النونويدات في الكائن الحي من الفائدة. إذا كان لا يمكن اجراء تحليل التدفق الخلوي ، فمن المهم ان الصورة وتحليل عدد كبير من الخلايا عن طريق المجهر.

يمكن أيضا اجراء التصوير المجهري باستخدام سلالات تحمل اندماج فلورية للبروتينات المشاركة في مسارات معينه للفائدة. وهذا من شانه ان يساعد علي الكشف عن تاثير الإجهاد علي مجموعه متنوعة من العمليات الخلوية مثل النسخ المتماثل ، والنسخ ، وتركيب جدار الخلية ، أو تقسيم الخلية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة علي مجموعه من الأنواع البكتيرية ، والشرط الوحيد هو ان جهاز ميكروفلويدريك يجب ان تكون متوافقة مع مورفولوجية الخلايا. لوحات ميكروفلويديك القياسية هي مريحه لبكتيريا شكل قضيب مع عرض الخلية بين 0.7 μm و 4.5 μm. ومع ذلك ، cocci ، المكورات العقديه ، أو سلالات بكتيرية أخرى مع الاشكال الغريبة تحتاج إلى اختبار. بدلا من ذلك ، إذا كان لا يمكن اجراء التجارب ميكروفلوريك بسبب عدم توفر المعدات أو سلالات بكتيرية غير متوافقة ، يمكن اجراء التصوير بالفاصل الزمني علي الشرائح المثبتة علي المركبات لمده أقصاها 2 ساعة.

والميزة الشاملة لهذا التحليل متعدد النطاقات هي توفير رؤية عالميه لتاثير الضغط التعريفي علي عده جوانب من قدره النمو البكتيري (اي التوليف الشامل ، وسلامه الخلايا ، وتشكل الخلايا ، وسلامه الغشاء ، ومحتوي الحمض النووي) وطريقه هذه تتطور مع الوقت في السكان البكتيرية المتزايدة تحت ظروف الإجهاد. كما انه يسمح بتحليل استعاده النمو الطبيعي علي مستوي الخلية الواحدة ومستوي السكان. وينطبق هذا النهج علي مجموعه واسعه من الأنواع البكتيرية وعلي اي نوع من العلاج المجهد تقريبا ، مثل التعرض للمضادات الحيوية أو غيرها من المركبات المضادة للميكروبات ، وتحليل تاثير التفاعل مع الكائنات الأخرى في الأنواع المتعددة السكان ، أو تاثير الطفرة الجينية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	BioRad	1613100	Certified molecular biology agarose
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	ThermoFisher scientific	A24858	Cytometer
CellASIC ONIX Microfluidic System	Merck Millipore	CAX2-S0000	Microfluidic system
CellASIC ONIX2 FG	Merck Millipore	ONIX2 1.0.1	Microfluidic software
CellASIC ONIX2 Manifold Basic	Merck Millipore	CAX2-MBC20	Manifold system
CytoOne 96-well plate with lid	Starlab	CC7672-7596	Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion			Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc/	Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication
Gene Frame	Thermo Scientific	AB-0578	Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm)
Luria-Broth agarose medium	MP Biomedicals	3002232	Growth medium for plating assay
MicrobeJ	Imagej/Fiji plugin	https://www.microbej.com/	Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters
Microfluidic Plates CellASIC ONIX	Merck Millipore	B04A-03-5PK	Plate for Microfluidic system
Microscope Nikon eclipse Ti	Nikon		Fluorescence microscope
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)	Teknova	M2105	Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S34854	DNA fluorescent dye
TECAN Infinite M1000	TECAN	30034301	Automated plate reader