JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول عمليه تجريبية لإنتاج الجسيمات الفيروسية المعدية عاليه التهاب (pp) مع البروتينات السكرية المغلفة من اثنين من سلالات الإنفلونزا A وكيفيه تحديد عدويها. هذا البروتوكول هو قابل للتكيف للغاية لتطوير pps من اي نوع آخر من الفيروسات يلفها مع البروتينات السكرية مغلف مختلفه.

Abstract

ومن المسائل الخطيرة المتعلقة بالصحة العامة الانتقال المباشر العرضي لإنفلونزا الطيور A المسببة للامراض الشديدة من فيروس H5N1 (HPAI H5N1) و H7N9 إلى البشر والفتك بها ، وتشير إلى احتمال حدوث وباء. ومع ذلك ، فان فهمنا الجزيئي للفيروس بدائي ، ومن الضروري دراسة الخواص البيولوجية للبروتينات المغلفة كاهداف علاجيه ووضع استراتيجيات للسيطرة علي العدوى. طورنا منصة الجسيمات الفيروسية الصلبة (pp) لدراسة فيروس إنفلونزا الطيور ، بما في ذلك التحليل الوظيفي للبروتينات السكرية المغلفة هيماغلوتينين (HA) والعصبية (NA) ، وخصائص أعاده التشكيل لل والناس ، مستقبلات, الانقسامات, تحييد الأجسام المضادة, التشخيص, عدوي, لأغراض تطوير المخدرات وتصميم اللقاح. هنا ، ونحن وصف اجراء تجريبي لإنشاء pps مع البروتينات السكرية المغلف (HA ، NA) من اثنين من سلالات الإنفلونزا A (HAPI H5N1 و 2013 الطيور H7N9). ويستند جيلهم علي قدره بعض الفيروسات ، مثل فيروس سرطان الدم murine (MLV) ، لدمج البروتينات السكرية المغلف في pp. الاضافه إلى ذلك ، ونحن أيضا بالتفصيل كيف يتم قياس هذه pps مع RT-qPCR ، والكشف عن عدوي الفيروس الأصلي وغير متطابقة pps اعتمادا علي أصل وقد و NAs. هذا النظام هو مرنه للغاية وقابله للتكيف ويمكن استخدامها لإنشاء pps الفيروسية مع البروتينات السكرية المغلف التي يمكن ادراجها في اي نوع آخر من الفيروسات يلفها. وهكذا ، يمكن استخدام هذه المنصة الجسيمات الفيروسية لدراسة الفيروسات البرية في العديد من التحقيقات البحثية.

Introduction

وتتمثل مهمة الجسيمات الفيروسية في نقل المجين البشري من خليه مضيفه مصابه إلى خليه مضيفه غير مصابه وتسليمه إلى الخلايا الخلوية أو النواة في شكل النسخ المتماثل المختص1. يتم تشغيل هذه العملية في البداية عن طريق ربط مستقبلات الخلايا المضيفة ، تليها الانصهار من الاغشيه الخلوية والخلايا. للفيروسات المغلفة ، مثل فيروسات الإنفلونزا ، البروتينات السكرية الحاده هي المسؤولة عن مستقبلات ملزمه والانصهار1،2. الفيروسية المغلف البروتينات السكرية (علي سبيل المثال ، الحمم البركانية ، المستضدات) ، وتشارك في العديد من الخصائص والاحداث الهامه ، مثل بدء دوره حياه الفيروسات (ملزمه والانصهار) ، والمرض الفيروسي ، والاستمناع ،والخلية المضيفة المبرمج والتروسيه الخلوية ، ومسار البحوث علي البروتينات السكرية المغلف الفيروسية سوف تساعدنا علي فهم العديد من جوانب عمليه العدوى الفيروسية. الجسيمات الفيروسية الكاذبة (pp) ، وتسمي أيضا سودوفيريونز أو الكاذبة ، يمكن ان تتولد من خلال تقنيه التنميط الكاذب8،9،10. وقد استخدمت هذه التكنولوجيا لتطوير الجزيئات الكاذبة من العديد من الفيروسات, بما في ذلك التهاب الكبد C11,12, التهاب الكبد ب13, فيروس التهاب الفم الحويصلي (vsv)14,15, وفيروس الإنفلونزا16,17,18,19. وتستند هذه التكنولوجيا علي البروتين هفوة بول من لينتيفيروسيس أو غيرها من الفيروسات الرجعية.

يمكن الحصول علي الجزيئات الفيروسية الكاذبة باستخدام نظام البلازما الثلاثة عن طريق التحويل الفيروسي لغلاف البروتين السكري البلازميد ، والعبوات المضادة للفيروسات الارتجاعية في عداد المفقودين الجينات المغلف البيئية ، ومراسل منفصل البلازميد في الخلايا المنتجة pp. يتم تجميع الفيروس الرجعي من قبل بروتين الكمامة ، وانها براعم من غشاء الخلية المصابة التي تعبر عن بروتين مغلف الفيروس1. ولذلك ، فمن الممكن الحصول علي الإنفلونزا العالية عيار pps باستخدام الفيروس الرجعي الكمامة البروتين لإنتاج براعم علي الغشاء الخلوي التعبير عن الإنفلونزا HA و NA. في دراساتنا السابقة ، وقد/NAs في جميع تركيبات وظيفية وقادره علي أداء وظائفها المقابلة في دوره الحياة الفيروسية16،17،18،20،21. وتستخدم هذه الورقة للتحقيق في الخصائص البيولوجية الإنفلونزا, بما في ذلك التراص, النشاط نيوامينيداز, [ها-مستقبلات ملزمه التروسم, و عدوي. لان HA و NA علي حد سواء البروتينات الوظيفية السطحية الهامه في دوره الحياة الفيروسية ، وقد غير متطابقة و NAs المستمدة من سلالات مختلفه من الإنفلونزا يمكن ان تظهر جزئيا أعاده تشكيل بينهما. هنا ، ونحن توليد ثمانيه أنواع من الإنفلونزا pps من خلال الجمع بين اثنين واثنين من الناس (المستمدة من سلاله اتش بي جي 5 ووصمه العار H7N9) ، وذلك باستخدام نظام التنميط الكاذب ثلاثه plasmid. وتشمل هذه الأنواع الثمانية من pps اثنين الأصلي pps, H5N1pp, H7N9pp; اثنين غير متطابقة pps ، (H5 + N9) pp ، (H7 + N1) pp ؛ وأربعه pps فقط إيواء بروتين سكري واحد (HA أو NA) ، H5pp ، N1pp ، H7pp ، N9pp. والدراسات المتعلقة بفيروس الإنفلونزا ، مثل H5N1 و H7N9 ، محدوده بمتطلبات السلامة الاحيائيه. وينبغي اجراء جميع الدراسات المتعلقة بسلالات فيروس الإنفلونزا البرية في مختبر من مستوي السلامة البيولوجية 3 (BSL-3). ويمكن استخدام تكنولوجيا الجسيمات الفيروسية الزائفة لحزم الفيريون الاصطناعية في الاعداد 2 (BSL-2) مستوي السلامة الاحيائيه. ولذلك ، يمثل pps أداه أكثر أمانا وفائدة لدراسة عمليات فيروس الإنفلونزا اعتمادا علي اثنين من البروتينات السكرية الرئيسية: هيماغلوتينين (HA) و نيوامينيداز (NA).

يصف هذا البروتوكول الجيل من هذه pps مع استراتيجية ثلاثه plasmid المختلط (عرضت في الشكل 1) ، وكيفيه قياس pps ، والكشف عن عدوي. وينطوي إنتاج البولي بروبيلين علي ثلاثه أنواع من البلازميدات (الشكل 1). وقد استنسخت الجينات هفوة-pol ، والتي ترميز الفيروس الرجعية هفوة-بول البروتين ، من مجموعه التعبئة والتغليف الرجعية وادراجها في pcdna 3.1 بلازميد واسمه Pcdna-هفوة-pol. تم استنساخ الجين المعزز للبروتين الفلوري الأخضر (eGFP) ، الذي يشفر البروتين الفلوري الأخضر ، من ناقلات pTRE-EGFP ، والذي تم ادراجه في pcDNA 3.1 plasmid ، ودعا pcDNA-GFP. اثناء الاستنساخ ، تم أضافه تسلسل اشاره التعبئة والتغليف (ψ) عن طريق التمهيدي. تم استنساخ الجينات HA و NA في plasmid pVRC ، المسمي pVRC-HA و pVRC-NA ، علي التوالي. البلازما الاخيره بترميز البروتين الانصهار ويمكن استبدالها مع اي بروتين الانصهار الأخرى من الفائدة. لدينا منصة التنميط الكاذب ويشمل اثنين من التعبير البلازميدات بروتين سكري: pVRC-HA و pVRC-NA. وهذا يمكن تبسيط البحث علي أعاده تشكيل بين سلالات الفيروسات المختلفة في اعداد BSL-2.

Protocol

1. اليوم الأول: ثقافة الخلية والبذر

  1. زراعه الكلي الجنينية البشرية (يشيك) 293T/17 الخلايا في اطباق 60 مم مع المتوسطة الاساسيه المعدلة دولبيكو (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية (الدم) و 100 U/mL البنسلين-ستربتوميسين (DMEMالمتوسطة كامله ، DCM) في 37 درجه مئوية ، و 80 5
    ملاحظه: يتم المستحسن 293T/17 خلايا المرور منخفضه.
  2. غسل بعناية الخلايا مع 5 مل من الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) 1x.
    ملاحظه: يجب ان يكون التعامل اليدوي من الخلايا 293T/17 يشيك لطيف جدا ، لأنها فصل بسهوله.
  3. أزاله تلفزيوني وانفصال الخلايا مع 1 مل من 0.25 ٪ التريبسين-الاثيلين دياميني حمض تتراكسي (أدتا) الحل. وضع الطبق في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه لمده لا تزيد عن 5 دقائق حتى يتم فصل الخلايا.
  4. تعطيل التريبسين عن طريق أضافه 5 مل من DCM. تفريق الخلايا في تعليق خليه واحده عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا عده مرات.
  5. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل المبردة مسبقا. جمع الخلايا عن طريق طرد في 250 x g ل 5 دقيقه في 4 °c.
  6. الكثير من الخارقين قدر المستطاع أعاده تعليق بيليه الخلية مع 6 مل من المتوسطة DCM وحساب الخلايا. تمييع الخلايا إلى 1 × 106 خلايا/مل مع المتوسطة DCM.
  7. بذور الخلايا في 6 لوحه جيدا مع 1 مل من تعليق الخلية في بئر. ربت الصفيحة برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي. احتضان لوحه بين عشيه وضحيها (14-16 ح) في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.

2. اليوم الثاني: أربعه-بلازميد كوترانسكشن بوساطة ليبوفيكشن

  1. تحقق من مورفولوجية الخلية وكثافتها تحت مجهر الضوء المقلوب. ومن الناحية المثالية ، ينبغي ان تكون الخلايا حوالي 85 ٪ متموج في التحويل. استبدل المتوسط ب1 مل من المصل الخالي من DMEM المتوسط لكل بئر ، ثم أعد الصفيحة إلى الحاضنة.
    ملاحظه: يجب ان يكون التعامل اليدوي من الخلايا 293T/17 يشيك لطيف جدا ، لأنها فصل بسهوله.
  2. لكل بئر من الخلايا المستزرعة ليتم نقلها ، تمييع 8 μL من الكاشف ترانسكشن إلى حجم 150 μL مع المصل المخفض المتوسطة (أنبوب 1). اخلطه برفق وحضنه لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT ، حوالي 20 درجه مئوية).
    ملاحظه: بالنسبة لكل عينه ترانسكشن ، واعداد اثنين من 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير ، مرقمه 1 و 2.
  3. في أنبوب 2 ، تمييع 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى 150 μl من المصل المخفض المتوسطة.
    ملاحظه: في أنبوب 2 ، تمييع كل الحمض النووي البلازميد كما هو مبين في الجدول 1. واستخدم فيروس التهاب الفم البطيني الترميز البلازما (vsv) G بروتين سكري (البلازميد حزب التقدمي-vsv) كعنصر تحكم إيجابي ، لان vsv قادره علي أصابه مجموعه واسعه من الخلايا. جزيئات التحكم السلبية التي تفتقر إلى الإنفلونزا مغلف البروتينات السكرية (Δenv pps) تم إنشاؤها باستخدام pcDNA-هفوة-Pol و pcDNA-GFP البلازميدات.
  4. بعد الحضانة 5 دقائق ، والجمع بين الحمض النووي المخفف مع كاشف ترانسفيكشن المخفف. اخلطي برفق وحضني لمده 15 دقيقه أخرى في RT.
  5. أضافه الحمض النووي-الدهون المعقدة إلى جيدا المقابلة التي تحتوي علي الخلايا والمصل خاليه المتوسطة. امزجيه برفق بواسطة هزاز الطبق ذهابا وإيابا.
  6. بعد الحضانة ل 4-6 ح في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه ، وأزاله المتوسطة ، واستبدال مع 2 مل من dmem. احتضان لأخر 36-48 ح في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.
    ملاحظه: استبدل بالمصل خاليه من الأجسام المضادة و DMEM الخالية من الأضداد. في هذا البروتوكول ، يمكن استخدام اثنين واثنين من NAs لتوليد ثمانيه أنواع من pps (كما هو موضح في الجدول 1).

3-اليوم الثالث: بذر الخلايا المعرضة للاصابه

  1. لعدوي الفحص ، البذور كل نوع من الخلايا الحساسة في 1 × 104 خلايا لكل بئر في لوحه 96 جيدا.
    ملاحظه: استخدام نوعين من الخلية الهدف لتنفيذ الفحص عدوي في هذه المقالة: خط الخلايا البشرية المشتقة من السنخيه (خلايا A549) وخلايا الكلي البوليسية مادين-داربي (MDCK). وتستخدم خلايا MDCK علي نطاق واسع في أبحاث الإنفلونزا ويمكن ان تكون جيده السيطرة. هذه الخطوة مرنه. ويمكن استخدام اي خطوط أخرى للخلايا المستهدفة وفقا لمتطلبات البحث.
  2. احتضان لوحه بين عشيه وضحيها (14-16 ح) في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.

4-اليوم الرابع: جمع الجسيمات الفيروسية الكاذبة ، والقياس الكمي ، وفحص عدوي

  1. جمع الجسيمات الفيروسية الكاذبة
    1. تحقق من لون الوسط. من الناحية المثالية ، يجب ان يكون وردي فاتح أو برتقالي قليلا. فحص الخلايا مع المجهر البيولوجي الفلوري المقلوب تحت 440-460 نانومتر.
    2. في 36-48 ح بوستترانسكشن ، حصاد pps عن طريق المرور من خلال 0.45 ميكرومتر متعدد الفينيليدين فلوريد (pvdf) فلتر غشاء للقضاء علي الحطام الخلية.
    3. قسم الورقة إلى المستويات الصغيرة.
    4. تخزين pps في-80 درجه مئوية.
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. ومع ذلك ، لا يتم تشجيع هذا ، لان عدوي من pps سوف تنخفض بشكل حاد بعد التجمد والذوبان.
  2. القياس الكمي للجسيمات الفيروسية الكاذبة
    1. نقل 20 μL من الإرسال والإرسال المنقي إلى 1.5 mL ريبونكليوداز (RNase)-أنبوب الطرد المركزي الصغير مجانا.
    2. أضافه 1 μL من 0.24 U/mL النواة البنداز. احتضان في 37 درجه مئوية ل 1 ح للقضاء علي اي الحمض النووي والجيش النيبالي التلوث.
      ملاحظه: الهدف RNA ، الفيروس المضخم للخلايا (CMV)-GFP الحمض الخلوي الريبي ، يتم تعبئتها في pps ويمكن تجنب المتدهورة من قبل النيوداز البنزوداز.
    3. تجميد العينة في-70 درجه مئوية للغاء تنشيط النيوداز البنبيناز.
    4. أضافه 2 μL من بروتيداز k. احتضان في 50 درجه مئوية لمده 30 دقيقه لهضم البروتينات المغلف والإفراج عن الحمض الريبي النيبالي-GFP. انتنشيط K بروتيداز في 100 درجه مئوية لمده 3 دقائق.
    5. القياس الكمي لل pps من قبل النسخ العكسي الكمية في الوقت الحقيقي (qRT)-PCR مع مسبار عالمي من خطوه واحده RT-Qrt كيت ، باستخدام التمهيدي إلى الامام 5 '-AACAAAAGCTGAGCTCGTTكتاتتا-3 ' ، والتمهيدي العكسي 5 '-GGGTCTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3 ' ، والتحقيق 5 '-فأم-CCCCCAAGAGACCCCCكمامه-تام-3 ' ، في الوقت الحقيقي PCR ثيرموسيكلير. تطبيع pps لرقم نسخه RNA قبل عدوي.
  3. فحص عدوي
    1. تمييع كل نوع من pps من حيث البيانات qRT-PCR إلى 4 × 105 نسخ/مل (pp التطبيع).
    2. أضافه توسيل-فينيلالانين كلونوايثيل كيتون (TPCK)-التربسين إلى تركيز نهائي من 40 ميكروغرام/مل في pps ان الميناء H7N9 HA. احتضان في 37 درجه مئوية ل 1 ح لتشكيل الوحدات الفرعية الوظيفية HA1 و HA2.
      ملاحظه: ليست هناك حاجه لعلاج pps ان الميناء H5 مع TPCK-تريبسين ، لان لديهم عده بقايا ارجينين ويسين في موقع الانشقاق HA1-HA2. هذا الموقع الانقسام متعددة الاساسيه يمكن المشقوق من قبل بروتينيه الخلوية في كل مكان.
    3. مزيج تطبيع pps مع DMEM المتوسطة (مصل خاليه) بنسبه 1:1 (حجم/حجم).
    4. احضر الصفيحة التي تحتوي علي خلايا حساسة إلى مجلس السلامة البيولوجية.
    5. يستنشق ماده طافي ويغسل الخلايا مره واحده مع 0.1 مل من الحرارة المسبقة.
    6. أضف 0.1 مل من خليط pps-DMEM إلى بئر واحد. ثلاثه نسخ الاختبارات العدوية لكل نوع من pps إلى خط خليه واحده حساسة (العرض الزائد في الشكل 2).
    7. احتضان لوحه بئر 96 لمده 4-6 ح في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.
    8. يستنشق ماده طافي واستبدال مع 0.1 mL من DCM.
    9. احتضان لوحه بئر 96 لأخر 24-36 ح في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.

5-اليوم الخامس أو السادس: كشف عدوي

  1. احضر لوحه ال96 الجيدة إلى مجلس السلامة البيولوجية.
  2. يستنشق ماده طافي ويغسل الخلايا 1x مع 0.2 مل من الحرارة المسبقة.
  3. أزاله تلفزيوني وانفصال الخلايا مع 0.1 mL من 0.25 ٪ التريبسين--أدتا الحل.
  4. وضع الطبق في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه لمده 3 دقائق حتى يتم فصل الخلايا.
    ملاحظه: تجنب احتضان لأكثر من 5 دقائق ، لان هذا سيؤدي إلى تكتل الخلايا.
  5. تعطيل التريبسين عن طريق أضافه 0.4 mL من DCM.
  6. تفريق الخلايا في تعليق خليه واحده عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا عده مرات.
  7. نقل تعليق الخلية إلى المبردة 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير.
  8. تحديد الخلايا الايجابيه مراسل GFP مع الفلورية الخلية المنشط الفرز (FACS).
    ملاحظه: لتحديد نسبه الخلايا الهدف الايجابيه مراسل GFP ، تعيين بوابات التدفق الخلوي باستخدام عينات التحكم (pps-غير المعالجة A549 الخلايا أو الخلايا MDCK) ، ومن ثم حساب الخلايا الايجابيه مراسل GFP من خلايا 10,000 لكل عينه.

النتائج

اعتمادا علي الاجراء العام الموصوف أعلاه ، لقد ولدت 10 أنواع من pps الجمع بين اثنين من مجموعه لديها/NAs أو VSV-G بروتين سكري أو البروتينات السكرية لا المغلف (كما هو موضح في الجدول 1). سبعه منهم معدون. و pps ان الميناء لا المغلف بروتين سكري أو الميناء فقط NA لم تظهر اي عدوي هنا. يتم الإفراط في ال?...

Discussion

في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه لإنتاج الجسيمات الكاذبة فيروس الإنفلونزا (pp) في اعداد BSL-2. وأدرجت المخبر البلازميد pcdna-gfp في pps ويمكن استخدامها لقياس pps من قبل facs في عدوي مقايسة. اخترنا نوعين من خطوط الخلايا الحساسة لأنها تستخدم علي نطاق واسع في أبحاث الإنفلونزا. ومن شان خلايا MDCK ان توفر سي?...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المقدمة من الطب والعلوم الصحية وخطه التكنولوجيا في مقاطعه تشجيانغ (أرقام المنح ، 2017KY538) ، والطب البلدي في هانغتشو ، وخطه العلوم الصحية والتكنولوجيا (أرقام المنح ، OO20190070) ، والعلوم الطبية في هانغتشو التكنولوجيا الرئيسية المشروع (أرقام المنح ، 2014Z11) والبلدية هانغتشو مشروع التطبيق المستقل للتنمية الاجتماعية والبحث العلمي (أرقام المنح ، 20191203B134).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Benzonase NucleaseMillipore70664Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)Corning3599Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)Costar3516Individual alphanumerical codes for well identification
Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM)Gibco11965092A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serumExcellFND500fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)Beckman coultercytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cellsATCCCRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cellsATCCCRL-11268A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscopeOlympusBX51-32P01-FLB3
Inverted light microscopeOlympusCKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668019Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR KitNEBE3006LWill withstand up to 14,000 RCF
RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellsATCCCCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)AxygenMCT-150-C33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDFMilliporeSLHV033RSan improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco11058021The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycinGibco15140122Maximum RCF is 12,500 xg
Temperature range from -80 °C to 120 °C
RNase-/DNase-free
Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL)Corning430791a stable and highly reactive serine protease
Proteinase KBeyotimeST532Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm)Corning430166Trypsin from bovine pancreas
TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsinSigmaT1426This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056

References

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology (6th). , (2013).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
  3. Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
  4. Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
  5. Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
  6. Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
  7. Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
  8. Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
  9. Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
  10. Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
  11. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
  12. Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
  13. Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
  14. Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
  15. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  16. Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
  17. Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
  18. Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
  19. Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
  20. Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
  21. Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
  22. McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
  23. Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
  24. Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
  25. Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
  26. Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
  27. Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
  28. Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
  29. Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
  30. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
  31. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
  32. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  33. Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
  34. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
  35. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  36. Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
  37. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
  38. Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
  39. Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155 HPAI H5N1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved