التتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام الاصباغ الفلورية الليبوهيلليك

Melissa Ana Inal; Kota Banzai; Daichi Kamiyama

doi:10.3791/60716

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نحن نقوم بوصف طريقه للتتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام اصباغ فلورية للدهون.

Abstract

نحن وصف تقنيه لوضع العلامات إلى الوراء من الخلايا العصبية الحركية في دروفيبيلا. نستخدم صبغه زيتية ذائبه بالزيت ونقدم قطره صغيره إلى اعداد الشرائح الجنينية بواسطة الحاقن المجهري. يمكن بعد ذلك تسميه كل الخلايا العصبية الحركية التي يتم الاتصال بها بواسطة القطيرات بسرعة. يتم تسميه الخلايا العصبية الحركية الفردية بشكل مستمر ، مما يتيح التفاصيل الهيكلية الدقيقة ليتم تصورها بوضوح. النظر إلى ان الاصباغ محبه للدهون تاتي في ألوان مختلفه ، وتقنيه يوفر أيضا وسيله للحصول علي الخلايا العصبية المجاورة المسمية في متعدد ألوان. التالي فان تقنيه التتبع هذه مفيده لدراسة نشاه الخلايا العصبية والاتصال المتشابك في نظام الخلايا العصبية الحركية من دروفويلا.

Introduction

يوفر نظام الخلايا العصبية الجنينية للمحركات نموذجا تجريبيا قويا لتحليل أليات الكامنة وراء تطور الجهاز العصبي المركزي (CNS)¹^،²^،³. نظام الخلايا العصبية الحركية قابل للتقنيات البيوكيميائية والجينية والتصويرية والكهربية. باستخدام التقنيات ، يمكن اجراء التلاعب الجيني والتحليلات الوظيفية علي مستوي الخلايا العصبية أحاديه المحرك²^،⁴^،⁵^،⁶.

خلال التطور المبكر للجهاز العصبي ، والانفجارات العصبية الانقسام وتوليد عدد كبير من الخلايا العصبية والعصبية. وقد تم التحقيق سابقا في العلاقة المكانية بين الفصل والتعريف الجيني للتعبيرات العصبية في التفاصيل⁷^،⁸^،⁹. في حاله نظام الخلايا العصبية الحركية ، تمت دراسة تشكيل الوصلة العصبية العضلية الجنينية (nmj) علي نطاق واسع باستخدام aCC (خليه الزاوية الاماميه) ، RP2 (الجمبري الخام 2) ، والخلايا العصبية RP5 موتور²^،¹⁰. علي سبيل المثال ، عندما تشكل الخلايا العصبية الحركية RP5 تقاطع متشابك الوليدة ، يتم مزج filدستور قبل متشابك وبعد متشابك¹¹^،¹²^،¹³. مثل هذه الاتصالات الخلوية المباشرة أمر حيوي للبدء في تشكيل NMJ. علي عكس ما نعرفه عن فروع العصب المحيطيه ، معرفتنا كيف المحرك تشعبات بدء الاتصال متشابك داخل الاجهزه العصبية الخاصة لا تزال بدائية.

في هذا التقرير ، نقدم تقنيه تسمح بوضع العلامات الارتجاعية للخلايا العصبية الحركية في الاجنه عن طريق تقديم الاصباغ المضادة للدهون بواسطة الماصات المجهرية. هذه التقنية تمكننا من تتبع الخلايا العصبية الحركية 38 العصب كل من عضلات جدار الجسم 30 في الجزء هيمي في 15 ح بعد وضع البيض (AEL)¹⁴. باستخدام هذه التقنية ، وقد حققت مجموعتنا بدقه العديد من المكاسب من وظيفة/فقدان الوظيفة الاليلات¹⁵^،¹⁶^،¹⁷. وقد كشفنا مؤخرا أليات الجزيئية التي تدفع بدء الاتصال تغصن المحرك وأظهرت ان التفاعل Dscam1-قفص-باك يعرف موقع النمو تغصن في الخلايا العصبية الحركية aCC¹⁷. بشكل عام ، هذه التقنية قابله للتكيف مع التحليل الظاهري لأي من الخلايا العصبية الحركية الجنينية في السلالات البرية أو المتحولة ، مما يعزز قدرتنا علي توفير رؤى جديده في التصميم الوظيفي للجهاز العصبي دروفويلا .

Protocol

1-المعدات واللوازم

مواد لجمع الاجنه وتدريب البالغين علي وضع البيض
1. اعداد جهاز الترشيح عن طريق قطع أنبوب 50 mL وفتح فتحه ثقب في الغطاء لتعيين فلتر شبكه مع المسام من 100 μm (جدول المواد) في ما بين الأنبوب والغطاء.
  ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مصافي الخلية مع المسام من 100 μm (جدول المواد) لخطوه الترشيح لجمع الاجنه.
2. جعل لوحات أجار مع العنب أجار بريميكس (جدول المواد) وفقا للتعليمات المذكورة. لفتره وجيزة ، ويحرك برفق 1 حزمه من مسحوق مزيج في 500 مل من درجه حرارة الغرفة (RT ، 23 درجه مئوية) dH₂س والميكروويف المخلوط المذاب ليغلي قويه. بعد يبرد إلى 70 − 75 [ك], يصب الخليط داخل [بتري] اطباق (60 [م]). بعد ان وطدت أجار ، وتخزين لوحات في 4 درجه مئوية.
3. اعداد عجينه الخميرة عن طريق خلط الخميرة الجافة النشطة (جدول المواد) والماء إلى الاتساق عجينه ، والحفاظ علي 4 درجه مئوية.
4. استخدام أقفاص جمع البيض (ل 60 mm طبق بيتري ، جدول المواد) التي توفر ما يكفي من تدفق الهواء.
اعداد ابر التشريح وحقن الصباغ ميكروبيفتس
1. اعداد حقن الصباغ ميكروماص وابره تشريح من نفس الأنابيب الشعرية مع القطر الداخلي من 0.6 مم والقطر الخارجي من 1.2 مم (جدول المواد). سحب الأنابيب الشعرية بواسطة ساحبه ميكروماص في 7 ٪ من 170 V الإنتاج الأقصى (جدول المواد) لإنشاء ابره حاده مع تفتق من ~ 0.4 سم في الطول.
2. لحقن الصبغة ، اضبط الماصة المجهرية باستخدام الماص المجهري (جدول المواد) بواسطة تقنيه الشطف بالفقاعات الموصوفة في دليل الاداه.
  1. باختصار ، نقع في طاحونة مع وكيل ترطيب (جدول المواد) لمنع المياه من ' سحب ' غيض ابره. ضع الابره علي مشبك الماصات المجهرية في الساعة 25 − 30 درجه واخفض الطرف إلى ثلثي نصف القطر من وسط سطح الشطف. طحن الابره في حين حقنه مع أنابيب يدفع الهواء إلى الابره ، لضمان ان الماصات الدقيقة سوف تكون واضحة من نجاره الزجاج.
  2. ضع علامة علي الماصة الصغيرة مع علامة دائمة بطرف رفيع للاشاره إلى موضع الفتحة عند الطرف بعد الشطف حيث انه من الصعب تحديد مكان الفتحة الضيقة للماصة المجهرية التي تتشكل بزاوية.

2. التحضير لجمع الاجنه

التاكد من ان الذباب الكبار (20 − 40 البرية من نوع كانتون-S أو الذباب الأبيض ) ، الذكور والإناث ، والحفاظ علي الشباب (< 7 أيام) والظروف الصحية لجمع البيض المثالي.
ملاحظه: لتحفيز زرع البيض ، يتم تدريب الذباب في قفص جمع البيض قبل بضعة أيام من جمع البيض علي لوحات أجار سترمل مع معجون الخميرة علي الأقل مره واحده كل يوم.

3. الجنين التدريج

السماح لذباب لوضع البيض بين عشيه وضحيها (أو علي الأقل 15 ح) في RT لجمع الاجنه في 15 ح AEL ، اي المرحلة 16¹⁸، لعرض dendritogenesis من لجنه التنسيق الاداريه و RP3 الخلايا العصبية الحركية. في الصباح ، وجمع لوحه مع البيض.
ملاحظه: الاجنه في 15 ح AEL سيكون لها منفصلة 4-غرفه الأمعاء¹⁸. للتصوير مراحل مختلفه تتبع المعايير المورفولوجية المحددة وظروف الشيخوخة.
لجمع الاجنه ، ديتشوريوناتي البيض وضعت علي لوحه مع التبييض 50 ٪ لمده 5 دقائق.
مره واحده وقد مسح المشيمة ، صب محتويات لوحه من خلال جهاز الترشيح أو مصفاه الخلية لعزل الاجنه. باستخدام زجاجه الضغط من الماء ، تمييع التبييض اليسار علي لوحه وجمع أكبر عدد ممكن من الاجنه عن طريق الخلط بين الخليط في فلتر.
اغسل الاجنه علي الفلتر 3 − 4x مع المزيد من الماء أو حتى تبدد رائحة المبيض. أزاله فلتر من الجهاز وغسل الاجنه علي لوحه نظيفه أخرى مع الماء. Decant الماء من لوحه جديده ان الاجنه علي.
اعداد شريحة زجاجيه من خلال تغطيتها مع طبقتين من الشريط الفينيل في المركز ، وتشكيل مستطيل. قطع حوض مستطيل من الشريط باستخدام شفره الحلاقة. ضع شريطا رفيعا علي الوجهين باتجاه الطرف العلوي للمسبح ، وهذا هو المكان الذي ستوضع فيه الاجنه كما هو مبين في الشكل 1.
باستخدام ملقط دقيق ، حدد بشكل فردي 5 − 10 أجنه في 15 h AEL ووضعها علي الشريط علي الوجهين مع الجانب الظهري الذي يواجه. أضافه المالحة الحشرات الرنين¹⁹ إلى تجمع تشريح لحماية الاجنه من التجفيف (الشكل 1).

4. تشريح وتلطيخ

باستخدام ابره الزجاج تحت المجهر تشريح (جدول المواد) ، وقطع من خلال خط الوسط من جنين واحد علي سطحه من الخلفي إلى نهايته الاماميه. ثم اسحب الجنين من الغشاء المحيه من الشريط علي الزجاج (محاصر في الشكل 1). يجب الحرص علي عدم اتلاف الانسجه الداخلية للجنين.
قلب الانسجه الظهاريه من المركز ونعلق حافه البشرة علي سطح الشريحة الزجاجية (الشكل 1، أقحم).
باستخدام ابره متصلة أنبوب مع فتح غيض من ~ 300 μm (التي أعدتها كسر غيض رقيقه من ابره تشريح) ، يستنشق أو ضربه الهواء لفصل وأزاله جذوع الرغامي طوليه الظهرية ، فضلا عن اي الشجاعة المتبقية.
استخدم 4% بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي الفوسفات المخزن لإصلاح الاجنه لمده 5 دقائق في RT. غسل الاجنه 3x مع تلفزيوني.
وصمه عار الاجنه مع 1 μL من مكافحه الفجل البيروكسيديز الأجسام المضادة مترافق مع سيانين 3 صبغ (المضادة لCy3) (جدول المواد) في 200 μl من تلفزيوني ل 1 ح. غسل الاجنه مع تلفزيوني 3x بعد تلطيخ.
ملاحظه: يمكن تغيير صبغ المضادة لل-الأس علي أساس الاصباغ محبه للدهون من اختيار للحقن.

5. ملء الحقن مايكرو الماصة

الاصباغ الحرارية محبه للدهون (5 ملغ/مل من ديو أو فعل ، جدول المواد) إلى 60 درجه مئوية في 1:10 خليط من الايثانول: الزيوت النباتية قبل الاستخدام.
قم بتحضير شريحة صبغ ذائبه بالزيت لماصه الحقن المجهرية. ضع الماصة المجهرية في حامل الشعيرات الشعرية (الشكل 2، #1). باستخدام المعالجة الدقيقة (جدول المواد) ، اضبط الماصة الصغيرة لتكون فوق شريحة الصبغة. ثم اضبط المرحلة لوضع الماصة علي الصبغة (الشكل 2، #2).
لتعبئة الماصات الدقيقة ، استخدم الحاقن المجهري (جدول المواد) (الشكل 2، #3). جمع الصبغة في ميكروماص عن طريق وضع P_i (ضغط الحقن) بين 200 − 500 hPa (هكتوباسكال) ، T_i (وقت الحقن) بين 0.1 − 0.5 s و P_c (ضغط التعويض) إلى 0 hPa لمده 5 دقائق (الشكل 2، #4).
مره واحده وقد تم جمع الصبغة ، وأزاله الشريحة صبغ ووضع العينة علي مرحله المجهر. المقبل ، وزيادة P_c إلى مجموعه من 20 − 60 hPa قبل خفض الماصة في العينة لمنع تلوث برنامج تلفزيوني عن طريق العمل الشعرية.

6. صبغ حقن في الخلايا العصبية

حدد موقع الجنين في المركز باستخدام المجهر مع عدسه موضوعيه 10x (جدول المواد) ومحاذاة الماصات الدقيقة مع الجنين.
ملاحظه: يمكن تعديل حجم قطره الصبغة عن طريق تغيير P_i أو حجم فتحه طرف الماصة المجهرية. يجب ان تكون القطرات من 10 − 20 ميكرومتر ، وهو ما يقرب من عرض 1 العضلات.
تغيير عدسه الهدف إلى الغمر المياه 40x عدسه (جدول المواد) وتحت دمج العدسة في الاذاعه التلفزيونية لرؤية الجنين.
1. استخدام المجهر الفلوري للتحقق من التشكل الخلايا العصبية التي تميزت المضادة لCy3 وتحديد موقع الحقن.
2. اثناء الحقن ، استخدم المجهر الميداني لرؤية الصبغة التجميعية. عندما يكون الجنين في التركيز ، تغيير موقف الماصة لاجراء اتصال لطيف مع غيض من محور الاهتمام (علي سبيل المثال ، aCC ، RP3).
3. إسقاط الصبغة في البطن اليمني (A2 − A6) هيمي-الجزء في التقاطع العصبي العضلي للجنة التنسيق الاداريه أو RP3 (الشكل 3) مع اما فعل أو ديو ، باستخدام الخلايا العصبية التي تميزت مكافحه الCy3. باستخدام السيطرة علي اليد (الماوس; الشكل 2، 5) الإفراج عن صبغه وأزاله ميكروماص بعد إسقاط الصبغة مع الجزئي والانتقال إلى موقع الحقن المقبل.
  ملاحظه: خلافا لغيرها من الاصباغ (علي سبيل المثال ، إبليس الأصفر ، calcein) التي انتشرت في الخلايا المجاورة من خلال تقاطعات الفجوة ، الاصباغ محبه للدهون المنتسبين مع اغشيه الخلايا ولا نقل إلى الجيران. نظرا للحجم الكبير نسبيا من الصبغة الحبريه ، ومع ذلك ، هذه التقنية أيضا نتائج في وضع العلامات علي العضلات الشريكة (الشكل 3ا).
احتضان العينة في RT لمده 1 ساعة بعد صبغ قطره قبل التصوير.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا قبل التركيب ، ويمكن الاحتفاظ بالعينة عند 4 درجات مئوية بين عشيه وضحيها. يمكن أيضا ان يتم تسليم الاصباغ lipophilic باستخدام الإدرار الأيوني ، إذا مكبر للصوت داخل الخلايا (DC) هو متاح بسهوله²⁰.

7. التصوير مع المجهر البؤري

أزاله الشريط علي الوجهين والشريط الفينيل من الشريحة الزجاجية مع مساعده من ملقط.
اعداد زلة الغطاء (22 × 22 مم² no. 1 غطاء الزجاج) مع كميه صغيره من الشحوم فراغ (جدول المواد) في الزوايا الأربع ومكان بعناية علي العينة ، وتجنب فقاعات الهواء. أزاله اي الزائدة التلفزيونية باستخدام مساحات المهام.
اضغط باستمرار علي زلة الغطاء لضبط مسافة العمل بين العدسة الموضوعية والعينة. ختم تماما حواف زلة الغطاء مع طلاء الأظافر.
صوره في التكبير 10x و 100x باستخدام المجهر البؤري.
استخدام برنامج ImageJ لمعالجه الصور الخام من المجهر (جدول المواد).
ملاحظه: يجب ان تبدا المراقبة في غضون 10 دقيقه بعد التركيب للحصول علي أفضل الصور. خلاف ذلك ، في RT ، سوف تنتشر صبغه إلى المواقع المجاورة لموقع الحقن خلق خلفيه غير مرغوب فيها للتصوير. لإبطاء انتشار صبغ ، يمكن تخزين العينة في 4 درجه مئوية لبضع ساعات.

النتائج

ويظهر صوره تمثيليه لل aCC و RP3 الخلايا العصبية الحركية في الشكل 3ج لإظهار وسم متعدد ألوان من الخلايا العصبية الحركية في 15 ح AEL. المتحولات الخاصة بهم هي ثابته إلى حد كبير بين الاجنه. ويظهر نمط تلطيخ التي تم الحصول عليها مع الأجسام المضادة لمكافحه التناسل باللون الرماد?...

Discussion

استخدام الوسم صبغ لدراسة المورفولوجية العصبية لديها العديد من المزايا علي تقنيات الخلايا الوراثية وسم. يمكن لتقنية وضع العلامات صبغ تقليل مقدار الوقت اللازم لوضع العلامات والتصوير من مورفولوجيس من الخلايا العصبية الحركية. عمليه وضع العلامات صبغ سريع جدا لأنه ياخذ اقل من 2 ح وتمكننا من تح...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر كامياما علي التعليقات علي المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 NS107558 (إلى M.I. ، K.B. ، و دي).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x objective lens	Nikon		Plan
40x water-immersion lens	Nikon		NIR Apo
Capillary tubing	Frederick Haer&Co	27-31-1
Confocal microscope	Andor	N/A	Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
Double Sided Tape	Scotch	665
Dow Corning High-Vacuum Grease	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ	NIH		Image processing software
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Micropipette beveler	Sutter	BV-10-B
Needle puller	Narishige	PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets	FlyStuff	47-102
Nylon Net Filter	Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Wetting agent
Upright fluorescence microscope	Nikon	N/A	Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape	Scotch	6143
VWR Cell Strainers	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	Active dry yeast (RED STAR)

References

Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
. Drosophila Ringer's solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: