JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لقد وضعنا بروتوكولا لتوليد وتقييم نموذج الماوس NOG المصاب بفيروس نقص المناعة البشرية الإنسان على أساس زرع الخلايا الجذعية، والتعرض لفيروس نقص المناعة البشرية داخل المهبل، وقطرات PCR RNA الرقمية التحديد الكمي.

Abstract

توفر الفئران الأنسّمة منصة متطورة لدراسة فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) ولاختبار الأدوية المضادة للفيروسات. يصف هذا البروتوكول إنشاء جهاز مناعة بشري في فئران NOG البالغة. هنا ، نشرح جميع الخطوات العملية من عزل دم الحبل السري المستمدة من خلايا CD34 البشرية وزرعها عن طريق الوريد في الفئران ، إلى التلاعب في النموذج من خلال عدوى فيروس نقص المناعة البشرية ، والجمع بين العلاج المضاد للفيروسات القهقرية ( cART)، وأخذ عينات الدم. يتم حقن ما يقرب من 75000 hCD34 + الخلايا عن طريق الوريد في الفئران ومستوى التشيميرة البشرية ، والمعروفة أيضا باسم أنسنة ، في الدم المحيطي ويقدر طوليا لعدة أشهر عن طريق قياس التدفق الخلوي. ما مجموعه 75،000 hCD34 + الخلايا تسفر عن 20٪ -50٪ خلايا CD45+ الإنسان في الدم المحيطي. الفئران عرضة للعدوى داخل المهبل بفيروس نقص المناعة البشرية والدم يمكن أن تؤخذ عينات مرة واحدة أسبوعيا للتحليل، ومرتين شهريا لفترات طويلة. يصف هذا البروتوكول كمية كمية من الحمل الفيروسي البلازما باستخدام قطرة PCR الرقمية (ddPCR). نحن نظهر كيف يمكن التعامل مع الفئران بشكل فعال مع نظام cART القياسية للرعاية في النظام الغذائي. تسليم cART في شكل تشاو الماوس العادية هو صقل كبير للنموذج التجريبي. ويمكن استخدام هذا النموذج للتحليل قبل السريري لكل من مركبات الوقاية قبل التعرض الجهازية والموضعية وكذلك لاختبار العلاجات الجديدة واستراتيجيات علاج فيروس نقص المناعة البشرية.

Introduction

فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) هو عدوى مزمنة مع أكثر من 37 مليون شخص مصاب في جميع أنحاء العالم1. مزيج العلاج المضاد للفيروسات (cART) هو العلاج المنقذ للحياة، ولكن لا يزال هناك ما يبرر العلاج. وبالتالي، هناك حاجة إلى نماذج الحيوانات التي تعكس جهاز المناعة البشري واستجاباته من أجل تسهيل البحوث المستمرة في مجال فيروس نقص المناعة البشرية. وقد وضعت أنواع متعددة من الفئران أنسنة قادرة على دعم الخلايا والأنسجة الترقيع عن طريق زرع الخلايا البشرية في الفئران نقص المناعة الشديد2. وهذه الفئران الأنمنية معرضة للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وتوفر بديلا هاما لنماذج فيروس نقص المناعة سيميان الرئيسيات غير البشرية، لأنها أرخص وأبسط في الاستخدام من الرئيسيات غير البشرية. وقد سهلت الفئران أنسنة البحوث في انتقال فيروس نقص المناعة البشرية الفيروسية، الإمراض، والوقاية، والعلاج3،4،5،6،7،8،9،10،11.

نحن نقدم نظام نموذج إنساني مرن لأبحاث فيروس نقص المناعة البشرية التي تم تطويرها عن طريق زرع الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من دم الحبل السري في فئران NOD. Cg-كورياالديمقراطيةscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) الخلفية. إلى جانب كونها من أصل غير الجنيني ، فإن الهندسة الحيوية العملية لهذه الفئران أقل تطلبًا من الناحية الفنية مقارنة بالعمليات الجراحية الدقيقة المشاركة في زراعة بناء الغدة الصعترية للدم الكبد (BLT).

نعرض كيفية تحديد عدوى فيروس نقص المناعة البشرية من خلال انتقال العدوى داخل المهبل وكيفية مراقبة الحمل الفيروسي البلازما مع القطرة الحساسة الرقمية PCR (ddPCR) القائم على الإعداد. في وقت لاحق، ونحن نصف إنشاء cART القياسية نظرا كجزء من النظام الغذائي الماوس اليومي. والهدف من هذه الأساليب مجتمعة هو الحد من الإجهاد على الحيوانات وتسهيل التجارب على نطاق واسع حيث الوقت الذي يقضيه في التعامل مع كل الحيوانات محدودة12.

في البشر، وCCR5Ο32/wt أو CCR5Ο32/ Ο32 يؤدي إلى انخفاض التعرض للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية مع الفيروسات المرسل / مؤسس13،ويجب اتخاذ بعض الاحتياطات عند الهندسة الحيوية أنسنة الفئران مع الخلايا الجذعية لغرض دراسات فيروس نقص المناعة البشرية. هذا صحيح بشكل خاص في منطقتنا لأن المتغيرات التي تحدث بشكل طبيعي في الجين CCR5 ، وخاصة عمليات الحذف 32 ، هي أكثر انتشارا في السكان الأصليين الاسكندنافية والبلطيق مقارنة ببقية العالم14،15. وهكذا، يتضمن بروتوكولنا فحصسهل وعالي الإنتاجية لفحص الخلايا الجذعية الهيماتوبوية المانحة للمتغيرات CCR5 قبل الزرع.

للتعرض داخل المهبل اخترنا الارسال / مؤسس R5 فيروس RHPA4259، معزولة عن امرأة في مرحلة مبكرة من العدوى الذين أصيبوا عن طريق المهبل16. لقد عرّضنا الفئران لجرعة فيروسية كانت كافية لإنتاج انتقال ناجح في غالبية الفئران، ولكن أقل من معدل انتقال 100%.. ويتيح اختيار هذه الجرعة نطاقا ً دينامياً كافياً في معدل انتقال العدوى بحيث يمكن أن تؤدي الآثار المضادة للفيروسات لمرشح المخدرات إلى حماية الحيوانات في تجارب الوقاية من فيروس نقص المناعة البشرية وانخفاض الحمل الفيروسي لدراسات العلاج.

Protocol

تم الحصول على جميع عينات دم الحبل السري وفقا ً للبروتوكولات المعتمدة محلياً، بما في ذلك الموافقة المستنيرة على التبرع المجهول من قبل الوالدين. تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية وتنفيذها وفقًا للأنظمة الوطنية الدنماركية بموجب الترخيص 2017-15-0201-01312.

تنبيه: التعامل مع الفئران المعرضة لفيروس نقص المناعة البشرية والدم بحذر شديد. تطهير جميع الأسطح والسوائل التي تم ملامسة فيروس نقص المناعة البشرية مع مطهر فيروس نقص المناعة البشرية وأكد(جدول المواد).

1. عزل الخلايا الجذعية CD34 + الإنسان

  1. جمع عينات دم الحبل السري في أنابيب جمع الدم المغلفة EDTA بعد العمليات القيصرية المخطط لها أو الولادات المهبلية ووفقا للموافقات الأخلاقية المحلية.
  2. عزل الشركات العسكرية والأمنية الخاصة من دم الحبل السري عن طريق فصل التدرج الكثافة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. عزل خلايا CD34+ من السكان PBMC عن طريق أول ما قبل التخصيب مع الأجسام المضادة ضد علامات مشتركة للخلايا الناضجة، مما يؤدي إلى ربط الخلايا من الأنساب غير المرغوب فيها مع خلايا الدم الحمراء. ويتبع ذلك إثراء الخلايا CD34+ باستخدام الخرز المغناطيسي، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    1. تحديد عدد الخلايا الحية عن طريق استبعاد أزرق trypan قياسي عن طريق إعادة تعليق 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في 90 ميكرولتر من الأزرق trypan. أضف 10 ميكرولتر من هذا المحلول إلى مقياس الهيماكومتر وعد الخلايا غير الزرقاء، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. الاحتفاظ بالتبريد بشكل قابل للحفاظ على خلايا CD34+ في 1 مل من 10٪ DMSO في مصل الأبقار الجنين (FBS) حتى يوم زرع الماوس.
    3. Cryomaintain Viably جزء صغير من كل من المعزولة (CD34 +) وتدفق من خلال الخلايا (CD34-) بشكل منفصل لتقييم نقاء الخلايا الجذعية CD34 + (~ 30،000 الخلايا من كل عينة). بدلاً من ذلك، اختبر النقاء على الخلايا الغنية حديثًا (انظر الخطوة 2 أدناه).
    4. تجميد جزء من التدفق غير الحبيبات من خلال (CD34-) لتحديد حالة CCR5Ο32. يمكن تجميد الخلايا مباشرة دون حل تجميد مشروط ، ولكن وجود خلايا الدم الحمراء في بيليه يمكن أن تمنع PCR اللاحقة إذا كان التدفق من خلال بيليه.

2. تقييم CD34 + نقاء الخلايا الجذعية عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. إذابة الخلايا المعزولة (CD34+) والخلايا المتدفقة (CD34-). غسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق الخلايا من كل قارورة في 9 مل من درجة حرارة الغرفة (RT) FACS العازلة، التي تتكون من 2٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) في محلول مالى المخزنة مؤقتا ً بالفوسفات (PBS).
  2. الطرد المركزي لمدة 5 دقيقة في 300 × ز في RT إلى خلايا بيليه.
  3. صب قبالة supernatant، وإعادة تعليق الخلايا في السائل المتبقي ونقلها إلى أنابيب FACS. كرر خطوة الغسيل مع 3 مل من المخزن المؤقت FACS. بعد الطرد المركزي الثاني، صب قبالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في السائل المتبقي.
  4. إضافة 5 ميكرولتر من حل حجب مستقبلات FC(جدول المواد)وترك لمدة 10 دقيقة في RT. لا تغسل حل حجب مستقبلات FC.
  5. إضافة مزيج يحتوي على كميات محددة سلفا من الأجسام المضادة ضد CD3 الإنسان (استنساخ SK7) BUV395، CD34 (استنساخ AC136)، FITC، وCD45 (استنساخ 2D1) APC(الجدول 1). ترك الخلايا لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. يجب اختيار الفلوروفوريات على أساس المعلمات التي يمكن تقييمها باستخدام مقاييس التدفق الخلوي المتاحة دون الحاجة إلى مصفوفة تعويض.
  6. غسل الخلايا مع 3 مل من المخزن المؤقت FACS.
  7. الطرد المركزي لمدة 5 دقيقة في 300 × ز في RT لبيليه الخلايا.
  8. صب قبالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في السائل المتبقي.
    1. كرر هذه الخطوة الغسيل 2x لضمان إزالة جميع الأجسام المضادة غير المنضمة.
  9. تسجيل العينات على مقياس التدفق الخلوي(جدول المواد)وإجراء تحليل البيانات مع البرامج المناسبة. وترد استراتيجية الجاتينغ في الشكل 1ألف- واو.

3. الفحص الجيني للمتغيرات CCR5Ο32 في دم الحبل السري

  1. احتضان 1.25 ميكرولتر من التدفق غير الحبيبات من خلال مع 11.25 ميكرولتر من مزيج PCR يحتوي على 200 ميكرومتر من مزيج dNTP، 0.01 U/μL عالية الدقة الحمض النووي البوليميراز، والتمهيديات الأمامية والعكسية المفصلة في الجدول 2.
    1. ضبط مستوى الصوت مع المياه خالية من nuclease إلى ما يقرب من 12.5 ميكرولتر لكل تفاعل PCR.
  2. تضخيم شظايا الجينوم مع برنامج ركوب الدراجات PCR مفصلة في الجدول 3.
  3. فصل منتجات PCR على هلام agarose 2٪13.
    1. منتجات PCR من alleles نوع البرية وalleles Ο32 تسفر عن شظايا PCR من 196 زوجقاعدة و 164 نطاقات أزواج قاعدة على التوالي، مما يجعلها قابلة للتمييز بسهولة عن طريق الهلام الكهربائي13 (الشكل 1G).

4- زرع الخلايا الجذعية عن طريق الوريد

ملاحظة: وجود شخص واحد إعداد الخلايا في المختبر وشخص آخر إعداد الفئران ومساحة العمل لعمليات الزرع هو نهج فعال.

  1. في منشأة للحيوانات، 4-6 ساعة قبل زرع الخلايا الجذعية المخطط لها، تشعيع 6-7 أسابيع من العمر NOD الإناث. Cg-prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG) الفئران(جدول المواد)مع 0.75 Gy مع مصدر Cs137. قد تختلف أفضل جرعة مسبقة بناءً على عمر الفأر ومصدر الإشعاع وعوامل أخرى. هذه العملية الظروف الحيوانات لتطعيم ناجحة مع الخلايا الجذعية البشرية.
  2. في منشأة للحيوانات، قم بإعداد مساحة عمل مقعد التدفق وجميع الكواشف قبل إحضار الفئران أو الخلايا إلى مساحة العمل.
    1. ضع وسادة زرقاء معقمة لتغطية سطح العمل لمقاعد البدلاء. إعداد الشاش المعقم وحاوية حادة.
    2. ضع مصباح تدفئة مطهرًا بالإيثانول بنسبة 70٪ في مقعد التدفق مع قفص فأر معقم فارغ تحت الحرارة.
  3. في المختبر، إذابة خلايا CD34+ المعزولة وتمييعها في 9 مل من 37 درجة مئوية عادي RPMI.
  4. الطرد المركزي الخلايا في 350 × ز لمدة 5 دقيقة في RT، تجاهل supernatant عن طريق الطموح، وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من RPMI عادي في 37 درجة مئوية.
  5. تحديد عدد الخلايا عن طريق استبعاد الأزرق trypan، وضبط مستوى الصوت إلى 200 ميكرولتر لكل فأرة. جعل اضافية لتأخذ في الاعتبار الخسارة المحتملة بسبب خطوات المناولة اللاحقة.
    1. الاستعداد لزرع 75،000 CD34 + الخلايا لكل 200 ميكرولتر في كل فأرة.
    2. يمكن الاحتفاظ بالخلايا عند 4 درجات مئوية أثناء نقلها إلى منشأة الحيوان قبل عملية الزرع. تجنب إبقاء الخلايا على الجليد للحد من التجميع أو التكتل.
  6. في منشأة الحيوان، وجلب القفص مع الفئران في مقاعد البدلاء تدفق ونقل الفئران إلى القفص تحت مصباح التدفئة لتمدد الأوعية الدموية. ترك نهاية واحدة من القفص بعيدا عن مصدر الحرارة بحيث الفئران يمكن أن تتحرك بعيدا عن الحرارة عند أن تصبح دافئة. الفئران التي انتقلت إلى نهاية القفص ، بعيدا عن مصدر الحرارة ، دافئة بما فيه الكفاية لحقن الوريد الذيل ناجحة.
  7. قم بتحميل حقنة مشحمة 1 مل إلى أعلى علامة 800 ميكرولتر مع خلايا CD34+ المعلقة. استخدام مشحم 1 مل حقنة سوف تخفف بشكل كبير من الحقن عن طريق الوريد وزيادة دقة هذه التقنية.
  8. إرفاق إبرة 30 G 13 مم وإعداد الإبرة والحقن للحقن. يسمح هذا الترتيب من العملية للحقنة ليتم تحميلها بشكل أسرع مع حماية سلامة الخلايا التي سيتم زرعها نظرا للضرر المحتمل الذي يمكن أن يحدث خلال التطلع السريع للخلايا من خلال إبرة قياس صغيرة من هذا القبيل. ملء محور إبرة مع السائل عن طريق الضغط على المكبس وإزالة السائل وصولا الى علامة 200 ميكرولتر من الإبرة.
  9. ضع فأرًا ساخنًا (الخطوة 4.6) في الكبّاب المستخدم في إعطاء حقن IV. حقن بعناية 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في الوريد الذيل من الماوس. قضاء 2 ق أداء الهبوط والحفاظ على الإبرة إدراجها لمدة 2 ق تقريبا بعد الانتهاء من الحقن. وهذا يضمن أن الخلايا قد هاجرت بشكل كاف بعيدا عن موقع الحقن قبل إزالة الإبرة.
  10. كما يلزم مسح ذيل الفأر بشاش معقم لإزالة أي دم مرئي. وضع الماوس مرة أخرى في قفص المنزل غير ساخنة. كرر إجراء الحقن مع الفئران المتبقية.

5. جمع الدم ومعالجته ا

ملاحظة: يمكن تقييم تطعيم الخلايا البشرية في الدم المحيطي عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد 3-5 أشهر من زرع الخلايا الجذعية البشرية.

  1. سحب عينات الدم من الفئران باستخدام التقنيات المحلية المعتمدة من IACUC.
  2. جمع ما أقصى من 70-100 ميكرولتر من إجمالي الدم في أنابيب مركزية دقيقة معقمة PCR تحتوي على 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (درجة الحموضة = 8.0) لتجنب تخثر الدم.

6. تقييم تطعيم الإنسان عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. نقل 40-50 ميكرولتر من الدم إلى أنابيب FACS.
  2. إضافة 5 μL من حل كتلة مستقبلات FC لمنع الربط غير محدد من الأجسام المضادة وترك لمدة 10 دقيقة في RT.
  3. إضافة الماوس المضادة للأجسام المضادة للإنسان مزيج يحتوي على CD4 (استنساخ SK3) BUV 496، CD8 (استنساخ RPA-T8) BV421، CD3 (استنساخ OKT3) FITC، CD19 (استنساخ sj25c1) PE-Cy7، CD45 (استنساخ 2D1) APC(الجدول 4)وترك لوصمة عار في الظلام في RT لمدة 30 دقيقة. يجب اختيار الفلوروفوريات على أساس المعلمات التي يمكن تقييمها مع أجهزة قياس التدفق المتاحة دون الحاجة إلى مصفوفة التعويض.
  4. إضافة 2 مل من خلية الدم الحمراء المناسبة العازلة إلى كل أنبوب لخلايا الدم الحمراء. استخدام العازلة الانخلاس وضعت خصيصا لتلطيخ الأجسام المضادة قبل تحليل خلايا الدم الحمراء (يتم إعطاء مثال مناسب في جدول المواد). دوامة لفترة وجيزة لضمان التوزيع المتساوي للخلايا في حل الخلايا وتترك لمدة 10 دقيقة في RT. التوزيع المتساوي للخلايا مهم.
  5. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت FACS لوقف رد فعل الانالوسط.
  6. الطرد المركزي لمدة 5 دقيقة في 300 × ز في RT لبيليه الخلايا.
  7. صب قبالة supernatant والدوامة بلطف حتى يتم إعادة تعليق الخلايا.
  8. أضف 3 مل من المخزن المؤقت FACS والطرد المركزي لمدة 5 دقيقة عند 300 × ز في RT.
  9. صب قبالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا.
  10. تسجيل العينات على مقياس التدفق الخلوي المناسب وتحليل باستخدام البرامج المناسبة(جدول المواد). يتم تصوير التحليل التمثيلي والنتائج في الشكل 2 والشكل 3.

7 - التعرض لفيروس نقص المناعة البشرية أثناء المهبل

ملاحظة: يمكن إنتاج الفيروس المستخدم في التعرض داخل المهبل للفئران باستخدام البروتوكولات المنشورة سابقًا17. يتم الاحتفاظ بالفيروس عند -80 درجة مئوية ونقله بين المواقع أثناء تخزينه على الجليد الجاف باتباع البروتوكولات المعتمدة محليًا. يتم تخزين الفيروس على الجليد الجاف حتى مباشرة قبل التعرض للفئران. يمكن تخفيف الفيروس إلى RPMI عادي (تجنب RPMI التي تحتوي على المضادات الحيوية أو إضافات المصل) لتحقيق التركيز المناسب مباشرة قبل التعرض (تم استخدام 21400 IUs لهذا التعرض IVAG). وبمجرد توليدها، احتفظ بالمخزون المخفف على الجليد الرطب طوال العملية لتجنب دورات التجمد والذوبان التي قد تحدث إذا تم وضع الفيروس المخفف مرة أخرى على الجليد الجاف بمجرد إذابة الجليد.

  1. إعداد جميع المعدات وتدفق مساحة العمل مقاعد البدلاء كما هو معروض في الشكل 4 قبل جلب الفئران أو الفيروس في مقاعد البدلاء تدفق (على غرار الخطوة 4.2).
    1. ضع تركيز مصباح التدفئة في وسط مساحة العمل حيث سيتم وضع الماوس أثناء إجراء التعرض لفيروس نقص المناعة البشرية. سوف مصباح التدفئة ضمان عدم انخفاض في درجة حرارة الجسم من الفئران. يمكن أيضًا استخدام المعدات الأخرى التي تتحكم في درجة الحرارة ، (على سبيل المثال ، وسادة هلام ساخنة أو بطانية مياه دافئة متداولة ، وفقًا للوائح IACUC المحلية18).
    2. جلب العقيمة 20 ميكرولتر ماصة نصائح وماصة مناسبة في مقاعد البدلاء. ضع حاوية مع مطهر سائل(جدول المواد)في مقاعد البدلاء للتعطيل الفوري للمواد والسوائل التي تم على اتصال مع الفيروس.
  2. وضع الماوس في غرفة مع 3٪ غاز الإيسولوران والمناشف الورقية. هذه النسبة المئوية من الغاز سوف تُسهّم الحيوانات في غضون 2-4 دقيقة. كما هو الحال مع جميع المواد الأخرى المستخدمة مع الفئران نقص المناعة ، يجب تطهير جهاز التخدير بشكل صحيح قبل الاستخدام.
  3. مرة واحدة بولاية، ونقل الماوس إلى لوحة زرقاء معقمة تحت مصباح التدفئة. إدراج أنمجر الماوس في قناع توريد غاز isoflurane المستمر 3٪ للحفاظ على التخدير. عقد الماوس في قاعدة الذيل، والمعدة التي تواجه، مع يدك دعم الماوس مرة أخرى كما هو مبين في الشكل 4.
  4. مع طرف ماصة معقمة، وتحفيز المنطقة التناسلية عن طريق التمسيد بلطف صعودا نحو الشرج للحث على إفراغ المستقيم، وتخفيف الضغط على المهبل.
  5. عارية بعناية فتح المهبل عن طريق التفاف ذيل الماوس عبر أصابعك مثل أن الفرج يفتح بشكل طبيعي، وربما مع دفع طفيف باستخدام طرف ماصة معقمة.
  6. تغيير تلميح ماصة و20 ميكرولتر من الفيروس atraumatically في المهبل الماوس دون خلق فقاعات. لا تدخل البقشيش في عمق المهبل. بدلا من ذلك، مع فتح الفرج، ضع طرف ماصة على مستوى فتحة المهبل، وتجنب الذهاب أعمق للقضاء على احتمال سحجات أثناء عملية التلقيح، والإفراج عن الفيروس، والسماح للجاذبية لسحب الفيروس في المهبل. بدلا من ذلك، استخدم 22 G 1.25 مم حادة نهاية، إبرة مستقيمة،كما هو موضح في Veselinovic وآخرون.
  7. الاحتفاظ بالماوس في هذا الموقف مع المهبل التي تواجه لمدة 5 دقيقة بعد التعرض لتجنب تسرب الجاذبية الناجمة عن تعليق الفيروس.
    1. وضع الماوس بعناية في قفص المنزل، مع الحرص على وضع الماوس على ظهره.

8. معالجة عينات الدم قبل تحليل الحمل الفيروسي

  1. جمع الدم على النحو المبين في القسم 5 أعلاه.
  2. الطرد المركزي عينات الدم لمدة 5 دقيقة في 500 × ز في RT لفصل البلازما والخلايا.
  3. جمع 40 ميكرولتر من البلازما لقياس الحمل الفيروسي في أنبوب طرد مركزي صغير جديد معقم معتمد من PCR وتخزينه عند -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل حتى تتم المعالجة. من المهم تجميد جميع العينات قبل استخراج الحمض النووي الريبي لتجنب خطر التحيز من مقارنة مستويات الحمض النووي الريبي في العينات التي لم يتم تجميدها قبل عزل الجيش الملكي النيبالي إلى عينات مجمدة قبل عزل الجيش الملكي النيبالي.
  4. ضبط حجم الدم مرة أخرى إلى الحجم الأصلي عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من وسائل الإعلام تعليق (PBS مع 2.5٪ الزلال مصل البقر، 50 U/mL البنسلين G وstreptomycin، و 10 U/mL DNase، معقمة تصفية في 0.22 ميكرومتر).
  5. نقل 15 ميكرولتر من حجم الدم المعدل إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد معتمد من PCR.
  6. إضافة 1 مل من محلول الليزّة RBC 1x(جدول المواد)،دوامة، واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  7. الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 9600 × ز في RT إلى خلايا بيليه.
  8. يستنشق supernatant وترك فقط بيليه الخلية البيضاء الصغيرة، وذلك لأن تلوث خلايا الدم الحمراء يمكن أن تمنع PCR.
  9. تخزين بيليه في -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل حتى مزيد من المعالجة.
    ملاحظة: اختيارياً، يمكن استخدام أي دم متبقي من الخطوة 8.4 لتحليل قياس التدفق الخلوي، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 6.

9. استخراج الحمض النووي باستخدام طريقة استخراج البروتينات K

  1. استخراج الحمض النووي من كريات الخلايا الطرفية (ولدت في الخطوة 8.8) باستخدام طريقة استخراج البروتينات K كما هو موضح أدناه. وقد ثبت هذا الأسلوب لاستخراج أعلى غلة الحمض النووي من كمية صغيرة من الدم مثل تلك المطلوبة لمجموعات الدم المسلسل المستخدمة في هذه الدراسة19.
  2. أضف 25 ميكرولتر من البروتينات K (20 ميكروغرام/مل) إلى 1 مل من 0.1M Tris المخزن المؤقت.
  3. دوامة محلول بروتيناز K لفترة وجيزة.
  4. أضف 50 ميكرولتر من محلول البروتينات K إلى كل خلية بيليه ليتم هضمها.
  5. مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا وتأكيد إعادة تعليق بيليه الخلية.
  6. يهز على thermoshaker(جدول المواد)في 400 دورة في الدقيقة (اعتمادا على الصك) في 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أنابيب الشريط إلى أسفل لعقد لهم في مكان، إذا لزم الأمر.
  7. على الفور وفي نفس thermoshaker، تعطيل البروتينات K مع تحول درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية في حين يستمر اهتزاز لمدة 20 دقيقة إضافية.
  8. دوامة كل عينة.
  9. ضع كل عينة على -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
  10. ذوبان، ثم الطرد المركزي العينات في 17،000 ز لمدة 1 دقيقة في RT لبيليه شظايا الخلوية غير المرغوب فيها.
  11. ضع الـ"سوبرناتانت" المحتوي على الحمض النووي في أنبوب طرد مركزي صغير جديد.
  12. قالب الحمض النووي جاهز لـ PCR. يمكن تخزين قوالب الحمض النووي عند -80 درجة مئوية.

10. استخراج الحمض النووي الريبي، وتوليف cDNA، وقياس كمية ddPCR من الحمض النووي الريبي الفيروسي

  1. عزل الحمض النووي الريبي من بلازما الماوس المذابة مع مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الفيروس بعد بروتوكول الشركة المصنعة(جدول المواد).
  2. بعد إضافة العينة إلى العمود، أضف خطوة علاج DNase على العمود لضمان إزالة جميع الحمض النووي في عينة البلازما.
    1. لكل عينة، إضافة 95 ميكرولتر من RNase خالية من المناز الحل (مزيج 2 μL خالية من الرناز DNase و 98 μL العازلة رد فعل) إلى العمود واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  3. تخزين عينات الجيش الملكي النيبالي في -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل مزيد من المعالجة. من المهم تجميد جميع العينات بعد استخراج الحمض النووي الريبي تجنب خطر التحيز عند مقارنة العينات التي لم يتم تجميدها إلى العينات التي تم تجميدها.
  4. تجميع cDNA باستخدام خطوة النسخة العكسية باستخدام الكواشف كما هو موضح سابقا20. تأكد من إضافة 0.5 ميكرولتر من مثبط RNase إلى رد فعل cDNA لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.
    1. إجراء تجميع cDNA مع البرنامج المفصل في الجدول 5.
  5. تخزين عينات cDNA في -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. من المهم تجميد جميع العينات بعد تخليق الحمض النووي الكلوين تجنب خطر التحيز عند مقارنة العينات التي لم يتم تجميدها إلى العينات التي تم تجميدها.
  6. إعداد عينات لddPCR على النحو التالي20:
    1. مزيج 3 μL من عينة cDNA مع 11 ميكرولتر من خليط التحقيق ddPCR (لا dUTP)20،250 nM طفيفة الأخدود ملزمة التحقيق، و 900 nM من كل من التمهيديات الأمامية والعكسية كما هو مفصل في الجدول 6.
    2. ضبط إجمالي حجم PCR إلى 22 ميكرولتر مع المياه الخالية من nuclease.
  7. استحلاب PCR يمزج مع زيت جيل قطرة للتحقيقات على مولد قطرة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة والأوصاف السابقة20.
  8. تشغيل برنامج PCR كما هو مفصل في الجدول 7.
    ملاحظة: تم تصميم تسلسل التمهيدي / التحقيق وبرامج PCR المعروضة هنا بشكل خاص وتحسينها للكشف الحساس عن سلالة فيروس نقص المناعة البشرية RHPA4259. يمكن بسهولة ضبط تسلسل التمهيدي والمسبار للكشف عن أي سلالة أخرى من فيروس نقص المناعة البشرية من الاختيار.
  9. الكشف عن الفلورة قطرات من العينات على قارئ قطرة، وتحليل النتائج مع البرامج المناسبة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

11. العلاج مع cART التي تحتوي على تشاو

  1. الفئران تغذية مع الكريات التي تحتوي على نظام cART القياسية التي تحتوي على 4,800 ملغ/كغ raltegravir (RAL), 720 ملغ/كغ تينوفوفير ديسوبروكسيل فومارات (TDF), و 520 ملغ/كغ emtricitabine (FTC)21 (الجدول 8). تم تحديد هذه الجرعات على افتراض أن الفأر يزن 25 غرام ويأكل 4 غرام من تشاو يوميا. وهذا يعادل جرعة يومية قدرها 768 ملغم/كغ من RAL، و2.88 ملغم/كغ من TDF، و83 ملغم/كغ من لجنة الممارسات التجارية المنصفة21.
  2. استخدام نظام غذائي cART التي تم إعدادها من قبل بائع خارجي (انظر جدول المواد)من الأدوية التي تصرف بوصفة طبية. ويمكن لشركات أخرى أن تنتج هذا النظام أيضاً. استخدام نظام غذائي cART الأحمر الملونة لتمييزه بسهولة من تشاو الماوس العادي.
    1. إنتاج نظام غذائي تشو التحكم دون cART في اللون البني القياسية لتمييز سهل.
  3. لبدء cART، وإعداد أقفاص الفئران العقيمة مع إضافة النظام الغذائي تشاو cART التي تحتوي على، ومن ثم نقل الفئران من القفص القديم إلى القفص الجديد.
    1. مراقبة أوزان الفئران واستهلاك تشاو التي تحتوي على cART عن طريق التفتيش البصري للتأكد من أن الفئران تتكيف مع التغيير.

النتائج

ويصور استراتيجية الجاتينغ لتحليل نقاء الخلايا الجذعية في الشكل 1. يوضح الشكل 1A-C عدد CD34+ المنقى والشكل 1D-F تدفق CD34- المستخدم لتوضيح أن الحد الأدنى من السكان CD34+ يتم فقدانفي عملية العزل. كانت نقاء الخلايا الجذعية المعزولة CD34+ ?...

Discussion

سلالة الفأر المنقوصة بشدة NOD. Cg-كوريادscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) هو مناسب للغاية لزرع الخلايا والأنسجة البشرية. يتم اختراق كل من المسارات المناعية الفطرية والتكيفية في هذه الفئران. NOG والفئران NSG تؤوي طفرةمبيد ة Prkdc التي تؤدي إلى وظيفة خلية T و B معيبة. وعلاوة على ذل...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ويود المؤلفون أن يشكروا موظفي مرفق الطب الحيوي للحيوانات في جامعة آرهوس، ولا سيما السيدة جاني كور على جهود صيانة المستعمرات وتتبع أوزان الفئران. ويود المؤلفون أن يشكروا البروفيسور فلوريان كلاين على تطويره معيار الرعاية وللتوجيه. تم الحصول على الكاشف التالي من خلال برنامج كاشف الإيدز في المعاهد القومية للصحة، شعبة الإيدز، NIAID، المعاهد القومية للصحة: pRHPA.c/2635 (القط رقم 11744) من الدكتور جون كاباس والدكتورة كريستينا أوكسنباور.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Blue padVWR56616-031Should be sterilized prior to use
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA8022
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7BD Bioscience557835
CD3 (clone OKT3) FITCBiolegend317306
CD3 (clone SK7) BUV395BD Bioscience564001
CD34 (clone AC136) FITCMiltenyi130-113-740
CD4 (clone SK3) BUV 496BD Bioscience564652/51
CD45 (clone 2D1) APCBiolegend368511/12
CD8 (clone RPA-T8) BV421BD Bioscience562428
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)Bio-Rad1863025
DMSOMerck10,02,95,21,000
DNAseSigmaD4263For suspension buffer
dNTP mixLife TechnologiesR0192
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS)BiowestL0615-500
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit IIStemcell17896
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Lysing solution 10XBD349202Dilute 1:10 in dH20 immediately before use
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton)Falcon352052
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX)Biolegend422302
Fetal bovine serumSigmaF8192-500
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17144002
Flowjo v.10
GauzeMesoft157300Should be sterilized prior to use
Heating lampCustom made
Hemacytometer (Bürker-Türk)VWRDOWC1597418
Isoflurane gasOrion Pharma9658
LSR Fortessa X20 flow cytometerBD
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approvedSarstedt72692405
Mouse cART foodssniff Spezialdiäten GmbHCustom made product
Mouse restrainerCustom made product
Needle, Microlance 3, 30G ½"BD304000
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTacTaconicNOG-F
Nuclease-free waterVWR chemicals436912C
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kitMacherey-Nagel740691
PCR-approved microcentrifuge tubesSarstedt72.692.405
Penicillin-Streptomycin solution 100XBiowestL0022-100
Phusion Hot Start II DNA polymeraseLife TechnologiesF549S
Pipette tips, sterile, ART 20P BarrierThermoScientific2149P
Proteinase KNEB100005398
QuantaSoft softwareBio-Rad
QX100 Droplet GeneratorBio-Rad1886-3008
QX100 Droplet ReaderBio-Rad186-3003
RBC lysis solutionBiolegend420301
RNase-free DNAse size F + reaction bufferMacherey-Nagel740963
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitorThermoScientific10777-019
RPMIBiowestL0501-500Dissolve in H20
Softject 1 mL syringeHenke Sass Wolf5010-200V0
Superscript III Reverse TranscriptaseThermoFisher Scientific18080044
ThermoshakerVWR89370-910
Trypane blueSigmaT8154
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0ThermoFisher Scientific15575-020
Virkon S (virus disinfectant)Dupont7511

References

  1. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
  2. Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
  3. Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
  4. Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
  5. Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
  6. Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
  7. Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
  8. Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
  9. Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
  10. Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
  11. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
  12. Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
  13. Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
  14. Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
  15. Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
  16. Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
  17. Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
  18. Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
  19. Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
  20. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  21. Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
  22. Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
  23. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
  24. Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
  25. Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
  26. Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
  27. Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
  28. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
  29. Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  30. Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
  31. Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  32. Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
  33. Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
  34. Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
  35. Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  36. Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
  37. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155 NOG cART CCR5 ddPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved