JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نقدم بروتوكول لضرب بشكل ثابت أسفل الجينات ترميز مصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات في C2C12 myoblasts باستخدام دبوس الشعر الصغيرة (ش) RNA. استهداف ADAMTSL2 كمثال، ونحن نصف أساليب للتحقق من كفاءة الضربة القاضية على مرنا، والبروتين، والمستوى الخلوي خلال C2C12 myoblast إلى التمايز myotube.

Abstract

مصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات حاسمة لتنمية العضلات والهيكل العظمي والتوازن. يمكن تطبيق الضربة القاضية المستقرة لترميز الجينات لبروتينات ECM في C2C12 myoblasts لدراسة دور هذه البروتينات في تنمية العضلات الهيكلية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لاستنفاد البروتين ECM ADAMTSL2 كمثال، وذلك باستخدام دبوس الشعر الصغيرة (ش) RNA في خلايا C2C12. بعد تحويل البلازميدات shRNA، تم اختيار الخلايا المستقرة دفعة باستخدام puromycin. كما وصفنا الحفاظ على هذه الخطوط الخلوية وتحليل الفينوتيبيك عبر تعبير مرنا، والتعبير البروتيني، والتمايز C2C12. مزايا هذه الطريقة هي توليد سريع نسبيا من خلايا C2C12 المنخفضة مستقرة والتمايز موثوق بها من خلايا C2C12 في myotubes متعددة النوية عند استنفاد المصل في وسط ثقافة الخلية. يمكن رصد التمايز من خلايا C2C12 عن طريق المجهر الميداني مشرق وقياس مستويات التعبير من الجينات علامة الكنسي، مثل MyoD، myogenin، أو سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC) مما يشير إلى تطور تمايز Myoblast C2C12 في الأنابيب الأوروبة. على النقيض من الضربة القاضية العابرة للجينات مع الحمض النووي الريبي الصغير التداخل (si) ، يمكن استهداف الجينات التي يتم التعبير عنها لاحقًا أثناء تمايز C2C12 أو أثناء نضوج اليوتيوب بشكل أكثر كفاءة عن طريق توليد خلايا C2C12 التي تعبر بشكل ثابت عن shRNA. القيود المفروضة على هذه الطريقة هي تباين في الكفاءة الضربة القاضية، اعتمادا على shRNA محددة التي يمكن التغلب عليها باستخدام استراتيجيات خروج المغلوب الجينات على أساس CRISPR/Cas9، فضلا عن الآثار المحتملة خارج الهدف من شرنا التي ينبغي النظر فيها.

Introduction

توفر بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) الدعم الهيكلي لجميع الأنسجة ، وتتوسط الاتصال بين الخلايا ، وتحدد مصير الخلية. تشكيل وإعادة عرض ديناميكية من ECM وبالتالي أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الأنسجة والجهاز التوازن1،2. المتغيرات المرضية في العديد من الجينات الترميز لبروتينات ECM تؤدي إلى اضطرابات العضلات والعظام مع الأنماط الظاهرية التي تتراوح بين ضمور العضلات لبناء pseudomouscular3،4. على سبيل المثال ، المتغيرات المسببة للأمراض في ADAMTSL2 تسبب اضطراب العضلات والعظام نادرة للغاية geleophysic خلل التنسج ، الذي يقدم مع بناء العضلات الزائفة ، أي زيادة واضحة في كتلة العضلات الهيكل العظمي5. جنبا إلى جنب مع بيانات التعبير الجيني في الماوس والبشر، وهذا يشير إلى دور لADAMTSL2 في تنمية العضلات الهيكل العظمي أو التوازن6،7.

تم تطوير البروتوكول الذي نصفه هنا لدراسة الآلية التي يقوم بها ADAMTSL2 بتعدل تنمية العضلات الهيكلية و / أو التوازن في إعداد زراعة الخلايا. نحن ضرب نابلة إلى أسفل ADAMTSL2 في خط الخلية myoblast Murine C2C12. C2C12 myoblasts وتمايزها في الأنابيب العضلية هو نموذج ثقافة الخلية الموصوفة بشكل جيد والمستخدمة على نطاق واسع للتمايز العضلات والهيكل العظمي الهندسة الحيوية العضلات8،9. تمر خلايا C2C12 بخطوات تمايز متميزة بعد انسحاب المصل، مما يؤدي إلى تكوين أنابيب الأوولب متعددة النواة بعد 3-10 أيام في الثقافة. يمكن مراقبة خطوات التمايز هذه بشكل موثوق من خلال قياس مستويات مرنا من جينات العلامات المتميزة ، مثل MyoD أو myogenin أو سلسلة myosin الثقيلة (MyHC). إحدى مزايا توليد ضربات قاضية جينية مستقرة في خلايا C2C12 هي أن الجينات التي يتم التعبير عنها في مراحل لاحقة من تمايز C2C12 يمكن استهدافها بشكل أكثر كفاءة، مقارنة بالضربة القاضية العابرة التي حققها الحمض النووي الريبي الصغير التداخل (si) ، والذي يستمر عادة لمدة 5-7 أيام بعد الترانزفيشن ، ويتأثر بكفاءة الترانزفي. والميزة الثانية للبروتوكول كما هو موضح هنا هو الجيل السريع نسبيا من دفعات من الخلايا الضربة القاضية C2C12 باستخدام اختيار puromycin. البدائل، مثل CRISPR/Cas9 بوساطة الجينات بالضربة القاضية أو عزل سلائف الخلايا العضلية الهيكلية الأولية من الفئران البشرية أو الجينات المستهدفة ناقصة هي من الناحية الفنية أكثر صعوبة أو تتطلب توافر خزعات العضلات المريض أو الفئران المنقوصة الجينات المستهدفة، على التوالي. ومع ذلك ، على غرار النهج الأخرى القائمة على ثقافة الخلايا ، هناك قيود في استخدام خلايا C2C12 كنموذج للتمايز خلايا العضلات الهيكلية ، مثل الطبيعة ثنائية الأبعاد (2D) للإعداد ثقافة الخلية وعدم وجود بيئة مجهرية في الجسم الحي التي تعتبر حاسمة للحفاظ على خلايا السلائف العضلية الهيكلية غير المتمايزة10.

Protocol

1. إعداد الحمض النووي بلازميد شرنا من الإشريكية القولونية

  1. جيل من المستعمرات البكتيرية clonal تحمل البلازميدات shRNA
    1. الحصول على مخزونات الجلسرين من الإشريكية القولونية التي تحمل البلازميدات shRNA محددة الهدف وبلازميد التحكم من مصادر تجارية(جدول المواد).
      ملاحظة: تم استخدام ثلاثة البلازميدات shRNA مختلفة، واستهداف مناطق مختلفة من murine Adamtsl2 مرنا. تم اختيار واحد shRNA لاستهداف المنطقة 3'غير مترجمة (3'UTR) من Adamtsl2 لتسهيل تجارب الإنقاذ مع بلازميدات التعبير ترميز المؤتلف كامل الطول ADAMTSL2 أو الفردية مجالات البروتين ADAMTSL2. وبالإضافة إلى ذلك، تم تضمين بلازميد shRNA مخفوق كتحكم سلبي. وترد تفاصيل تسلسل shRNA في الشكل 1ألف.
    2. إذابة مخزون الجلسرين البكتيري SHRNA في درجة حرارة الغرفة (RT). نقل 10 ميكرولتر من مخزون الجلسرين البكتيري على لوحة لوريا-بيرتني (LB) أغار مكمّلة بـ 100 ميكروغرام/مل أمبسيلين (LB-أمبير).
      ملاحظة: يتم إعداد لوحات LB-أمبير عن طريق التعقيم 1 لتر من متوسط LB (ل1 L: 10 غرام من التربتون، 5 غرام من مستخلص الخميرة، 10 غرام من NaCl، ضبط درجة الحموضة إلى 7.0) جنبا إلى جنب مع 12 غرام من أجار. دع المتوسط يبرد إلى ~ 50 درجة مئوية وإضافة الأمبيسيلين (محلول الأسهم: 50 ملغم / مللي لتر في الماء المعقم) إلى تركيز نهائي من ميكروغرام / مل (LB-أمبير أجار). صب على الفور ~ 20 مل من LB-أمبير أجار في طبق بيتري 10 سم والسماح لترسخ أجار قبل الاستخدام. 1 لتر من LB-أمبير أجار عادة ما تكون كافية لتصب حوالي 40 10 سم بيتري الأطباق. أطباق بيتري التي تحتوي على LB-أمبير أجار مستقرة لمدة شهر واحد على الأقل إذا تم تخزينها مختومة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
    3. انتشار البكتيريا مع ملعقة دريغالسكي العقيمة أو أي طريقة مناسبة أخرى لتحقيق مستعمرات بكتيرية واحدة. احتضان لوحات البكتيرية رأسا على عقب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. إعداد البلازميد
    1. في صباح اليوم التالي، وإزالة طبق بيتري مع المستعمرات البكتيرية الفردية وتخزينها في 4 درجة مئوية لتجنب فرط نمو المستعمرات البكتيرية وتشكيل مستعمرات الأقمار الصناعية. ختم طبق بيتري إذا تم تخزينها بين عشية وضحاها أو لفترة أطول.
    2. في فترة ما بعد الظهر، إضافة 5 مل من LB-أمبير المتوسطة في أنبوب ثقافة البولي بروبلين البكتيرية. حدد مستعمرة بكتيرية واحدة من طبق بيتري مثقف بين عشية وضحاها مع طرف ماصة وتلقيح LB-أمبير المتوسطة عن طريق إخراج تلميح ماصة في أنبوب الثقافة البكتيرية التي تحتوي على وسط LB-أمبير.
    3. احتضان الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها في شاكر في 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية مع غطاء تعلق فضفاضة للسماح للتهوّن.
    4. أخرج أنبوب الثقافة البكتيرية في صباح اليوم التالي والحفاظ على 4 درجة مئوية لتجنب فرط البكتيريا. في فترة ما بعد الظهر، إعادة تعليق البكتيريا عن طريق دوامة ونقل 1 مل من الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها في 50 مل من LB-أمبير المتوسطة في قارورة مخروطية 250 مل. احتضان بين عشية وضحاها في شاكر في 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
    5. في صباح اليوم التالي، نقل البكتيريا إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي المتاح والبكتيريا الطرد المركزي في 6000 × ز في RT لمدة 15 دقيقة. إزالة المتوسطة والاستمرار في الخطوة 1.2.6.
      ملاحظة: إذا كان لا يمكن عزل الحمض النووي البلازميد على الفور، قم بإزالة وسط LB-Amp بعد خطوة الطرد المركزي وتخزين بيليه البكتيريا عند -20 درجة مئوية.
    6. اتبع التعليمات لمجموعة إعداد البلازميد (مقياس MIDI) لاستخراج الحمض النووي البلازميد من البكتيريا. تقييم جودة الحمض النووي البلازميد من خلال قياس نسبة A260/A280 باستخدام مطياف ضوئي.
      ملاحظة: نسبةA 260/A280 من > 1.8 أمر مرغوب فيه، مما يشير إلى نقاء عالية من إعداد الحمض النووي البلازميد. تشير نسبةA 260/A280 المنخفضة إلى التلوث بالبروتين أو إزالة الكواشف الاستخراجية بشكل غير كافٍ. قد تكون هناك حاجة إلى خطوات تنقية البلازميد إضافية.

2. التبول وTransfection من خلايا C2C12 واختيار Puromycin

  1. ثقافة الخلية C2C12
    1. ذوبان خلايا C2C12(جدول المواد)بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية وصب الخلايا في أنبوب مركزي قابل للتصرف معقم 15 مل تحتوي على 8 مل من متوسط النسر المعدل (DMEM) في Dulbecco المعدلة مع 100 وحدة من البينسيلين والمضادات الحيوية العقديتوميسين (DMEM خالية من المصل) في غطاء ثقافة الخلية. خلايا الطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 160 × ز في RT.
    2. اسشق supernatant وresuspend بيليه الخلية في 10 مل من DMEM خالية من المصل تستكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) (DMEM كاملة). نقل الخلايا إلى 10 سم زراعة الأنسجة الأطباق البلاستيكية المعالجة. الخلايا المحتضنة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية في الغلاف الجويCO2 بنسبة 5٪.
    3. في اليوم التالي، استبدال المتوسطة مع DMEM كاملة جديدة.
    4. قم بتوسيع خلايا C2C12 ذات الممر المنخفض على أطباق 3-4 10 سم. عندما تصل خلايا C2C12 إلى التقاء 50-60٪، يستنشق الخلايا المتوسطة وشطف خلايا C2C12 مع 10 مل من المالحة المخزنة بالفوسفات (PBS).
    5. إضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA واحتضان لمدة 2 دقيقة في RT. رصد مفرزة الخلية تحت المجهر وتمديد وقت الحضانة إذا لزم الأمر، حتى يتم فصل معظم الخلايا.
      ملاحظة: يمكن أن يساعد النقر بعناية على الطبق في إزاحة الخلايا.
    6. عندما يتم فصل معظم الخلايا، إضافة 10 مل من DMEM كاملة إلى الطبق، ماصة حجم صعودا وهبوطا عدة مرات، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طارد مركزي قابل للتصرف 15 مل معقمة. خلايا الطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 160 × ز في RT. استنشق وإعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل من تجميد المتوسطة (10٪ ثنائي ميثيل sulfoxide [DMSO]/90% FBS).
    7. نقل اثنين من 1 مل aliquots لكل طبق 10 سم في cryovials. تحضن في حاوية تجميد الخلايا مليئة إيزوبروبانول RT لمدة 24 ساعة على الأقل في ثلاجة -80 درجة مئوية مما أدى إلى معدل تجميد حوالي -1 درجة مئوية لكل دقيقة لتجنب تشكيل بلورات الثلج. تخزين الخلايا للاستخدام على المدى الطويل في مرحلة بخار النيتروجين السائل.
      ملاحظة: يوصي المورد باستخدام خلايا C2C12 حتى المرور رقم 15. وأظهرت تجارب المؤلفين أيضا أن انخفاض عدد خلايا المرور أظهرت تمايز أكثر اتساقا وسرعة في الأنابيب الأوائية. من الضروري الحفاظ على خلايا C2C12 في كثافة الخلايا المنخفضة (<50% التقاء) لتجنب بداية مبكرة للتمايز. لا يمكن إرجاع خلايا C2C12 المتمايزة أو المتمايزة إلى حالة myoblast الأصلية ويجب التخلص منها.
  2. إعداد خلايا C2C12 للترانز
    1. خلايا C2C12 اللامتمايزة في طبق 10 سم حتى تصل إلى 50-60٪ التقاء. يستنشق المتوسطة، وشطف خلايا C2C12 مع 10 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA. احتضان لمدة 2 دقيقة في RT، ورصد مفرزة الخلية تحت المجهر، وتمديد وقت الحضانة إذا لزم الأمر، حتى يتم فصل معظم الخلايا.
      ملاحظة: يمكن أن يساعد النقر بعناية على الطبق في إزاحة الخلايا.
    2. عندما يتم فصل معظم الخلايا، إضافة 10 مل من DMEM كاملة إلى الطبق ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طارد مركزي قابل للتصرف معقمة 15 مل. خلايا الطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 160 × ز في RT. استنشق وإعادة تعليق بيليه الخلية في 4 مل من DMEM كاملة.
    3. الجمع بين 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من الأزرق trypan في أنبوب رد فعل 1.5 مل، مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ونفض الغبار بعناية أنبوب رد الفعل، ونقل الخلايا إلى شريحة العد. تحديد رقم الخلية/مل باستخدام عداد خلية تلقائية.
    4. تمييع خلايا C2C12 إلى 50,000 خلية/مل وبذور 100,000 خلية (2 مل) لكل بئر في صفيحة بئر 6 لتحقيق التقاء حوالي 40-50% بعد الحضانة بين عشية وضحاها. الخلايا المحتضنة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية في الغلاف الجويCO2 بنسبة 5٪.
  3. Transfection من خلايا C2C12 مع plasmid shRNA باستخدام polyethylenimine (PEI) واختيار puromycin
    1. إعداد حل أسهم جزيرة الأمير إدوارد
      1. حل 16 ملغ من جزيرة الأمير إدوارد في 50 مل من الماء المقطر المعقم (تركيز محلول المخزون: 0.32 ملغ / مل) في زجاجة وسائط زجاجية 50 مل مع غطاء المسمار. احتضان الحل عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لساعة واحدة ودوامة الحل بقوة عدة مرات خلال فترة الحضانة لإذابة جزيرة الأمير إدوارد بالكامل.
      2. ضبط إلى درجة الحموضة 8 عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من 1N HCl لكل 50 مل.
        تنبيه: HCl هو التآكل. وينبغي التعامل مع HCl المركزة تحت غطاء الدخان. وينبغي للمحققين ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
      3. قم بتجميد محلول PEI عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لساعة واحدة مع غطاء فضفاض وذوبان هُنا بسرعة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لزيادة تعزيز الذوبان. كرر دورة التجميد والذوبان 3x.
      4. تخزين حل الأسهم جزيرة الأمير إدوارد في 0.5 مل aliquots للاستخدام لمرة واحدة في -20 درجة مئوية.
    2. تحويل خلايا C2C12
      1. الجمع بين 25.5 ميكرولتر (8.5 ميكرولتر / ميكروغرام البلازميد الحمض النووي) من محلول مخزون جزيرة الأمير إدوارد مع 100 ميكرولتر من 25 مل NaCl في أنبوب تفاعل 1.5 مل واحتضان لمدة 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية. الجمع بين 3 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد مع 100 ميكرولتر من 25 mM NaCl واحتضان لمدة 5 دقيقة في 37 درجة مئوية.
      2. الجمع بين حجم كامل من كاشف PEI المخفف مع البلازميد المخفف ومزيج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. احتضان لمدة 25 دقيقة في 37 درجة مئوية.
      3. خلال فترة الحضانة، قم بتغيير وسط خلايا C2C12 المخصصة للنقل إلى DMEM دون FBS أو المضادات الحيوية.
      4. أضف مزيج تحويل جزيرة الأمير إدوارد/الحمض النووي إلى خلايا C2C12 التي تسقط عن طريق القطرة وتخلط باستمرار عن طريق تحريك طبق ثقافة الخلية بعناية. احتضان في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية في الغلاف الجويCO2 بنسبة 5٪. بعد 6 ساعة، تغيير المتوسطة لإكمال DMEM.
    3. اختيار بوروماسين
      1. 24 ساعة بعد الترانفسي، قم بالتبديل المتوسط إلى متوسط الاختيار (DMEM كاملة بالإضافة إلى 5 ميكروغرام/مل puromycin). استمر في اختيار البورومايسين حتى يتم الحصول على خلايا C2C12 المقاومة للبورومايسين، والتي عادة ما تستغرق 10-14 يومًا.
      2. توسيع خلايا C2C12 المقاومة للبوروموسين عند كثافة خلايا منخفضة (<50-60%)، أي للحفاظ على الحالة غير المتمايزة والحفاظ على التبريد لـ 6-10 قنينات للتجارب المستقبلية كما هو موضح في الخطوات 2.1.4−2.1.7.
        ملاحظة: الحفاظ على خلايا C2C12 المقاومة للبورومايسين في وجود 5 ميكروغرام/مل بوريوماسين لثقافة الخلايا الروتينية والتوسع. ومع ذلك، تم حذف puromycin في تجارب التمايز.

3. تحليل Phenotypic من التمايز C2C12

ملاحظة: يمكن بسهولة تكييف الأساليب الموضحة أدناه للتحليل العام للفتور C2C12 myoblast التمايز في الأنابيب الأوتريوبية عن طريق تغيير الأجسام المضادة المحددة المستخدمة في النشاف الغربي أو المؤشرات الأولية المحددة للجين المستخدمة في البوليميراز الكمي تحليل تفاعل المتسلسل (qPCR).

  1. C2C12 بروتوكول التمايز والمجهر برايتفيلد
    1. البذور 150،000 الخلايا / جيدا في لوحة 12 جيدا. الخلايا المستقرة C2C12 المقاومة للبوو~اووالستينيين في 12 بئر في وسط الانتقاء في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية فيغلاف جوي من 2% من ثاني أكسيد الكربون. الخلايا C2C12 الثقافة في DMEM كاملة حتى تصل إلى ~ 95٪ التقاء.
    2. للحث على التمايز من خلايا C2C12، استبدال DMEM كاملة مع DMEM خالية من المصل (يوم 0 من التمايز). تغيير المتوسطة كل يومين واتبع تشكيل myotube C2C12 باستخدام مجهر الحقل الساطع المقلوب مع الكاميرا.
      ملاحظة: تستخدم العديد من البروتوكولات مصل الحصان بنسبة 2% للتمييز بين خلايا C2C12 في الأنابيب الأوائية. في أيدي المؤلفين ، وإزالة المصل تماما كان لها تأثير مماثل. يوصف الأنسولين كمادة مضافة إلى وسط ثقافة الخلية لتسريع تمايز C2C12. ومع ذلك، في البروتوكول الحالي، تم تمييز خلايا C2C12 بشكل موثوق في الأنابيب الأوائية في غضون 3-5 أيام بعد حرمان المصل وإضافة الأنسولين.
  2. Myosin سلسلة الثقيلة (MyHC) المناعة لتصور الأنابيب الأوعية
    1. البذور 50،000 الخلايا C2C12 مقاومة البوروميسين لكل غرفة في شريحة غرفة بئر 8 في 500 ميكرولتر من DMEM كاملة. الخلايا الثقافة حتى تصل إلى 95٪ التقاء في DMEM كاملة (حوالي 24 ساعة).
    2. للحث على التمايز، انتقل من DMEM كاملة إلى 500 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل (يوم 0 من التمايز). في النقطة الزمنية المطلوبة (ق)، يستنشق المتوسطة وشطف الخلايا 3x مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية في RT.
    3. إصلاح الخلايا مع 0.2 مل من 4٪ paraformaldehyde (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. شطف الخلايا مع 0.5 مل من PBS 3x لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
      تنبيه: PFA خطرة. اتخاذ الاحتياطات المناسبة والتخلص من محلول البارافورمالديهايد كنفايات خطرة.
    4. إخماد PFA مع 0.2 مل من 0.5 M الجليسين في PBS لمدة 5 دقيقة. شطف الخلايا مع 0.5 مل من PBS 3x لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
    5. الخلايا المحتضنة مع 0.2 مل من 0.1٪ السطحي غير الأيونية / المنظفات(جدول المواد)في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لpermeabilize غشاء الخلية. كتلة مع 0.2 مل من 5٪ الزلال مصل البقر في PBS لمدة 1 ح. شطف الخلايا مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني 3x لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
    6. الخلايا المحتضنة مع 0.2 مل من الأجسام المضادة MyHC (1:200 في برنامج تلفزيوني) لمدة 2 ساعة. شطف الخلايا مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني 3x لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
    7. الخلايا المحتضنة مع 0.2 مل من الماعز المضادة للفأر رودامين الأحمر الاقتران الأجسام المضادة الثانوية (1:200 في برنامج تلفزيوني). شطف الخلايا مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني 3x لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
    8. بعد إزالة برنامج تلفزيوني كميا, إضافة قطرة واحدة من وسط تصاعد تحتوي على 4′,6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) لكل غرفة. Coverslip وعلاج تصاعد المتوسطة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ختم مع طلاء الأظافر.
    9. لاحظ خلايا C2C12 باستخدام مجهر مضان باستخدام مجموعة الفلتر المناسبة.
  3. تقييم كفاءة الضربة القاضية من خلال تفاعل البوليميراز الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)
    1. الخلايا الثقافة C2C12 في ظل ظروف التمايز في 12 لوحات بئر كما هو موضح في القسم 3.1.
    2. في النقطة الزمنية المطلوبة (ق)، وإزالة الوسط التمايز، وشطف الخلايا مرة واحدة مع 1 مل من PBS، وإضافة 0.5 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي(جدول المواد)لكل بئر. الخلايا عن طريق الأنابيب بعناية صعودا وهبوطا ونقل خلية lysate إلى أنبوب تفاعل معقم 1.5 مل. عزل الجيش الملكي النيبالي بعناية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
      تنبيه: يحتوي كاشف استخراج الحمض النووي الريبي RNA على الفينول. وينبغي استخدامه تحت غطاء الدخان. جمع النفايات الكاشف استخراج الحمض النووي الريبي والتخلص من النفايات الخطرة. وينبغي للمحققين ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    3. حل بيليه الحمض النووي الريبي النهائي في 20 ميكرولتر من البيروكربونات الديثيل (DEPC) المياه المعالجة. تحديد كمية ونوعية إعداد الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف ضوئي وتحديد نسبةA 260/A280 كمقياس للجودة.
      ملاحظة: العائد النموذجي من بئر واحد من صفيحة بئر 12 هو 5−7 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي بنسبةA 260/A280 من 1.8−2.
    4. لهضم الحمض النووي الجينومي المشترك المتبقي، تمييع 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في حجم إجمالي قدره 8 ميكرولتر من المياه المعالجة بـ DEPC في أنبوب PCR. إضافة 1 ميكرولتر من 10x العازلة رد الفعل و 1 μL من DNase I (1 وحدة / μL)(جدول المواد)واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. إضافة 1 μL من حل وقف (25 mM EDTA) واحتضان في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    5. لتوليد cDNA، والجمع بين 10 ميكرولتر من DNase تعامل الجيش الملكي النيبالي مع 10 ميكرولتر من 2x المزيج الرئيسي النسخ العكسي، التي تحتوي على النسخة العكسية، التمهيديات العشوائية، 4 mM مزيج dNTP (1 mM كل من dATP، dTTP، dGTP، وdCTP)، وعكس العازلة رد فعل transcriptase. احتضان رد الفعل في cycler باستخدام البرنامج على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. تمييع cDNA بالماء بنسبة 1:5.
    6. لإعداد رد فعل qRT-PCR، الجمع بين 5 ميكرولتر من SYBR الأخضر qPCR مزيج رئيسي مع 0.5 ميكرولتر من الكبريرز إلى الأمام عكس الجينات محددة (الأوراق المالية: 10 μM)، على التوالي، و 2 μL من المياه المعالجة DEPC لكل رد فعل. مازيت qPCR رد فعل في بئر واحد من 96 جيدا qRT-PCR لوحة وإضافة 2 ميكرولتر من cDNA المخفف. إعداد ثلاثة يكرر التقنية لكل تكرار البيولوجية وتشمل الجينات التدبير المنزلي مثل Gapdh أو Hprt1.
    7. تضخيم منتج PCR مع qRT-PCR thermocycler باستخدام البرنامج التالي: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (uracil-DNA glycosylase [UDG] التنشيط)، 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (تنشيط الحمض النووي المزدوج القفل)، 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ث، 60 درجة مئوية لمدة 30 ث، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    8. قياس نتائج qRT-PCR باستخدام طريقة DDCt التي تتم تسويتها إلى جين التدبير المنزلي، مثل Gapdh أو Hprt1.
  4. تقييم كفاءة الضربة القاضية من قبل النشاف الغربي
    1. البذور 300،000 الخلايا C2C12 مقاومة البوروميسين في بئر في لوحة 6 جيدا لتحليل لطخة الغربية. بعد 24 ساعة، تغيير المتوسطة إلى DMEM خالية من المصل لبدء التمايز (يوم 0 من التمايز).
    2. في النقطة الزمنية المطلوبة (النقاط) ، اجمع اثنين من 1 مل من وسط مكيف خال من المصل في أنبوب تفاعل 1.5 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقيقة عند 500 × ز في RT لإزالة الخلايا المنفصلة وحطام الخلايا.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية فقط إذا تم التحقيق في بروتينات ECM أو غيرها من البروتينات السرى في وسط مشروط. إذا كان البروتين ذو الفائدة موضعياً في السيتوبلازم أو مرتبطاً بغشاء، يستنشق وسط ثقافة الخلية ويمضي في خطوات تحليل الخلايا (3.4.7−3.4.12). وينبغي أن يؤديتحلل الخلية بالتوازي مع هطول الأمطار البروتين من وسط مشروط خالية من المصل للحد من تدهور البروتين وغيرها من العواقب غير المقصودة للتخزين لفترات طويلة من طبقة الخلية.
    3. بعد الطرد المركزي، نقل 1 مل من المتوسطة مكيفة في أنبوب رد فعل جديد 1.5 مل والبروتينات راسبي بإضافة 0.391 مل من خليط من حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA) وغير الأيونية السطحي / المنظفات. دوامة لفترة وجيزة الخليط واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد.
      ملاحظة: إعداد خليط هطول الأمطار البروتين مباشرة قبل الاستخدام عن طريق الجمع بين 0.252 مل من 55٪ TCA و 0.139 مل من 1٪ السطحي غير الأيونية / المنظفات لكل مل من المتوسطة المكيفة والدوامة لفترة وجيزة. يصبح الحل عكرًا.
      تنبيه: TCA هو تآكل ويجب التعامل معها بشكل مناسب.
    4. بيليه البروتينات المترسبة في > 16,000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 °C. تجاهل السوبرناستانت.
      تنبيه: يحتوي الـ supernatant على TCA وينبغي جمعه بشكل منفصل والتخلص منه كمواد خطرة.
    5. اغسل كريات البروتين 3x مع الأسيتون البارد والطرد المركزي في كل مرة في أكثر من 16000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    6. الهواء الجاف بيليه البروتين لمدة 3-4 دقيقة في RT وتذوب في 50 ميكرولتر من 1x الصوديوم dodecyl كبريتات البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) عينة عازلة (50 mM تريس درجة الحموضة 6.8، 2٪ SDS، 6٪ الجلسرين، و 0.004٪ بروموفينول الأزرق، تستكمل مع 5٪ α-mercapto اغلي العينة لمدة 5 دقيقة عند درجة حرارة 95 درجة مئوية واستخدمها في النشاف الغربي للكشف عن البروتين المستهدف المطلوب باستخدام الإجراءات القياسية.
      تنبيه: α-Mercaptoethanol هو رائحة وسامة ويجب التعامل معها في غطاء الدخان.
    7. للبروتينات داخل الخلايا والغشاء ملزمة، شطف طبقة الخلية مرة واحدة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
    8. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني وإزاحة الخلايا عن طريق كشط لهم من البئر باستخدام مكشطة الخلية. جمع الخلايا في أنبوب تفاعل 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 3420 × ز لمدة 3 دقيقة عند 4 درجة مئوية. غسل بيليه الخلية 3x مع 1 مل من PBS والطرد المركزي في 3420 × ز لمدة 3 دقيقة في 4 درجة مئوية في كل مرة.
    9. لlyse الخلايا، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 0.2 مل من المخزن المؤقت ليسيس (20 mM تريس-HCl درجة الحموضة 7.5، 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% ديوكسيتشوات الصوديوم, 2.5 mM بيروفوسفات الصوديوم, 1 mM α-glycerophosphate, و 1 MM الصوديوم تقويم الأسنان) تستكمل مع 1x EDTA-خالية من مثبطات المثبط الكاشف واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    10. Ultrasonicate لمدة 15 s على الجليد مع إعداد انتاج الطاقة من 10 في تردد التشغيل من 23 كيلو هرتز.
    11. إزالة حطام الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 13,680 × ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جمع supernatant في أنبوب تفاعل جديد 1.5 مل وتحديد تركيز البروتين باستخدام تحليل برادفورد التجارية أو أي طريقة مناسبة أخرى.
    12. لكل عينة، الجمع بين 100 ميكروغرام من البروتين مع 5x SDS-PAGE عينة المخزن المؤقت في حجم إجمالي قدره 60 ميكرولتر ويغلي لمدة 5 دقيقة في 95 درجة مئوية. تحليل العينات من خلال إجراءات النشاف الغربية القياسية لوجود البروتين المستهدف المطلوب.

النتائج

يمكن اختيار C2C12 المقاوم للبوروميسين في غضون 10-14 يومًا بعد الترانقات بسبب التخلص الفعال من الخلايا غير المقاومة ، أي الخلايا غير المصابة(الشكل 1B). عادة، أكثر من 80٪ من الخلايا تنفصل عن طبق ثقافة الخلية ويتم إزالة هذه الخلايا أثناء الصيانة الروتينية للخلايا. تحتفظ خل?...

Discussion

نحن نصف هنا بروتوكول لضربة قاضية مستقرة من بروتينات ECM في C2C12 myoblasts وتحليل فينوتيبيك للتمايز من C2C12 myoblasts في الأنابيب الأومية. وهناك عدة عوامل تحدد نتيجة التجربة وتحتاج إلى النظر فيها بعناية. الحفاظ على خلايا C2C12 في مرحلة التكاثر هو خطوة حاسمة للحفاظ على خلايا C2C12 في حالة السلائف myoblast. الحفاظ ...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

D.H. بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والأمراض العضلية الهيكلية والجلدية، NIAMS، رقم المنحة AR070748) والتمويل الأولي من قسم ليني وبيتر دبليو مايو لجراحة العظام، كلية إيكان للطب في جبل سيناء.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneFisher Chemical191784
AgarFisher BioreagentsBP1423
AmpicillinFisher BioreagentsBP1760-5
Automated cell counter Countesse IIInvitrogenA27977
Bradford ReagentThermo ScientificP4205987
C2C12 cellsATCCCRL-1772
Chamber slidesInvitrogenC10283
ChloroformFisher Chemical183172
DMEMGIBCO11965-092
DMSOFisher BioreagentsBP231-100
DNase I (Amplification Grade)Invitrogen18068015
Fetal bovine serumVWR97068-085
GAPDHEMD MilliporeMAB374
GlycineVWR Life Sciences19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW)Li-CorC90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red)Jackson Immune Research133389
HClFisher ChemicalA144S
Incubator (Shaker)Denville Scientific Corporation1704N205BC105
MercaptoethanolAmresco, VWR Life Sciences2707C122
Midiprep plasmid extraction kitQiagen12643
Myosin 4 (myosin heavy chain)Invitrogen14-6503-82
Mounting mediumInvitrogen2086310
NaClVWR Life Sciences241
non-ionic surfactant/detergentVWR Life Sciences18D1856500
ParaformaldehydeMP199983
PBSFisher BioreagentsBP399-4
PEIPolysciences23966-1
Penicillin/streptomycin antibioticsGIBCO15140-122
PetridishesCorning353003
Polypropylene tubesFisherbrand149569C
Protease inhibitor cocktail tabletsRoche33576300
PuromycinFisher ScientificBP2956100
PCR (Real Time)Applied Biosystems4359284
Reaction tubesEppendorf22364111
Reverse Transcription Master MixApplied Biosystems4368814
RIPA bufferThermo ScientificTK274910
sh control plasmidSigma-Aldrich07201820MN
sh 3086 plasmidSigma-AldrichTRCN0000092578
sh 972 plasmidSigma-AldrichTRCN0000092579
sh 1977 plasmidSigma-AldrichTRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop)Thermo ScientificNanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master MixApplied Biosystems743566
Trichloroacetic acidAcros Organics30145369
Trizol reagentAmbion254707
Trypan blueGIBCO15250-061
TryptoneFisher BioreagentsBP1421
Trypsin EDTA 0.25%Gibco-Life Technology Corporation2085459
Water (DEPC treated and nuclease free)Fisher Bioreagents186163
Western blotting apparatusBioradMini Protean Tetra Cell
Yeast extractFisher BioreagentsBP1422

References

  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
  3. Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
  4. Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
  5. Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
  6. Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
  7. Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
  8. Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
  9. Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
  10. Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
  11. Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
  12. Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
  13. Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
  14. Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
  15. Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
  16. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  17. Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
  18. Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
  19. Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
  20. Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
  21. Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
  22. Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
  23. Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
  24. Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
  25. Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science's STKE. 2003 (192), 11 (2003).
  26. Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156 ADAMTS ADAMTS C2C12 myoblasts

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved