JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصف هنا هو وسيلة لاستهداف, حذف الجينات markerless في الكلاميديا trachomatis باستخدام الكاسيت floxed الطفرات تبادل أليليس, FLAEM.

Abstract

الكلاميديا التراخورات هو مسببات الأمراض الملزمة داخل الخلايا التي كان من الصعب تاريخيا للتلاعب وراثيا. وقد تم الحد من التقدم النهائي في توضيح الآليات التي تستخدم C. trachomatis لإنشاء والحفاظ على مكانة متميزة داخل الخلايا بسبب نقص الأدوات الوراثية. لحسن الحظ، كانت هناك مؤخرا العديد من التطورات الجديدة في تقنيات التلاعب الجيني. ومن بين هذه هو تطوير الفلورسينسي ذكرت الطفرات تبادل أليليتش (FRAEM). تسمح هذه الطريقة بحذف الجينات المستهدفة إلى جانب إدخال شريط اختيار ترميز مقاومة المضادات الحيوية والبروتين الفلوري الأخضر (GFP). الاعتماد على هذه الاستراتيجية يمكن أن يكون معقدا عند استهداف الجينات داخل operons polycistronic بسبب احتمال الآثار القطبية على الجينات المصب. تم تطوير الطفرات الكاسيت الكاسيت تبادل الطفرات (FLAEM)، البروتوكول الذي يرد وصفه هنا، للتخفيف من الآثار القطبية الناجمة عن كاسيت. FLAEM يستخدم تحرير الجينوم كري-loxP لإزالة كاسيت الاختيار بعد الحذف المستهدف من قبل تبادل أليليتش. تحتوي السلالات الناتجة على حذف جين بدون علامات لتسلسل ترميز واحد أو أكثر. تسهل هذه التقنية التقييم المباشر لوظيفة الجينات وتوسع ذخيرة أدوات التلاعب الجيني في C. trachomatis.

Introduction

الكلاميديا التراخورات هي السبب الرئيسي للأمراض المنقولة جنسيا البكتيرية ويمثل عبئا كبيرا على صحة الإنسان. يصاب أكثر من 100 مليون شخص كل عام بـ C. trachomatis1. ما يقرب من 70٪ من الإصابات في النساء هي أعراض على الرغم من الآثار الضارة الصحة الإنجابية، مثل مرض التهاب الحوض، والحمل خارج الرحم، و / أو العقم. تتمة المرض ترتبط مباشرة بعلم المناعة الذي بدأته عدوى التراخوات C. 2. ولا يزال يتعين استحداث لقاح فعال؛ لذلك ، فإن فهم وظيفة عوامل الفوعة البكتيرية وغيرها من المنتجات الجينية البكتيرية هو سؤال بحثي مهم وعاجل.

كما البكتيريا داخل الخلايا، وغزو الخلايا المضيفة، وتكرار داخل الخلايا، والإفراج عن ذرية، والتهرب من الاستجابات المناعية المضيف هي العمليات الحاسمة. C. التراخوفات يشكل غشاء طفيلي ملزمة vacuole, يطلق عليه إدراج, للتنمية داخل الخلايا. يتم تحقيق إنشاء إدراج والعديد من العمليات الحرجة الأخرى عن طريق إفراز البروتينات effector عبر نظام إفراز النوع الثالث (T3SS)3. كان توضيح وظائف هذه المؤثرات المعسرة محدودًا لسنوات عديدة بسبب الاستعصاء الجيني لـ C. trachomatis. على عكس الإشريكية القولونية، فإن العديد من تقنيات الاستنساخ الكلاسيكية لا تنطبق على الكلاميديا. وهناك عدد قليل من القيود الرئيسية التي تنطوي على كفاءة التحول، وعدم وجود مراسلين للاختيار المضاد مثل sacB، وصيانة البلازميد. في حين يمكن الحفاظ على البلازميدات E. coli بشكل عام إلى أجل غير مسمى مع أصل النسخ المتماثل والضغط الانتقائي المناسب ، يتطلب C. trachomatis plasmids ثمانية إطارات قراءة مفتوحة إضافية(pgp1-8) للصيانة التي تم العثور عليها على البلازميد pL2 الأصلي داخل L2 serovar4.

في السنوات الأخيرة كانت هناك العديد من الأدوات الوراثية التي تم إنشاؤها التي تستوعب علم الأحياء الكلاميديا فريدة من نوعها، ومع ذلك لا تزال هناك قيود5،6،7. يمكن أن يؤدي الطفرات الكيميائية عن طريق علاج الميثانسولفونات (EMS) إيثيل التحولات الخاطئة ، أو (أقل تواترا) إلى التحولات النيوكليوتيدإدخال codon وقف سابق لأوانه لتسفر عن طفرة هراء8. الإدراج Transposon هو فعال لتعطيل الجينات، ولكن التكنولوجيا الحالية في أبحاث الكلاميديا شاقة وتستغرق وقتا طويلا9. كل من العلاج EMS وتقنيات الطفرات المتحولة تولد تولد الطفرات العشوائية وتتطلب أساليب فحص صارمة لعزل سلالات متحولة. طريقة لتعطيل الجينات عن طريق إدخال الإنترونات المجموعة الثانية (على سبيل المثال، TargeTron) يسمح لmutagenesis موجهة; ومع ذلك، يتم تقييد هذه الطريقة بالكفاءة، ولا يتم التنبؤ دائمًا بموقع الإدراج بشكل صحيح10.

الفلورسينس ذكرت الطفرات تبادل أليليسيك (FRAEM) هي استراتيجية تستخدم لحذف الجينات المستهدفة إلى جانب إدخال كاسيت الاختيار توفير مقاومة المضادات الحيوية ومراسل الفلورسينس11. ومع ذلك ، فإن FRAEM معقد بسبب احتمال الآثار القطبية الناجمة عن الكاسيت على الجينات المصب ، خاصة عند استهداف الجينات داخل operons المتعددة الأقطاب. Floxed كاسيت allelic تبادل الطفرات (FLAEM) هو نهج وراثي جديد وضعت للتخفيف من الآثار القطبية الناجمة عن كاسيت لوحظ سابقا مع كاسيت اختيار FRAEM12. FLAEM يستخدم تحرير الجينوم كري-loxP لإزالة كاسيت الاختيار واستعادة التعبير عن الجينات المصب. يتم إعادة تصميم كاسيت الاختيار الذي يحتوي على مقاومة المضادات الحيوية والبروتين الفلوري الأخضر (GFP) مع مواقع لوكسب المحيطة. يمكن لهذه المواقع loxP إعادة الجمع في وجود الكري recombinase ويؤدي إلى استئصال كاسيت من الجينوم13. وقد ثبت أن هذه الاستراتيجية للتخفيف من الآثار القطبية الناجمة عن كاسيت عند استهداف tmeA للحذف12،14.

تستخدم كل من أساليب FRAEM و FLAEM نفس ناقل الانتحار ، pSUmC 4.0 ، والذي يمكن الحفاظ عليه بشكل مشروط من خلال التعبير غير القابل للاختزال لـ pgp6. وقد سبق التعبير عن pgp6 ثبت أن تكون ضرورية للاحتفاظ بلازميد، وبالتالي يتم الاستفادة للسيطرة على صيانة البلازميد11،15. عندما يتم زراعة C. trachomatis في وسائل الإعلام تستكمل مع التتراسيكلين اللامائية (aTc) للحث على التعبير pgp6، يتم الحفاظ على ناقلات. في حالة عدم وجود aTc، يتم فقدان المتجه. يتم تحقيق حذف الجينات المستهدفة من خلال التبادل الآلي للجين لكاسيت الاختيار. 3 كيلوبايت المناطق مباشرة المنبع والمصب من الجين المستهدف بمثابة الأسلحة homology لإعادة التركيب. يتم استنساخ هذه الأسلحة في pSUmC 4.0 ناقلات تحيط كاسيت الاختيار. ويلاحظ نجاح C. التحول القصبة الهوائية والأحداث إعادة التركيب من خلال الإبلاغ عن الفلورسينس. التعبير عن mCherry على العمود الفقري للمتجه وgfp داخل كاسيت الاختيار تسفر عن إدراجات الفلورسنت الحمراء والخضراء. بمجرد إزالة aTc من وسائط الثقافة ، تشير التضمينات الخضراء فقط إلى أحداث إعادة التركيب الناجحة مع فقدان ناقل الانتحار ودمج كاسيت الاختيار في الجينوم البكتيري.

FLAEM يمثل امتدادا لFRAEM عن طريق التحول اللاحق لناقلات الكري المؤافر ة ، pSU - Cre ، في سلالة متحولة تم إنشاؤها حديثا. Cre recombinase يسهل إعادة التركيب بين مواقع loxP واستئصال كاسيت الاختيار. تتم الإشارة إلى أحداث إعادة التركيب من خلال الإبلاغ عن الفلورسينس. ناقلات PSU-Cre ترميز mCherry; وبالتالي ، يشار إلى التحول الناجح من خلال إضافة الفلورية الحمراء إلى gfp- التعبير عن التضمينات. الزراعة في غياب ضغط انتقائي للكاسيت النتائج في Rere بوساطة إعادة التركيب في مواقع loxP، ويشار إلى فقدان الكاسيت من خلال إدراجات حمراء فقط. كما هو الحال مع pSUmC-4.0، يتم استخدام التعبير غير القابل للاختزال من pgp6 للحفاظ على PSU-Cre بشكل مشروط. مرة واحدة تتم إزالة aTc واختيار المضادات الحيوية، يتم علاج البلازميد، وسلالة الحذف علامة الناتجة غير الفلورسنت. وتتناول هذه الطريقة مسألة الآثار القطبية الناجمة عن الكاسيت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تصميم وتجميع pSUmC-4.0 مع الأسلحة Homology محددة لجين الفائدة

  1. تحديد ~ 3 كيلوبايت المناطق مباشرة المنبع والمصب من الجين المستهدفة للحذف لتكون بمثابة 5 'و 3' 'الأسلحة homology لإعادة تركيب متجانسة(الشكل 1).
  2. تصميم التمهيديPCR إلى 1) تضخيم ذراع 3 كيلوبايت 5 'homology من الحمض النووي الجينومي chlamydial و 2) تحتوي على 15-30 BP فوق محددة لpSUmC-4.0 عندما هضمها في موقع انزيم تقييد سال. تأكد من أن المناطق التمهيدية المتداخلة مع pSUmC-4.0 لديها درجات حرارة ذوبان 55 درجة مئوية وأن درجات حرارة ذوبان دبوس الشعر للالتمهيدي بأكمله هي < 35 درجة مئوية.
  3. تصميم التمهيديPCR إلى 1) تضخيم ذراع 3 كيلوبايت 'homology من الحمض النووي الجينومي chlamydial و 2) تحتوي على 15-30 BP العبء محددة لpSUmC-4.0 عندما هضمها في موقع انزيم تقييد SbfI. تأكد من أن المناطق التمهيدية المتداخلة مع pSUmC-4.0 لديها درجات حرارة ذوبان 55 درجة مئوية وأن درجات حرارة ذوبان دبوس الشعر للالتمهيدي بأكمله هي < 35 درجة مئوية.
  4. تصميم التمهيديات فحص PCR من شأنها تضخيم إدراج كل ذراع homology في ناقلات pSUmC-4.0 بعد تفاعل تجميع الحمض النووي16. تصميم هذه التمهيديات إلى الصلب ~ 500 bp خارج مواقع تقييد للسماح بالتصور السهل للمنتج PCR حتى لو كان الإدراج غير ناجحة(الشكل 1).
  5. تضخيم 3 كيلوبايت 5 'و 3' 'الأسلحة homology من الحمض النووي الجينومي الكلاميديا المستخرجة حديثا من قبل PCR في واحد إلى اثنين من ردود الفعل لتسفر عن ما يكفي من جزء لتجميع الحمض النووي في وقت لاحق. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للحمض النووي البوليميراز لإعداد رد فعل معين وظروف ركوب الدراجات.
  6. تحقق من أن كلا من منتجات PCR هي الحجم الصحيح وأن ردود الفعل لا تحتوي على أي نطاقات ملوثة. تشغيل 5 ميكرولتر من كل تفاعل PCR على 1٪ هلام أكروس الحمض النووي.
  7. تنقية وتركيز شظايا PCR عن طريق استخراج الفينول / الكلوروفورم وهطول الإيثانول.
    1. تجمع جميع ردود فعل PCR 3 'معا في أنبوب 1.5 مل وتقديمهم إلى حجم نهائي من 200 ميكرولتر مع H2O. nuclease خالية من تكرار هذه العملية لردود فعل PCR 5'.
    2. أضف 200 ميكرولتر من الفينول إلى كل أنبوب ودوامة لمدة 30-60 s. قم بتدوير كل أنبوب في جهاز طرد مركزي صغير عند أكثر من 21,000 × ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. نقل الطبقة العليا المرحلة المائية من كل أنبوب في أنبوب جديد 1.5 مل، إضافة عشر حجم خلات الصوديوم M 3 إلى كل أنبوب، ثم نفض الغبار لخلط.
    4. إضافة 3 مجلدات من الإيثانول 100٪ إلى كل أنبوب ونفض الغبار لخلط. احتضان كلا الأنابيب في -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    5. بيليه الحمض النووي عن طريق الغزل كل أنبوب في > 21,000 × ز لمدة 5 دقيقة في RT. تجاهل supernatant.
    6. غسل بيليه الحمض النووي مع 100 ميكرولتر من الإيثانول 70٪. تدور كل أنبوب في > 21,000 × ز لمدة 5 دقيقة في RT. تجاهل supernatant.
    7. غسل بيليه الحمض النووي مرة أخرى مع 100 ميكرولتر من الإيثانول 100٪. تدور كل أنبوب في أكثر من 21،000 لمدة 5 دقيقة في RT. تجاهل supernatant.
    8. اسمحوا بيليه تماما الهواء الجاف، ثم إعادة تعليق بلطف الحمض النووي في 12 ميكرولتر من H2O خالية من nuclease عن طريق الخفقان لخلط.
  8. هضم 500 نانوغرام من ناقلات pSUmC-4.0 في رد فعل 20 ميكرولتر مع وحدة واحدة من سال و1 وحدة من SbfI وفقا لبروتوكول التصنيع. احتضان رد الفعل لمدة 3 ساعات تقريبًا أو بين عشية وضحاها لضمان الهضم الكامل للمتجه.
  9. تنقية وتركيز العمود الفقري المهضوم عن طريق استخراج الفينول/ الكلوروفورم وترسيب الإيثانول كما هو موضح في وقت سابق (الخطوة 1.7.1-1.7.9).
  10. الجمع بين pSUmC هضم-4.0 ناقلات وكلا 5 'و 3' 'هومولوجيا ذراع PCR المنتجات معا بنسبة 0.01 pmol pSUmC-4.0 إلى 0.09 pmol كل ذراع homology. تجميع شظايا في رد فعل تجميع الحمض النووي وفقا لبروتوكول التصنيع.
  11. تحويل 50 ميكرولتر من الإشريكية القولونية مع 1 ميكرولتر من تفاعل تجميع الحمض النووي. لوحة تحويل E. القولونية على لوحات LB أغار التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل spectinomycin عن طريق نشر 150 ميكرولتر لكل لوحة. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  12. في اليوم التالي، شاشة المستعمرات للفلورية الخضراء والحمراء باستخدام المجهر المقلوب المقلوب. ومن المتوقع ما مجموعه 5-30 مستعمرات لكل لوحة أغار.
  13. اختيار 5-10 مستعمرات لتلقيح 4 مل من مرق LB تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل spectinomycin. الثقافات احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة.
  14. باستخدام الثقافات بين عشية وضحاها E. القولونية، وإجراء تنقية الحمض النووي على نطاق صغير. Elute الحمض النووي مع 50 ميكرولتر من nuclease خالية H2O.
  15. تأكد من إدخال كل ذراع من ذراع الهومسولوجيا في متجه pSUmC-4.0 باستخدام أجهزة فحص PCR التمهيدية (المصممة في الخطوة 1.4) لتضخيم كل إدراج. إذا كان تجميع الحمض النووي ناجحا، ينبغي ملاحظة منتج PCR ~ 4 كيلوبايت في هلام أغاروز الحمض النووي 1٪ لكل من 5 'و 3' مناطق الذراع. يشير منتج PCR 1 كيلوبايت ~ إلى عدم وجود إدراج.
    ملاحظة: إذا كان الإدراج من الأسلحة homology غير ناجحة في تفاعل التجمع جزء مزدوج، أداء اثنين من ردود الفعل الجمعية لإدراج الذراع 5 'ثم 3' الذراع، بشكل فردي. هضم ناقلات مع سال فقط قبل تجميع مع ذراع 5 '، ثم هضم ناقلات مع SbfI لتجميع الذراع 3'.
  16. تحويل السد-/ dcm- المختصة E. القولونية مع 200 نانوغرام من pSUmc-4.0 تجميعها مع كل من الأسلحة homology. لوحة البكتيريا المحولة على لوحات LB أغار التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل spectinomycin عن طريق نشر 25 ميكرولتر لكل لوحة. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ومن المتوقع أن يصل إجمالي المستعمرات إلى 200 مستعمرة.
  17. فحص لوحات لمستعمرات الفلورسنت الحمراء والخضراء كما هو موضح في الخطوة 1.13.
  18. إعداد ثقافة لتنقية الحمض النووي على نطاق واسع عن طريق تلقيح 100 مل من مرق LB يحتوي على 100 ميكروغرام / مل spectinomycin مع المستعمرات الحمراء والخضراء. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة.
  19. حصاد الثقافة وتنقية الحمض النووي باستخدام تنقية الحمض النووي على نطاق واسع.
    1. إعادة تعليق الحمض النووي البلازميد المنقى في 100 ميكرولتر من NF-H2O. العائد الكلي للحمض النووي من 2 μg/μL على الأقل مثالية للتحول C. trachomatis.
    2. تسلسل 5 'و 3' مناطق الذراع homology لضمان التجميع الصحيح في pSUmC-4.0 قبل تحويل C. trachomatis.

2. تحويل C. trachomatis مع pSUmC 4.0 + الأسلحة الهومنتي لحذف الجينات من قبل بورصة أليليتش

  1. البذور ماكوي الخلايا، الخلايا الليفية الماوس تستخدم على مستوى لزراعة الكلاميديا،في اثنين من لوحات بئر 6 (1 × 106 خلايا/ جيد) مع #1 وسائل الإعلام النمو. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى أحادية هو confluent (حوالي 24 ساعة).
  2. في أنبوب 1.5 مل، إضافة حجم C. trachomatis WT serovar L2 الهيئات الابتدائية (EBs) التي تكفي لإصابة 12 بئرا من لوحة بئر 6 في وزارة الداخلية من 2. بيليه EBs في أكثر من 20،000 × ز لمدة 30 دقيقة ، ثم تجاهل supernatant.
  3. بدء تحويل الكلاميديا عن طريق إعادة تعليق EBs بلطف في 600 ميكرولتر من CaCl2 المخزن المؤقت، ومن ثم إضافة 24 ميكروغرام من pSUmC-4.0 + الأسلحة homology إلى الأنبوب. مزيج بلطف الحل عن طريق الخفقان. احتضان أنبوب في RTfor 30 دقيقة ونفض الغبار لخلط كل 10 دقيقة.
  4. أضف حل التحويل إلى 24 مل من محلول الملح المتوازن لهانكس (HBSS) واخلطه عن طريق الأنابيب بلطف. نقل 2 مل من inoculum إلى كل بئر من خلايا مكوي confluent في لوحات الآبار 6 وتصيب عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز ل1 ساعة في 20 درجة مئوية.
  5. إزالة التلقيح واستبدال مع 2 مل / حسنا وسائل الإعلام نمو RPMI #2. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  6. بعد ما لا يقل عن 7 ح، ولكن لا يزيد عن 12 ساعة، واستبدال وسائل الإعلام مع 2 مل / جيدا من وسائل الإعلام الاختيار #1. مواصلة الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة من وقت العدوى.
  7. حصاد وتمرير البكتيريا على طبقة أحادية جديدة من خلايا مكوي.
    1. باستخدام مكشطة الخلايا، كشط بلطف أحادية McCoy لرفع الخلايا في وسائل الإعلام. نقل المواد من كل بئر إلى أنبوب 2 مل. بيليه المواد الخلية في أكثر من 20،000 × ز في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    2. إزالة وتجاهل supernatant. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من HBSS عن طريق الأنابيب بلطف.
    3. بيليه حطام الخلية في 200 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية. نقل supernatant على بئر جديدة من خلايا مكوي مكوي confluent. إضافة 1 مل إضافية من HBSS إلى كل بئر لحجم إجمالي قدره 2 مل / جيد.
    4. تصيب عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز ل1 ساعة في 20 درجة مئوية. استبدال التلقيح مع وسائل الإعلام الاختيار #1 مباشرة بعد العدوى.
  8. مواصلة تمرير البكتيريا على طبقة أحادية جديدة من خلايا مكوي (القسم 2.7) كل 48 ساعة لمدة ثلاثة أو أكثر من الممرات حتى يتم الكشف عن التضمينات الحمراء والخضراء باستخدام المجهر المقلوب 24 ساعة بعد العدوى (24 حصان).
  9. بمجرد الكشف عن التضمينات الحمراء والخضراء، استمر في تمرير الطبقة الأحادية (القسم 2.7) باستخدام وسائط التحديد #2.
  10. مواصلة تمرير طبقة أحادية حتى يتم الكشف عن الماشتمات الخضراء فقط 24 حصان يُذكر (#3 مرور أو أحدث)، مما يشير إلى فقدان ناقل pSUmC-4.0 ودمج كاسيت اختيار loxP في الجينوم.
  11. اختر بئرًا واحدًا من التضمينات الخضراء فقط للإثراء عن طريق التشيخ. حصاد وتجميد أي آبار أخرى تحتوي أيضًا على تضمينات خضراء فقط في المخزن المؤقت للسكروز والفوسفات والغلوتامات (SPG).
    1. لإثراء إدراج ات خضراء فقط، وتمرير أحادية من بئر واحد من لوحة 6 جيدا كما فعلت في الخطوة 2.7، ولكن بعد الكريات حطام الخلية (الخطوة 2.7.3)، نقل supernatant إلى مخروطية مع 12 مل من HBSS. استخدام هذا التلقيح لتصيب اثنين من 6 لوحات جيدا عن طريق إضافة 2 مل لكل بئر، ثم تدور لوحات في 900 × ز لمدة 60 دقيقة في 20 درجة مئوية.
    2. لتجميد آبار إضافية، حصاد طبقة أحادية كما هو الحال في الخطوة 2.7.1، ولكن إعادة تعليق الكريات في 1 مل من SPG بدلا من HBSS. بيليه حطام الخلية (الخطوة 2.7.3) ونقل supernatant إلى أنبوب التبريد 1.5 مل. تجميد المواد في -80 درجة مئوية.
  12. بعد إثراء التضمينات الخضراء فقط إلى وزارة الداخلية من 0.5-1.0 (واحد إلى اثنين من الممرات بعد الكشف)، حصاد الطبقات الأحادية في SPG كما هو موضح في الخطوة 2.11.2. الحصول على aliquots من 50 ميكرولتر في أنابيب 1.5 مل وتجميد في -80 درجة مئوية.
  13. تتر البكتيريا الخضراء فقط لتحديد إدراج، وتشكيل وحدات / μL، وفقا لبروتوكول المعايرة القياسية17.

3. Clonal عزل الأخضر فقط C. trachomatis حذف متحولة تحتوي على شريط الاختيار مع لفس ب من خلال الحد من تخفيف

  1. البذور لوحة 384 نسيج الأنسجة مع 50 ميكرولتر من خلايا مكوي في ~ 2000 خلية / بشكل جيد في #1 وسائل الإعلام النمو. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2 ل ~ 24 ساعة أو حتى confluent.
  2. تمييع a aliquot من البكتيريا الخضراء فقط في HBSS لتحقيق ~ 50 EBs لكل 20 مل. نقل التلقيح المخفف إلى صينية خزان.
    1. إزالة وسائل الإعلام من لوحة بئر 384 عن طريق نفض الغبار بحزم لوحة كاملة رأسا على عقب في حاوية النفايات. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 50 ميكرولتر من C. الميكوكولم القصبة الهوائية إلى كل بئر. تصيب عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز ل1 ساعة في 20 درجة مئوية.
      ملاحظة: ضع في اعتبارك عدم النقر بقوة بحيث ينفصل أحادي الطبقة. إذا كانت الخلايا أكثر من متشنج، فإنها سوف تنفصل بسهولة أكبر.
  3. إزالة التلقيح عن طريق الخفقان واستبدالها مع 50 ميكرولتر / جيد وسائل الإعلام النمو #2. لوحات احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يكون دمج كاسيت الاختيار في الجينوم مستقرًا ، لذلك لم يعد هناك حاجة إلى اختيار المضادات الحيوية مع spectinomycin.
  4. بعد احتضان اللوحة لمدة 5-12 يومًا ، حدد الآبار الفردية مع إدراجات فلورية خضراء باستخدام مجهر مقلوب أو منصة فحص عالية المحتوى.
  5. حصاد الآبار مع إدراج الأخضر فقط عن طريق كشط أحاديالطبقة مع تلميح ف 10 ونقل محتويات كاملة من البئر إلى أنبوب يحتوي على 2 مل من HBSS. مزيج بلطف وتطبيق 2 مل من الانينوكولوم إلى أحادية مكوي مكوي جديدة في لوحة 6 جيدا للعدوى.
    ملاحظة: عند تحديد الآبار الفردية مع التضمينات، ستكون التضمينات في مجموعة بسبب التوسع من التضمين الأولي. إذا كان البئر يحتوي على مجموعات متعددة ، فمن المحتمل أن أكثر من EB واحد أصاب في البداية ذلك بشكل جيد. ولا ينبغي حصاد هذه الآبار، وفي بعض الحالات، قد يكون من الضروري إجراء جولات متعددة من العزلة الكلونية عن طريق التخفيف المتسلسل.
  6. تصيب لوحة بئر 6 عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز ل1 ساعة في 20 درجة مئوية. استبدال التلقيح مع 2 مل / جيدا #2 وسائل الإعلام النمو. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
  7. كرر الخطوات 2.11-2.13 لإثراء وتجميد وtiter clonal السكان.
  8. تأكيد حذف الجينات المستهدفة من clonally معزولة C. trachomatis باستخدام qPCR كما سبق وصفه12.

4. تحويل C. trachomatis FRAEM متحولة مع PSU-Cre لبدء إزالة شريط الاختيار المعتمس

  1. كرر عملية التحويل في لوحة بئر 6 كما هو موضح سابقًا (الخطوات 2.1-2.8) باستخدام C. trachomatis FRAEM المتحولة ، متجه PSU-Cre ، ووسائط التحديد #3.
    ملاحظة: تتم الإشارة إلى تحويل ناجح بواسطة التضمينات التي هي الفلورسنت الأحمر والأخضر.
    1. تمرير طبقة أحادية حتى يتم الكشف عن إدراجات الأحمر فقط باستخدام المجهر المقلوب المقلوب، مما يشير إلى فقدان كاسيت الاختيار (مقطعين إلى ثلاثة مقاطع). مواصلة تمرير طبقة أحادية حتى يتم إثراء التضمينات الحمراء فقط إلى وزارة الداخلية من ~ 0.5.
  2. Clonally عزل إدراجات الأحمر فقط عن طريق الحد من التخفيف في لوحة 384 جيدا كما هو موضح سابقا (الخطوات 3.1-3.8)؛ ومع ذلك، استخدم وسائط التحديد #3 لكافة الخطوات.
  3. إثراء السكان clonal عن طريق تمرير حتى وزارة الداخلية من 0.1. وبمجرد إثرائها، استبدل وسائط القسم بوسائط النمو #2 لبدء فقدان متجه PSU-Cre (حوالي ثلاثة إلى أربعة مقاطع).
  4. Clonally عزل البكتيريا غير الفلورية (الخطوات 3.1-3.8); ومع ذلك، يدويا مسح لوحة مع المجهر brightfield للكشف عن التضمينات. إثراء وتجميد البكتيريا (الخطوة 2.11-2.12).
  5. شاشة لسلالة متحولة باستخدام كمية في الوقت الحقيقي PCR، النشاف الغربي، وتسلسل الحمض النووي الجينوم كله كما وصفت سابقا12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تعتمد طريقة حذف الجينات بدون علامات في C. trachomatis باستخدام FLAEM على تقنيات الاستنساخ والتحول المتأنية. إعادة تركيب أليليتش ناجحة هي خطوة أولى أساسية ويتطلب تحديد وإدراج الأسلحة homology في ناقلات الاستنساخ pSUmC-4.0(الشكل 1). الخطوة الثانية الأساسية لحذف الجينات markerless هو إزالة م?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

البروتوكول الموصوف هنا لتوليد حذف الجينات بدون علامات في C. trachomatis من قبل FLAEM يسمح الحذف المستهدف للجينات غير الأساسية ويزيل الآثار القطبية الناجمة عن الكاسيت. يعتمد البروتوكول على التصميم الدقيق لأذرع الهومنولوجيا 5 'و 3' التي تم إدخالها في ناقل الانتحار pSUmC 4.0 ، والتحول الفعال لـ C. tra...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح خدمات الصحة العامة من المعهد الوطني للصحة ، NIAID (المنح A1065530 و Al124649) ، إلى حقول ك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseKSE ScientificBMK-A1705Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochlorideACROS Organics233131000
CaCl2 Buffer10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride DihydrateSigmaC7902-500GSuitable for cell culture
CycloheximideSigma7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coliNew England BioLabsC2925H
DMSOATCC4-XSterile filtered cell culture tested
Glutamic acidSigmaG8415-100GL-Glutamic acid
Growth Media #1RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x)Gibco24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS)GibcoA38402-02
McCoy CellsATCCCRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BioLabsT1010SSmall scale DNA purification
NaH2PO4SigmaS3139-250GSodium phosphate monobasic
Na2HPO4SigmaS5136-500GSodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli CellsNew England BioLabsC3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning KitNew England BioLabsE5520SGibson Assembly Kit
Penicillin G sodium saltSigmaP3032-10MUBioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12162Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabsM0515Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x)Gibco11875-093Containing 2mM L-glutamine
Sall-HFNew England BioLabsR3138S
Sbfl-HFNew England BioLabsR3642S
Selection Media #1RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer SolutionSigmaS7899-100ML3M
SOC Outgrowth MediumNew England BioLabsB9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture GradeAlfa AesarJ61820
SucroseSigmaS1888-1KGBioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG)37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
TrisAMRESCO0497-5KGUltrapure grade
Trypsin-EDTA (1x)Gibco25200-0560.25%
WaterSigmaW3500-500MLSterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

References

  1. World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
  2. Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
  4. Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239(2009).
  5. Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
  6. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
  7. Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
  8. Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
  9. LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343(2019).
  10. Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989(2013).
  11. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817(2016).
  12. Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479(2018).
  13. Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
  14. McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640(2017).
  15. Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
  16. Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
  17. Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  18. Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142(2013).
  19. Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155 recombinase FLAEM FRAEM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved