JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف هنا طريقة لنمو السيلان Neisseria في المتوسط السائل المقيد بالمعادن لتسهيل التعبير عن الجينات للحصول على المعادن. كما نحدد تجارب المصب لتوصيف النمط الظاهري لـ "الـ"أنوسكوات" التي تزرع في هذه الظروف. ويمكن تكييف هذه الأساليب لتكون مناسبة لتوصيف الجينات المتجاوبة مع المعادن في البكتيريا الأخرى.

Abstract

المعادن النزرة مثل الحديد والزنك هي العناصر الغذائية الحيوية المعروفة للعب أدوار رئيسية في العمليات prokaryotic بما في ذلك تنظيم الجينات، والحفز، وبنية البروتين. عزل المعادن من قبل المضيفين غالبا ما يؤدي إلى قيود معدنية للبكتيريا. هذا القيد يحفز التعبير الجيني البكتيري الذي تسمح منتجات البروتين للبكتيريا بالتغلب على بيئتها المحدودة بالمعادن. وتوصيف هذه الجينات أمر صعب. يجب أن تزرع البكتيريا في وسائل الإعلام المعدة بدقة التي تسمح بالوصول الكافي إلى المعادن الغذائية للسماح بنمو البكتيريا مع الحفاظ على التشكيل الجانبي المعدني مما يؤدي إلى تحقيق التعبير عن الجينات المذكورة أعلاه. وعلى هذا النحو، يجب إقامة توازن دقيق لتركيزات هذه المعادن. نمو كائن سريع التغذية مثل السيلان Neisseria، الذي تطور للبقاء على قيد الحياة فقط في المضيف البشري ، يضيف مستوى إضافي من التعقيد. هنا ، نصف إعداد متوسط محدد محدود بالمعادن يكفي للسماح بنمو المكورات الغونوكولية والتعبير الجيني المطلوب. تسمح هذه الطريقة للمحقق برش الحديد والزنك من مصادر غير مرغوب فيها مع استكمال وسائل الإعلام بمصادر محددة من الحديد أو الزنك ، والتي يتم وصف إعدادها أيضًا. وأخيراً، نحدد ثلاث تجارب تستخدم هذه الوسائط للمساعدة في توصيف منتجات البروتين للجينات المكورات الغونية المنظمة بالمعادن.

Introduction

النيسيريا السيلان يسبب السيلان العدوى الشائعة التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي. أثناء العدوى ، تعبر Neisseria المسببة للأمراض عن ذخيرة من الجينات المتجاوبة مع المعادن التي تسمح للبكتيريا بالتغلب على جهود تقييد المعادن من قبل المضيف البشري1،2،3. المعادن النزرة مثل الحديد والزنك تلعب أدوارا رئيسية في العديد من العمليات الخلوية، مثل ربط الإنزيمات في المواقع الحفازة، والمشاركة في ردود فعل الأكسدة، والعوامل الهيكلية في مختلف البروتينات4،5. في ظروف محدودة المعدن، يتم إلغاء قمع loci المتجاوبة مع المعادن ويمكن أن تساعد البروتينات الناتجة عن ذلك في الحصول على هذه العناصر الغذائية. ويمثل توصيف هذه الجينات والبروتينات تحديا تقنيا فريدا للمحقق. يجب حجب الأيونات المعدنية عن البكتيريا من أجل الحث على نسخ هذه الجينات من loci الأصلية ، ولكن يمكن أن يكون من الصعب تحسين الاستخلاب الفعال لهذه الأيونات من الوسائط المحملة بالمعادن. الملامح المعدنية المختلفة من مصدر المياه ومتأصلة الكثير إلى الكثير الاختلاف6 من المكونات مسحوق يعني أن كمية من chelator المطلوبة لإزالة معدن معين من وسط غني سوف تختلف بين مواقع مختلفة، وبائعي المكونات، وحتى مع مرور الوقت داخل مختبر واحد كما يتم استبدال المخزون الكيميائي.

للتحايل على هذا التحدي، ونحن نصف إعداد وسيلة محددة التي يتم التعامل مع Chelex-100 الراتنج أثناء التحضير لإزالة المعادن النزرة من الحل. هذه الوسيلة كثيفة المغذيات بما فيه الكفاية للسماح لنمو المكورات البنية ، والتي يصعب الاستزراع خارج المضيف البشري ، وتتيح للمحقق إدخال ملف معدني محدد بإضافة مصادرها المحددة وتركيزاتها الخاصة المعادن. وتزيد طريقة إضافة المعادن المطلوبة إلى المتوسطة المستنفدة من الاتساق التجريبي وتسمح بإجراء تجارب قوية وقابلة للتكرار بغض النظر عن عوامل مثل مصدر المياه وأرقام اللوت الكيميائية. وعلاوة على ذلك، يمكن نشر هذه الوسائط إما سائلة أو صلبة مع تعديلات طفيفة فقط، مما يجعلها متعددة الاستخدامات.

من أجل إظهار فائدة هذه الوسيلة ، نحدد بروتوكولًا لاستخدامه في نمو المكورات الغونوكولية ووصف ثلاث تجارب ناجحة لتوصيف جينات Neisseria المتجاوبة مع المعادن. أولاً، نقوم بإعداد الخلايا الغونوكولية الكاملة من الثقافات المستنفدة للمعادن أو المكملة ونظهر مستويات متغيرة من إنتاج البروتين من loci المستجيبة للمعادن. ثم نحدد مخطط النمو المقيد بالزنك حيث يتم التحكم في نمو المكورات الغونوكولية عن طريق مكملات مصادر الزنك المحددة القابلة للاستخدام. وأخيراً، نعرض الاختبارات الملزمة التي توضح الخلايا المكورات الغونية الكاملة التي تعبر عن مستقبلات سطحية مستجيبة للمعادن ملزمة للليغاندات المحتوية على المعادن الخاصة بها. عرض سطح ناجح من هذه المستقبلات يتطلب النمو في المتوسطة المستنفدة للمعادن.

تم تحسين البروتوكول الحالي خصيصًا لـ Neisseria السيلان، ولكن العديد من مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى تستخدم استراتيجيات اقتناء المعادن أثناء العدوى7، لذلك يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة التوازن المعدني في البكتيريا الأخرى. من المرجح أن يتطلب تحسين هذه الوسائط وهذه البروتوكولات التجريبية للاستخدام في البكتيريا الأخرى تعديلًا طفيفًا لتركيزات chelator المعدنية و / أو وقت المعالجة مع Chelex-100 ، حيث قد يكون للبكتيريا الأخرى متطلبات معدنية مختلفة قليلاً عن المكورات الأنوكولوسية. الحديد والزنك هي المعادن الرئيسية التي تثير القلق بالنسبة للتحقيقات الموصوفة ، ولكن المعادن الأخرى (مثل المنغنيز) أثبتت أنها حاسمة للبكتيريا ، بما في ذلك Neisseria8،9،10،11،12. وعلاوة على ذلك، تم وصف أساليب مماثلة لتوصيف المعادن في العمل زراعة الخلايا eukaryotic، والتي يمكن أيضا النظر فيها. 13

Protocol

1. إعداد حلول الأسهم المتوسطة المحددة (CDM) التي تعامل Chelex

  1. حل الأسهم الأول
    1. الجمع بين NaCl (233.8 غرام)، K2SO4 (40.0 غرام)، NH4Cl (8.8 غرام)، K2HPO4 (13.9 غرام)، وKH2PO4 (10.9 غرام) في الماء المؤين إلى حجم نهائي من 1 L.
    2. تصفية تعقيم الحل وaliquot في أنابيب مخروطية 50 مل.
    3. تخزين في -20 درجة مئوية.
  2. حل الأسهم الثاني
    1. الجمع بين الثيامين HCl (0.2 غرام)، الثيامين بيروفوسفات-Cl (0.05 غرام)، بانتوثينات الكالسيوم (0.19 غرام)، والبيوتين (0.3 غرام) في 50٪ (فول/فول) الإيثانول إلى حجم نهائي من 1 لتر.
    2. Aliquot في 50 مل أنابيب مخروطية وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. حل الأسهم الثالث
    1. الجمع بين L-أسبارتات (4.0 غرام)، L-الغلوتامات (10.4 غرام)، L-أرجينين (1.2 غرام)، الجليسين (0.2 غرام)، L-serine (0.4 غرام)، L-leucine (0.72 غرام) L-isoleucine (0.24 غرام), L-valine (0.48 غرام), L-التيروزين (0.56 غرام), L-proline (0.4 غرام), L-tryptophan (0.64 غرام), L--ثريونين (0.4 غرام)، L-فينيل ألانين (0.2 غرام)، L-asparagine-H2O (0.2 غرام)، L-الجلوتامين (0.4 غرام)، L-histidine-HCl (0.2 ز), L-ميثيونين (0.12 غرام), L-ألانين (0.8 غرام), L-ليسين (0.4 غرام), وانخفاض الجلوتاثيون (0.36 غرام) في 500 مل الماء الديالمتين.
    2. حل L-السيستين (0.44 غرام) وL-كيستين (0.28 غرام) في حجم الحد الأدنى (~ 1 مل) من 1 M HCl وإضافة إلى محلول الأحماض الأمينية أعلاه.
    3. ضبط درجة الحموضة من الحل مع 10 N NaOH حتى يتم حل جميع الجسيمات. درجة الحموضة النهائية ستكون 10.0-11.0.
    4. جلب المجلد النهائي إلى 1 لتر مع الماء deionized.
    5. تصفية تعقيم الحل وaliquot في وحدات تخزين 250 مل.
    6. تخزين في -20 درجة مئوية.
  4. حل الأسهم الرابع
    1. حل الجلوكوز (200 غرام) في الماء الديالمتين إلى حجم نهائي قدره 1 لتر.
      ملاحظة: قد يكون الحل ساخنة لإذابة الجلوكوز.
    2. تصفية تعقيم وaliquot الحل في أنابيب مخروطية 50 مل.
    3. تخزين في -20 درجة مئوية.
  5. حل الأسهم الخامس
    1. الجمع بين هيكسانثين (5.0 غرام)، أوراسيل (5.0 غرام)، وNaOH (4.0 غرام) في الماء المنزوع الأيونات إلى حجم نهائي من 1 لتر.
    2. تصفية تعقيم وaliquot في أنابيب مخروطية 50 مل.
    3. تخزين في -20 درجة مئوية.
  6. الحل السادس
    1. إعداد 1 M CaCl2-2H2O (147 غرام / لتر) حل في المياه الخالية من الأيونات. تصفية تعقيم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT).
  7. حل الأسهم السابع
    1. إعداد 1 M اللامائية MgSO4 الحل في المياه الديالمتينة. تصفية تعقيم وتخزينها في RT.
  8. حل الأسهم الثامن
    1. إعداد 1 M NaHCO3 حل في المياه الديالمتينة. تصفية تعقيم وتخزينها في RT.

2. إعداد مركزة معقمة 4x و 1x CDM

ملاحظة: يجب إجراء هذا الإجراء إما في الأواني الزجاجية المعقمة المعالجة بالحمض أو البلاستيك لمنع رشح المعادن في المحاليل.

  1. الجمع بين حلول الأسهم الأول (50 مل)، الثاني (20 مل)، الثالث (250 مل)، الرابع (50 مل)، والخامس (20 مل) مع 20.0 غرام من HEPES ويحرك لخلط.
  2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4، ثم جلب حجم النهائي إلى 500 مل مع الماء deionized.
  3. غسل Chelex-100 الراتنج في 1 L deionized المياه لإزالة المواد الحافظة قبل إضافته إلى التركيز المعقم 4x. القيام بذلك عن طريق إضافة 50 غرام من الراتنج إلى 1 لتر الماء deionized والتحريك لمدة 1 ساعة على الأقل. إزالة الماء عن طريق الترشيح فراغ واستخدام هذا الراتنج غسلها للخطوة 2.4.
  4. إضافة 50 غرام من الراتنج ويحرك ببطء لمدة 90 دقيقة بالضبط.
  5. إزالة الراتنج عن طريق تصفية التعقيم وتخزين مركزة معقمة 4x في 4 درجة مئوية.
  6. لإعداد تركيز عمل 1x من آلية التنمية النظيفة، أولاً تمييع التركيز 4x مع الماء المعقم deionized، ثم إضافة الحل السادس (125 ميكرولتر لكل 500 مل من محلول 1x)، والحل السابع (535 ميكرولتر لكل 500 مل)، والحل الثامن (10 مل لكل 500 مل).
    ملاحظة: على الرغم من أن جميع حلول المخزون قد تم تعقيمها بالفعل، فمن المستحسن لتصفية تعقيم حل 1x مرة أخرى بعد التحضير.

3- إعداد لوحات آلية التنمية النظيفة

ملاحظة: وصفة أدناه يجعل 1 L الوسائط لوحات، ولكن من الأفضل لإعداد هذه في وحدات تخزين أصغر. كل شيء يتدرج بشكل متناسب.

  1. غسلها أغاروز
    1. حل 50 غرام من أغاروز في 1 لتر الماء deionized، واثارة لمدة 1 ساعة.
    2. نقل المحلول إلى زجاجة الطرد المركزي والطرد المركزي في 1200 × ز لمدة 15 دقيقة في RT. صب بعناية قبالة supernatant والتخلص منها.
    3. إضافة ما يكفي من الماء deionized لإعادة تعليق بيليه agarose، ثم نقل إلى قارورة لتر 1. جلب إلى حجم نهائي من 1 لتر مع الماء deionized ثم يحرك والطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 3.1.2. تجاهل السوبرناستانت.
    4. إضافة ما يكفي من الإيثانول 100٪ لإعادة تعليق بيليه، ثم نقل إلى قارورة لتر 1 جديدة. جلب إلى حجم نهائي من 1 لتر مع الإيثانول. اثارة والطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 3.1.2.
    5. كرر الخطوة 3.1.4.
    6. إضافة الميثانول إلى بيليه أغاروز لإعادة تعليق، ثم نقل إلى قارورة 1 لتر. جلب إلى حجم نهائي من 1 L مع الميثانول. اثارة والطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 3.1.2.
    7. كرر الخطوة 3.1.6.
    8. نقل أغاروز غسلها إلى صينية اصطف مع رقائق الألومنيوم والسماح لتجف في غطاء الدخان. عند الجفاف، نقل إلى حاوية خالية من المعادن للتخزين على المدى الطويل.
  2. أضف 10 غرام من أغاروز المغسولة و 5 غرام من نشا البطاطس إلى 750 مل من الماء المغوني.
  3. الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية، 100 كيلو باسكال فوق الضغط الجوي.
  4. السماح لوسائل الإعلام لتبرد إلى ~ 65 درجة مئوية، ثم إضافة 250 مل من 4X CDM، 250 ميكرولتر من الحل السادس، 1.07 مل من الحل السابع، و 20 مل من الحل الثامن.
  5. إذا رغبت في ذلك، إضافة المعادن من الاختيار قبل صب لوحات. إضافة chelators ليست ضرورية للحفاظ على ظروف خالية من المعادن.
  6. صب في أطباق بيتري والسماح لترسيخ.

4. المعادن نمو محدود من السيلان نيسيريا

ملاحظة: بالنسبة لمعظم التطبيقات، ليس من الضروري أن تُضغط على البكتيريا قبل تلقيح آلية التنمية النظيفة. وتكفي خطوة المضاعفة الأولية في آلية التنمية النظيفة وما تلاها من تخفيف لاستنفاد المكورات البنية لمخازنالحديد والزنك الداخلية. على هذا النحو، يتم إجراء أول خطوتين من الإجراء التالي باستخدام لوحات أغار مصنوعة من قاعدة GC المتوسطة التي تم استكمالها مع ملحق كيلوغ أنا14 و 12.5 ميكرومتر في (NO3)3. إذا كان الإجهاد المعدني المبكر مطلوبًا ، نوصي بإعداد لوحات GC الأساسية المتوسطة بدون Fe (NO3)3 ومع 5 μM TPEN (N، N، N'، N'tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine) لchelation الزنك أو 10 ميكرومتر deferoxamine لchelation الحديد. يتم إجراء جميع الاحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.

  1. قبل يومين من التجربة ، في اليوم -2 ، تتناثر الكوزونوكوز من مخزون الفريزر على لوحات GC المتوسطة واحتضان هالا يزيد عن 24 ساعة.
  2. في اليوم -1، سلسلة مستعمرات واحدة على لوحات GC المتوسطة الطازجة. في محاولة للقيام بذلك 14-16 ساعة قبل تجربة النمو.
  3. في يوم التجربة، إضافة 5-10 مل 1x CDM إلى حمض غسلها 125 مل قارورة الذراع الجانبية الحيرة(الشكل التكميلي 1)واستخدام هذا لفارغة مقياس الألوان Klett.
  4. استخدم مسحة معقمة ذات رؤوس قطنية لتلقيح آلية التنمية النظيفة من مستعمرات صحية ومفردة. الهدف ل20 وحدات كلليت.
    ملاحظة: إذا لم يكن مقياس الألوان Klett متوفرًا، يكون مقياس الطيف الضوئي مناسبًا أيضًا. لا توجد صيغة تحويل عالمية لوحدات Klett إلى OD ، ولكن يتوفر دليل تقريبي(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
  5. احتضان مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة حتى مضاعفة كتلة واحدة تقريبا (40 وحدات كليت). وينبغي أن يستغرق هذا ما بين 1-2 ساعة.
  6. عند هذه النقطة، يتم تخفيف الثقافات مرة أخرى بإضافة حجم كاف ٍ من آلية التنمية النظيفة للوصول إلى نصف الكثافة الثقافية الأولية (على سبيل المثال، إذا كانت 5 مل من الثقافة قد انتقلت من 20 إلى 40 وحدة كلليت، فإن 15 مل من آلية التنمية النظيفة سوف تعيدها إلى 10 وحدات من وحدات كلليت) وسيستمر النمو كما هو الحال في الخطوة 4.5. كمية محددة من تخفيف الظهر، والعلاجات المعدنية، وما إلى ذلك تعتمد على التطبيقات المصب. نعطي ثلاثة أمثلة أدناه (الأقسام 5 أو 6 أو 7).

5. التحليل الغربي للمنتجات الجينية المتجاوبة مع المعادن

  1. بداية من الخطوة 4.6، مرة أخرى تمييع الثقافات مع ثلاثة مجلدات من آلية التنمية النظيفة (على سبيل المثال، 15 مل من آلية التنمية النظيفة إذا بدأت مع 5 مل). عند هذه النقطة، إضافة العلاجات المعدنية إذا رغبت في ذلك.
    1. يمكن فك قمع جينات استشعار الحديد مع 12.5 ميكرومتر في (NO3)3. قد يتم فك الجينات المستجيبة للزنك مع 10 ميكرومتر زنزانسو4.
    2. ليس من الضروري زيادة إجهاد الحديد أو الزنك ، حيث أن الوسائط قد استنفدت بالفعل ، لذلك سيتم التعبير عن الجينات المستجيبة بالفعل. إذا كان المطلوب المزيد من الإجهاد، ونحن نوصي بما لا يزيد عن 1-2 ميكرومتر من deferoxamine أو TPEN، كما الإجهاد المفرط سيمنع الثقافات من النمو.
  2. تنمو الثقافات كما هو الحال في الخطوة 4.5 لمدة 4 ساعة وتسجيل كثافة الخلية النهائية للعينات. وسوف تنمو الثقافات الأقل توتراً بالمعادن إلى كثافات نهائية أعلى.
  3. توحيد الثقافات إلى كثافة مناسبة وإعداد اللاسات.
    1. توحيد الخلايا الكاملة ليسات إلى كثافة تعادل 100 وحدة كلليت في 1 مل من الثقافة. لتحقيق ذلك، تقسيم 100 حسب كثافة وحدة كليت من العينة الخاصة بك. الرقم الذي تحصل عليه هو حجم، في مل، من الثقافة التي سيتم استخدامها لجعل بيليه الخلية.
  4. اتبع معيار SDS-PAGE وإجراءات النشاف الغربية15 للتحقيق في البروتينات ذات الأهمية.

6. المعادن محدودة النمو المقالات

ملاحظة: تصف هذه المقالات الاستراتيجية premixes النمو مسبقالصنع. ويرد وصف لإعداد هذه الخلطات في الفرع 8.

  1. خلال مضاعفة الشامل في الخطوة 4.5، تراجع الآبار من 96 لوحة صغيرة مع 10x premixes. بالإضافة إلى ذلك، تعيين ثلاثة آبار لتكون بمثابة الفراغات. إلى هذه الآبار، أضف 10 ميكرولتر من 10x premix و 90 ميكرولتر من آلية التنمية النظيفة.
  2. بمجرد أن تضاعفت الثقافات في قوارير الذراع الجانبية ، أضف 100 ميكرولتر من كل ثقافة إلى بئر غير مستخدم في اللوحة الدقيقة ويقيس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600). ويمكن القيام بذلك مع cuvettes في مطياف ضوئي، ولكن مع أعداد أكبر من سلالات داخل فحص هذا يمكن أن تصبح مرهقة ولا ينصح عموما ما لم الطيف الخاص بك يمكن قياس مباشرة من ذراع قارورة الذراع الجانبية(الشكل التكميلي 2).
    1. أثناء قياس OD، ضع القوارير مرة أخرى في الحاضنة لضمان بقاء المكورات البنية قابلة للحياة.
  3. حساب المبلغ الصحيح من التخفيف المطلوبة لجلب الثقافات إلى OD600 = 0.02. وpremixes 10x لها تأثير لا يذكر على OD ويمكن حذفها من الحساب.
  4. تمييع الثقافات مع آلية التنمية النظيفة في أنابيب الثقافة الصغيرة وإضافة حجم كاف لتخفيف premixes 10x إلى 1x في لوحة. إذا كان طبق أكثر دفئا هو متاح، والحفاظ على لوحة في 37 درجة مئوية أثناء العمل.
  5. احتضان لوحة لمدة 8-12 ساعة مع اهتزاز في قارئ لوحة، مع القياسات OD600 على فترات المطلوب.

7. الكشف عن ليغاند ملزمة من قبل ناقلات المعادن الغشاء الخارجي

  1. تعامل مع الثقافات كما هو مطلوب كما هو الحال في الخطوة 5.1 ، ثم احتضان مع اهتزاز لمدة 4 ساعة.
  2. قبل وقت قصير من علامة 4 ح، وقطع ثلاث قطع من ورق التصفية وقطعة من النيتروسليلوز إلى الحجم التقريبي اللازم لتناسب جهاز لطخة نقطة(الشكل التكميلي 3). Presoak النيتروسليلوز في الماء deionized، ثم تجميع الجهاز مع ورقة تصفية تحت النيتروسليلوز.
  3. عند 4 ساعة، قم بتسجيل كثافات الخلايا وتوحيدها إلى كثافة نهائية مناسبة. فمن المستحسن استخدام ~ 10٪ من الكثافة المستخدمة لإعداد الخلايا lysates في الخطوة 5. على سبيل المثال، إذا كان استخدام 100 KU في 1 مل للليسات، وهذا يعني ~ 10 KU في 1 مل لهذه بقع. الحساب هو نفسه على خلاف ذلك كما هو موضح في 5.3.1، وتضاف الثقافات مباشرة إلى النيتروسيلولوز في وحدات التخزين المحسوبة بدلا من تحويلها إلى ليسات.
  4. الأنابيب الخلايا الثقافات على النيتروسليلوز والسماح بوقت كاف للورقة مرشح لاستيعاب كل السائل.
  5. تفكيك الجهاز، والسماح للوصمة لتجف، ومنع غشاء النيتروسليلوز ل1 ح في 5٪ الزلال مصل البقر أو الحليب غير الدهني (ث / v) في تريس العازلة المالحة.
  6. إعادة تجميع جهاز لطخة نقطة، واستبدال ورقة تصفية مع فيلم البارافين لإنشاء ختم تسرب واقية تحت النيتروسيلولوز.
  7. تمييع ليغاند الربط المعدني ذي الفائدة إلى 0.2 ميكرومتر في خلايا المانع والمسبار لمدة ساعة واحدة.
  8. سحب قبالة السائل مع فراغ، وغسل وصمة عار، ثم اتبع الإجراءات المناعية القياسية لتطوير إشارة16. ويمكن القيام بخطوات غسل في أو خارج الجهاز.

8. تحميل المعادن من النقل، S100A7، وكالفيفان، وإعداد 10x Premixes

ملاحظة: كما هو الحال مع إعداد آلية التنمية النظيفة، استخدم الزجاج المغسول بالحمض أو البلاستيك لإعداد المحلول.

  1. إذابة المنفي البشري عند 10 ملغم/مل (125 ميكرومتر) في المخزن المؤقت الأولي (100 مم تريس، 150 مم NaCl، 20 مم م ناهكو3،درجة الحموضة = 8.4). يتم تعليق S100A7 وcalprotectin في المخزن المؤقت الذي يتكون من 20 mM Tris ، 100 mM NaCl ، 10 mM 2-Mercaptoethanol ، و 1 mM CaCl2، pH = 8.0).
    1. إضافة محلول الفرات (100 mM سترات الصوديوم، 100 mM NaHCO3،5 mM FeCl3-6H2O، درجة الحموضة = 8.4) إلى محلول الإحالة إلى التشبع بالحديد بنسبة 30٪ (على سبيل المثال، 75 ميكرولتر من محلول النمس ية مناسب لـ 5 مل من المنفيين إذا تم إجراؤه بـ 10 ملغم/مل).
    2. أضف ZnSO4 إلى S100A7 أو calprotectin بنسبة 50٪ من الأضراس إلى البروتين لإنشاء تشبع بنسبة 25٪ (يحتوي كل جزيء بروتين على موقعين ملزمين معدنيين). يمكن استخدام مستحضرات 100 ميكرومتر S100A7 أو calprotectin مع 50 ميكرومتر ZnSO4.
    3. في كلتا الحالتين، اسمح بالخلط في نهاية المطاف لأكثر من ساعة واحدة على الأقل لتحميل المعادن.
  2. إعداد 4 لتر من العازلة غسيل الكلى (40 mM تريس، 150 mM NaCl، 20 mM NaHCO3،درجة الحموضة = 7.4). تقسيم هذا إلى مجلدين منفصلين 2 L ومكان واحد في 4 °C.
  3. أضف البروتينات المعدنية المحملة إلى شريط غسيل الكلى باستخدام حقنة وdialyze مقابل وحدة التخزين المؤقت ة الأولى لمدة 4 ساعة في RT.
  4. نقل كاسيت إلى وحدة التخزين المخزن المؤقت الثاني وdialyze بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. بعد هذه الخطوات، يجب إزالة أي معادن غير منضمة.
    ملاحظة: ننصح بالحصول على حمض البيسيندونينيك لتحديد تركيزات البروتين بعد غسيل الكلى.
  5. استخدام 10x التحويل المسبق لاستخدام transferrin كمصدر الحديد الوحيد.
    1. إعداد هذا premix عن طريق تخفيف 30٪ الإنسان Fe-transferrin وbo-transferrin البقري (أعدت في 125 ميكرومتر كما هو موضح للنقل البشري، دون خطوة تحميل الحديد) إلى 75 ميكرومتر و 30 ميكرومتر، على التوالي، في PBS. وpremix التحكم الإيجابي يستبدل 30٪ Fe-transferrin مع 75 ميكرومتر Fe (NO3)3، وpremix التحكم السلبي يغفل أي الحديد المضافة، والإبقاء فقط على الأبقار أبو-نقل. في عملية الزرع، تمييع 10 ميكرولتر من هذه المركّزات مع 90 ميكرولتر من الثقافة. التركيزات النهائية هي 7.5 ميكرومتر 30٪ الإنسان Fe-transferrin و 3 ميكرومتر الأبقار أبو-نقل.
  6. استخدم نسخة معدلة من التحويل 10x premix لاستخدام S100A7 أو calprotectin كمصدر وحيد للزنك.
    1. للحصول على premix التحكم الإيجابي، دمج 50 ميكرومتر ZnSO4 في premix transferrin. للتحكم السلبي، قم بدمج 50 ميكرومتر TPEN وحذف الزنك. ثم، تأخذ 10 ميكرولتر من كل من هذه لكل عينة تحتاج هاجيدا، ونقل هذا الحجم إلى أنبوب جديد. إضافة إلى هذا النصف حجم الكثير من PBS العقيمة. على سبيل المثال، إذا كان 10 آبار سوف تتلقى premix التحكم إيجابية، واتخاذ 100 ميكرولتر من premix، نقله إلى أنبوب جديد، وإضافة 50 ميكرولتر من PBS. تفعل الشيء نفسه للسيطرة السلبية.
    2. لجعل S100A7 أو calprotectin premix، واتخاذ 10 ميكرولتر من premix التحكم السلبي لكل حاجة جيدة، والانتقال إلى أنبوب جديد، وإضافة نصف هذا الحجم من 25٪ Zn-S100A7 أو calprotectin. في مقاثة النمو، استخدم 15 ميكرولتر من المزيج المسبق وتمييع مع 85 ميكرولتر من الثقافة. تبقى التركيزات النهائية للمنفيين كما هي في الخطوة 8.5، مع إضافة 5 ميكرومتر من Zn أو TPEN أو S100A7/calprotectin.

النتائج

تم تطوير وتنفيذ وسط محدد محدد في غياب المعادن النزرة لنمو النيسيريا السيلان وتنفيذها لتوصيف الجينات المتجاوبة مع المعادن ومنتجاتها الجينية. في البروتوكول الأمثل ، يتم التحكم في الملف المعدني لوسائل الإعلام عن طريق إضافة المعادن مرة أخرى وفقًا لتقدير المحقق ، بدلا?...

Discussion

وسائل الإعلام النمو يخدم مجموعة متنوعة من الأدوار في البحوث الميكروبيولوجية. وتستخدم وسائل الإعلام المتخصصة للاختيار والإثراء، والتطبيقات الأخرى المختلفة لأنواع مختلفة من الدراسة. أحد هذه التطبيقات هو تحريض الجينات المتجاوبة مع المعادن ، والتي يتم إنجازها عادة عن طريق إضافة chelator معين ?...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يعلنانه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R01 AI125421، R01 AI127793، وU19 AI144182. يود كاتب الكتابة أن يشكر جميع أعضاء المختبر الذين ساهموا في التدقيق اللغوي ومراجعة هذه الطريقة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
125 mL sidearm flasksBellco2578-S0030Must be custom ordered
2-MercaptoethanolVWRM131Open in fume hood
3MM PaperGE Health3030-6461Called "filter paper" in text
AgaroseBioloneBIO-41025Powder
Ammonium chlorideSigma-AldrichA9434Powder
BiotinSigma-AldrichB4501Powder
Blotting grade blockerBio-Rad170-6404Nonfat dry milk
Bovine serum albuminRoche3116964001Powder
Bovine transferrinSigma-AldrichT1428Powder
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC5080Powder
Calcium pantothenateSigma-AldrichC8731Powder
CalprotectinN/AN/AWe are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 ResinBio-Rad142-2832Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swabPuritan25-806Cotton is better than polyester for this application
DeferoxamineSigma-AldrichD9533Powder
D-glucoseSigma-AldrichG8270Powder
Dialysis cassetteThermo66380Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatusSchleicher & Schwell10484138Lock down lid as tightly as possible before sample loading
EthanolKoptecV1016Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chlorideSigma-AldrichF7134Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrateSigma-AldrichF1143Irritant, do not inhale
GC medium baseDifco228950Powder, already contains agar
GlycineSigma-AldrichG8898Powder
HEPESFisherL-15694Powder
Human transferrinSigma-AldrichT2030Powder
HypoxanthineSigma-AldrichH9377Powder
Klett colorimeterManostat37012-0000Uses color transmission to assess culture density
L-alanineSigma-AldrichA7627Powder
L-arginineSigma-AldrichA5006Powder
L-asparagine monohydrateSigma-AldrichA8381Powder
L-aspartateSigma-AldrichA9256Powder
L-cysteine hydrochlorideSigma-AldrichC1276Powder
L-cystineSigma-AldrichC8755Powder
L-glutamateSigma-AldrichG1251Powder
L-glutamineSigma-AldrichG3126Powder
L-histidine monohydrochlorideSigma-AldrichH8125Powder
L-isoleucineSigma-AldrichI2752Powder
L-leucineSigma-AldrichL8000Powder
L-lysineSigma-AldrichL5501Powder
L-methionineSigma-AldrichM9625Powder
L-phenylalanineSigma-AldrichP2126Powder
L-prolineSigma-AldrichP0380Powder
L-serineSigma-AldrichS4500Powder
L-threonineSigma-AldrichT8625Powder
L-tryptophanSigma-AldrichT0254Powder
L-tyrosineSigma-AldrichT3754Powder
L-valineSigma-AldrichV0500Powder
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506Powder
MethanolVWRBDH1135-4LPFlammable liquid, store in flammables cabinet
NitrocelluloseGE Health10600002Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasicSigma-Aldrich60356Powder
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP9791Powder
Potassium sulfateSigma-AldrichP0772Powder
Potato starchSigma-AldrichS4251Powder
Reduced glutathioneSigma-AldrichG4251Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7N/AN/AWe are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761Powder
Sodium chlorideVWR470302Powder
Sodium citrateFisherS279Powder
Sodium hydroxideAcros Organics383040010Highly hygroscopic
Thiamine hydrochlorideSigma-AldrichT4625Powder
Thiamine pyrophosphateSigma-AldrichC8754Also called cocarboxylase
TPENSigma-AldrichP4413Powder
TrisVWR497Powder
UracilSigma-AldrichU0750Powder
Zinc sulfte heptahydrateSigma-Aldrich204986Irritant, do not inhale

References

  1. Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
  2. Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
  3. Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
  4. Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
  5. Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
  6. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  7. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  8. Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
  9. Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
  11. Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
  12. Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
  13. Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
  14. Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
  17. Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
  18. Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
  19. Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
  20. Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
  21. Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
  22. Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
  23. Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
  24. Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
  25. Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
  26. Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
  27. Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
  28. Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
  29. Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
  30. Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
  31. Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
  32. Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
  33. Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
  34. Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
  35. Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
  36. Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
  37. Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157 Neisseria

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved