JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في واجهة المذيبات العضوية والمائية ، تتجمع البروتينات الشبيهة بالإيلاستين المصممة خصيصًا في هياكل فوق جزيئية معقدة مثل الحويصلات والألياف والكواسيرفات التي تسببها المعلمات البيئية. تنتج بروتوكولات التجميع الموصوفة مقصورات تعتمد على الأغشية البروتينية (PMBCs) مع خصائص قابلة للسحب ، مما يتيح تغليف البضائع المختلفة.

Abstract

لبنات بناء البروتين مصممة هي المرشحين تنوعا لتجميع الهياكل فوق الجزيئية مثل الخلايا الحد الأدنى، ومركبات تسليم الأدوية وسقالات الإنزيمات. نظرًا لتوافقها البيولوجي وقابليتها للتآلف على المستوى الوراثي ، تعد البروتينات الشبيهة بالإيلاستين (ELP) لبنات بناء مثالية لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي. ومع ذلك، فإن تجميع الهياكل فوق الجزيئية القائمة على البروتين مع خصائص physiochemical متميزة وإمكانات تغليف جيدة لا يزال تحديا.

هنا نقدم بروتوكولين فعالين للتجميع الذاتي الموجه من ELPs amphiphilic في بنيات البروتين فوق الجزيئيمثل coacervates الكروية والألياف والحويصل المستقرة. تقوم بروتوكولات التجميع المقدمة بإنشاء مقصورات قائمة على غشاء البروتين (PMBCs) استنادًا إلى ELPs ذات خصائص فيزيائية كيميائية قابلة للتكيف. PMBCs إظهار سلوك فصل المرحلة وتكشف عن طريقة الانصهار الغشاء تعتمد وقادرة على تغليف جزيئات البضائع الفلورية المتنوعة كيميائيا. تتمتع شركات PMBCs الناتجة عن ذلك بإمكانية تطبيق عالية كمنصة لصياغة الأدوية وتسليمها، والخلية الاصطناعية، ومساحة التفاعل المجزأة.

Introduction

تجميع الهياكل فوق الجزيئية لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية أصبحت مهمة بشكل متزايد1،2،3،4،5. لتجميع العمارات الوظيفية مثل الكوات، الحويصلات، والألياف مع الخصائص الفيزيائية الكيميائية المطلوبة من المهم فهم والسيطرة على الخصائص الفيزيائية الكيميائية والتوافق للمكونات. بسبب الدقة الجزيئية للجزيئات الموجودة في الطبيعة ، تعتمد كتل البناء للهياكل فوق الجزيئية بشكل متزايد على الدهون أو الأحماض النووية أو البروتينات. بالمقارنة مع البوليمرات الاصطناعية، تسمح كتل البناء البروتينية بالتحكم الدقيق في الهياكل فوق الجزيئية الناشئة6 على المستوى الوراثي. يقوم تسلسل الأحماض الأمينية الأولية (aa) لكتل بناء البروتين الفردية بترميز المعلومات لإمكانات تجميعها من الجزيئية حتى المستوى العياني بالإضافة إلى الشكل ثلاثي الأبعاد والخصائص الفيزيائية للهيكل فوق الجزيئي النهائي7.

الطرق المبلغ عنها لتجميع الهياكل فوق الجزيئية المختلفة غالبا ما تنطوي على البروتينات الأمفيلية مثل البروتينات الحساسة لدرجة الحرارة الإيلاستين (ELP)5,8,9، المؤتلف oleosin10والبروتين الاصطناعي الأمفيلي11. وقد أدت أساليب درجة الحرارة التي أطلقت إلى تجميع micelles4,10,12الالياف13اوراق14والحويصلات9,15,16. تم تطبيق طرق تتضمن المذيبات العضوية لتشكيل الحويصلات الديناميكية القائمة على البروتين8,11,14. حتى الآن ، والبروتوكولات المطبقة لتشكيل الحويصلات غالبا ما تفتقر إلى السيطرة على التجميعات micrometer الحجم16,17أو يكون لها عائد تجميع محدود5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض الحويصلات القائمة على ELP المبلغ عنها قد أضعفت إمكانات التغليف12أو استقرار محدود مع مرور الوقت9. معالجة هذه العيوب، والبروتوكولات المقدمة تمكين التجميع الذاتي للميكرومتر والصغرى الفرعية الحجم الهياكل فوق الجزيئية مع خصائص physiochemical متميزة، وإمكانات تغليف جيدة والاستقرار لفترة طويلة. تجمع ELPs الأمفيلية المصممة خصيصًا في هياكل فوق جزيئية ، تمتد عبر النطاق من الكوات كروية وحزم الألياف الملتوية عالية الطلب إلى الحويصلات unilamellar اعتمادًا على البروتوكول المطبق والظروف البيئية المرتبطة به. تكشف المقصورات الكبيرة المستندة إلى غشاء البروتين البطيني (PMBC) عن جميع الأنماط الظاهرية الرئيسية مثل دمج الأغشية وسلوك فصل المرحلة المشابه للدهون. تقوم شركات PMBCs بتغليف جزيئات الشحن الفلورية المتنوعة كيميائياً والتي يمكن رصدها باستخدام المجهر البسيط للكشف عن الفلورسينس. تعد نطاقات ELP المتكررة المستخدمة في هذه الدراسة لبنات بناء جذابة للبنيات فوق الجزيئية القائمة على البروتين18. ومن المعروف أن وحدة تكرار الببتيدات ELP (VPGVG) تتسامح مع aa مختلفة إلى جانب proline في المركز الرابع (valine, V)، مع الحفاظ على خصائصها الهيكلية والوظيفية19. تم تحقيق تصميم ELPs الأمفيلية التي تحتوي على مجالات مائية ومائية مميزة عن طريق إدراج بقايا ضيف Aa (X) في VPGXG يكرر مع الهيدروكوبية المتميزة والقطبية والشحن20. نطاقات AMPhiphilic ELP حيث مجهزة فينيل ألانين (F) أو isoleucine (I) في حين أن المجال الهيدروفيلي يحتوي على حمض الغلوتاميك المشحون (E) أو أرجينين (R) كمخلفات ضيف. يمكن العثور على قائمة ببنيات ELP الأمفيفيلية المؤهلة وتسلسل aa المقابل لها في المعلومات والمراجع التكميلية8,21. جميع اللبنات حيث مجهزة إما مع الأصباغ الفلورية الصغيرة أو البروتينات الفلورية للتصور عن طريق المجهر الفلوري. mEGFP وغيرها من البروتينات الفلورية كانت ن تنصهر ميؤوس منها إلى المجالات المائية من amphiphiles ELP . وقد تترافق الأصباغ العضوية عبر سلالة خالية من النحاس تعزيز الكين-الأزيد cycloaddition (SPAAC) إلى حمض أميني غير طبيعي تم عرضه مترجماً للمشترك (UAA). المشاركة في الترجمة لـ UAApara-azidophenylalanine (pAzF)22يسمح تعديل N-المحطة الطرفية للمجال ELP المائية. وبهذه الطريقة صبغ الفلورسنت الأخضر BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) أو أي جزيء الفلورسنت الصغيرة مع سيكلووكتاين المتوترة يمكن استخدامها كمسبار الفلورسنت. يمكن بسهولة تأكيد النجاح في دمج pAzF UAA وcycloaddition من الصبغة عبر SPAAC عن طريق LC-MS / MS بسبب التهيئة الفعالة للببتيدات التربكية المقابلة8. تم تطبيق هذه الصبغة العضوية الصغيرة لتوسيع نطاق اختيار المذيبات لبروتوكولات التجميع ، نظرًا لأن البروتينات الفلورية لا تتوافق مع معظم المذيبات العضوية. يتم وصف بروتوكولي التجميع الأكثر كفاءة للهياكل فوق الجزيئية التي تم تطويرها في مختبرنا أدناه. طريقة تورم THF متوافقة فقط مع الصبغة العضوية المعدلة AMPhiphilic ELP. في المقابل ، فإن طريقة قذف 1-butanol (BuOH) متوافقة مع العديد من البروتينات مثل مسبار الفلورسنت على سبيل المثال mEGFP ، لأن الطريقة الموصوفة تحافظ بشكل كامل على فلورسسينس من هذه البروتينات الاندماجية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تغليف الجزيئات الصغيرة وسلوك الانصهار الفيزلي يعمل بشكل أفضل من خلال استخدام طريقة البثق BuOH.

Protocol

1. تصميم واستنساخ البروتينات الشبيهة بالإيلاستين (ELPs)

  1. استنساخ وتصميم الهياكل كما هو موضح في مكان آخر8،20. وتتوفر البلازميدات عند الطلب.

2. البروتين التعبير والتنقية والإعداد

  1. التعبير عن F20E20-mEGFP و F20E20-mCherry
    1. تطعيم ثقافة التعبير الرئيسية من بين عشية وضحاها قبل الثقافة إلى OD600 من 0.3. احتضان في 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة في معقم 400 مل LB المتوسطة تستكمل مع المضادات الحيوية المخصصة في قارورة 2 L.
    2. إعداد حل الأسهم IPTG (1 M) لتحريض ثقافة التعبير في المياه فائقة النقاء.
    3. عند الوصول إلى OD600 0.5-0.8، أضف IPTG إلى ثقافة التعبير إلى تركيز نهائي قدره 1 متر مربع وخفض درجة حرارة الحضانة إلى 20 درجة مئوية. السماح للتعبير عند 20 درجة مئوية لحوالي 20 ساعة في 200 دورة في الدقيقة.
  2. التعبير عن ELP amphiphilic التي تحتوي على UAA pAzF
    1. Inoculate ثقافة التعبير الرئيسية من بين عشية وضحاها E. القولونية قبل الثقافة التي تحتوي على اثنين plasmids pEVOL pAzF وعلى سبيل المثال pET28-NMBL-(TAG)R40F20-له إلى OD600 من 0.3 (انظر المعلومات التكميلية لتسلسل الأحماض الأمينية). احتضان في 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة في معقم 400 مل LB المتوسطة تكملها كاناماشين والكلورامفينيكول في قارورة 2 L.
    2. إعداد 100 mM pAzF محلول الأوراق المالية في المياه فائقة النقاء. ل10 مل من محلول الأسهم pAzF, تزن 206.2 ملغ pAzF وإعادة تعليقه في 8 مل من الماء الترافين. لإذابة pAzF رفع درجة الحموضة من الحل مع 3 M NaOH وتخلط بقوة. عندما يذوب pAzF، خفض درجة الحموضة بعناية إلى 10.5 وإضافة المياه فائقة النقاء إلى حجم النهائي من 10 مل. استخدام مرشح معقم (0.22 ميكرون) وaliquotعلى الحل في 2 أنابيب رد الفعل مل.
    3. إعداد 1 M حل الأسهم IPTG في المياه فائقة النقاء و 20٪ حل الأسهم arabinose في المياه فائقة النقاء.
    4. عند الوصول إلى OD600 0.5-0.8، أضف pAzF إلى ثقافة التعبير إلى تركيز نهائي قدره 2 mM. الثقافة المحتضنة لمدة 10 دقيقة، 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة للسماح للحصول على pAzF.
    5. حث التعبير عن البروتين المستهدف والتعبير عن tRNA اللازمة / ر - RNA synthetase عن طريق إضافة متزامنة من IPTG (1 mM) وarabinose (2 ٪ ) وخفض درجة حرارة الحضانة إلى 20 درجة مئوية.
    6. السماح للتعبير عند 20 درجة مئوية لحوالي 20 ساعة في 200 دورة في الدقيقة. حصاد ثقافة التعبير عن طريق الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 4000 × ز،40 دقيقة.
  3. الخلايا المنزلية وتنقية البروتين
    1. إعادة تعليق بيليه الإشريكية القولونية في المخزن المؤقت للليسي (10 مل لكل لتر من الثقافة؛ 50 مل تريس-HCl pH 8، 500 mM NaCl، 4 M urea، 0.25٪ تريتون X-100) التي تحتوي على ليسوزيمي (0.1 ملغ /مل) وPMSF (0.1 mM). احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد وتجميد وذوبان مرتين بعد ذلك عن طريق غمر العينة في النيتروجين السائل.
    2. Sonicate التعليق (30٪، 15 مرات، 30 s: 10 ق كسر) ومسح lysate عن طريق الطرد المركزي (4 درجة مئوية، 10،000 × ز لمدة 40 دقيقة).
    3. تنقية البروتين باستخدام الكروماتوغرافيا تقارب (على سبيل المثال على عمود النيكل 1 مل باستخدام نظام FPLC متصل ة جامع كسر؛ انظر جدول المواد). يلط البروتين مع العازلة elution (50 mM Tris-HCl، 500 mM NaCl، 4 M اليوريا، 250-500 mM imidazole) وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
    4. تحليل كفاءة التنقية عبر SDS-PAGE.

3. صبغ تعديل ELPs عبر SPAAC

  1. تقدير تقريبا تركيز حل ELP.  امتصاص280 لتقييم التركيز ليست قيمة منذ تسلسل pAzF-R40F20 تفتقر إلى الأحماض الأمينية التي تمتص في نطاق الأشعة فوق البنفسجية. لذلك، يمكن استخدام amphiphile ELP lyophilized سابقاً والمرجح كمرجع لمقارنة نطاق SDS PAGE. من خلال مقارنة القيمة الرمادية التلخيصية من نطاقات صفحة SDS من حلول ELP مع تركيزات معروفة والعينة الخاصة بك يمكن تقدير التركيز الخام من العينة الخاصة بك.
  2. أضف 1 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت BDP-FL-PEG4-DBCO (محلول مخزون 10 mM؛ تركيز نهائي 20 ميكرومتر) إلى 500 ميكرولتر من محلول ELP (~ 20 ميكرومتر). احتضان رد الفعل لحوالي 10 ساعة في 15 درجة مئوية، في حين تهتز ومحمية من الضوء.
  3. لمزيد من الاستخدام، dialyze رد الفعل لإزالة BDP المفرطة.
    1. توازن غشاء غسيل الكلى (على سبيل المثال 12 كيلو دا قطع) في المياه فائقة النقاء لمدة 10 دقيقة. قطع غشاء غسيل الكلى في الحجم الصحيح لوضعها على رأس فتح أنبوب رد فعل يحتوي على محلول ELP النقر. لإصلاح غشاء غسيل الكلى في الفتحة ، ضع غطاء أنبوب رد الفعل مع النواة اللكمة على الفتحة ، وبالتالي إغلاق الأنبوب.
    2. ضع أنبوب التفاعل رأسًا على عقب في المخزن المؤقت المختار. تبادل المخزن المؤقت (2-5 L) مرتين بعد غسيل الكلى لمدة 3 ساعة على الأقل في كل مرة. إزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين بين غشاء غسيل الكلى والمخزن المؤقت لضمان غسيل الكلى الناجح.

4. THF بروتوكول تورم

  1. Dialyze حل ELP متجانسة ضد الفوسفات أو تريس المخزن المؤقت (10 mM) مع درجة الحموضة مستقرة 7.5 لإزالة الأملاح والمركبات المتبقية من تنقية له العلامة.
  2. إعداد lyophilizer وتهدئة وصولا الى درجة حرارة البدء لتجميد التجفيف.
  3. Aliquot محلول البروتين dialyzed في أنابيب رد الفعل 1.5 مل (50-500 ميكرولتر لكل أنبوب) وتجميد الصدمة في النيتروجين السائل. لتجنب خلط غير المرغوب فيها من حلول البروتين المختلفة أثناء التجفيف التجميد، يمكن وضع قبعات مع ثقب صغير على رأس أنبوب رد الفعل لختم ذلك جزئيا.
  4. تأخذ عينات البروتين المجمدة من النيتروجين السائل ووضعها على الفور في الليوفيلي لبدء تجميد التجفيف. يتم الانتهاء من التجفيف بالتجميد عندما تكون العينة جافة تمامًا (حوالي 24-48 ساعة). في وقت لاحق، تهوية ELPs amphiphilized lyophilized مع الجافة N2،ثم إغلاق على الفور أغطية أنبوب رد الفعل لتجنب الاتصال مع رطوبة الهواء.
  5. أضف THF نقية إلى العينات lyophilized (ELP، 5-10 μM) ووضع الحل في حمام مائي سونيكاتور يحتوي على الماء المثلج لمدة 15 دقيقة للسماح لتورم ELP في THF.
  6. سخني دراجة حرارية إلى 30-60 درجة مئوية لتشكيل الحويصلات أو ما يصل إلى 90 درجة مئوية لتشكيل الألياف وإعداد أنابيب تفاعل جديدة تحتوي إما على الماء الفائق النقاء أو المخزن المؤقت (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4، 50 mM NaCl ، pH 5-13). يتجمع الكوسيرفات الكروي في الغالب عند 20 درجة مئوية داخل درجة الحموضة 9-13. ويفضل تشكيل الحويصلات في 50-60 درجة مئوية بين درجة الحموضة 7 و 9. تشكيل الألياف هو predominently المستحثة فوق 60 درجة مئوية بين درجة الحموضة 5 و 12.
  7. بعد خطوة سونيكيشن، ضع حل ELP/THF وكذلك الماء فائق النقاء أو محلول العازلة المعدة في thermocycler وتسخين ما يصل إلى درجة الحرارة المطلوبة لمدة 5 دقائق. عندما يتم الوصول إلى درجة الحرارة ينبغي أن يكون حل ELP / THF محمّد بعناية على رأس الماء فائق النقاء مدفأ أو محلول عازلة. وينبغي أن يكون الفصل الواضح بين المرحلتين مع واجهة متميزة مرئياً.
  8. وضع الخليط في thermocycler مرة أخرى واحتضان لمدة 20 دقيقة للسماح لتشكيل الحويصلات أو الألياف في واجهة. بعد ذلك، دع العينات تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل التحليل عن طريق المجهر الفلوري أو غسيل الكلى.
  9. حل Dialyze يحتوي على الهياكل فوق الجزيئية ضد الماء الفائق النقاء أو المخزن المؤقت (50 mM NaH2PO4/ Na2HPO4، 50 mM NaCl ، pH 7-10).

5. بروتوكول البثق BuOH

  1. إعداد 1-50 ميكرومتر ELP الحل في المياه فائقة النقاء أو عازلة (50 mM PB pH 7.5, 100 mM NaCl, قد تحتوي على ما يصل إلى 4 M اليوريا). يمكن تحديد تركيز حل الـ ELP F20R20-mEGFP وF20R20-mCherry باستخدام معاملات الانقراض الضر (F20R20-mEGFP A280 = 22015 M-1 سم-1 وF20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 سم-1)(انظر المعلومات التكميلية للتسلسلات aa).
  2. إضافة 10٪ -20٪ (v/v) 1-butanol وتخلط على الفور الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا أو رسم عنه من خلال حقنة عدة مرات. يمكن تطبيق ماصة مشتركة 100 ميكرولتر أو حقنة هاملتون مجهزة بإبرة 0.25 × 25 مم. يجب أن يزيد تعكر الحل أثناء الاختلاط ، مما يشير إلى تكوين الحويصلات. 1-أوكتانول 5٪-15٪ (v/v) يمكن أن تستخدم أيضا لقذف الحويصلات بدلا من 1-butanol.
  3. من أجل تحقيق توزيع حجم ضيق ، مقذوف الحويصلات باستخدام طارد صغير من خلال غشاء بحجم مسام قدره 1 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة. حجم الغشاء المستخدم للقذف يحدد قطع الحجم العلوي للحوائط.
  4. Dialyze الحويصلات كما هو موضح أعلاه (الخطوة 3.3) لإزالة المتبقية 1-butanol.

6. تغليف صبغ مع بروتوكول البثق BuOH

  1. مزيج ما يقرب من 40 ميكرونيل ELP الحل في 10 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 8 مع 1 μL Dextran تكساس الأحمر (0.0025 ملغم / مل التركيز النهائي).
  2. أضف 10 ميكرولتر من BuOH إلى المحلول واقذف 5-10 مرات من خلال حقنة مجهزة بإبرة 0.25 × 25 مم.

7. تحليل الهياكل فوق الجزيئية باستخدام المجهر الفلوري

  1. ضع حلقة تعزيز على شريحة زجاجية واضغط بقوة على الجانب اللاصق إلى الزجاج.
  2. إضافة 5 ميكرولتر من العينة إلى داخل حلقة التعزيز ووضع زلة غطاء على القمة.
  3. ختم العينة مع طلاء الأظافر على حواف زلة الغطاء لتجنب تبخر العينة أثناء التحليل.
  4. إجراء المجهر الفلوري كما سبق وصفه8.

النتائج

تطوير بروتوكول لإنتاج الحويصلات
يوضح الشكل 1 طريقتي إعداد الحويصلات المختلفة. تتكون طريقة تورم THF على الجانب الأيسر من ثلاث خطوات متتالية ونتائج في تجمعات فوق جزيئية مختلفة من ELP اعتمادًا على درجة الحرارة. في الشكل 1A صور المجهر epifl...

Discussion

خطأ أثناء اتباع البروتوكولات الموصوفة لتجميع الهياكل فوق الجزيئية المحددة يؤدي بشكل رئيسي إما إلى تشكيل مجاميع غير محددة(الشكل 2، IV) أو إلى AMPhiphiles ELP-amphiphiles الموزعة بشكل متجانس. وترد أدناه مناقشة الخطوات الحاسمة للبروتوكول:

لعائد التعبير العالي من ELP amphiphilic، ?...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون بنك دبي للموارد المالية على الدعم المالي ومركز تحليل النظم البيولوجية (ZBSA) لتوفيره مرفق البحث. ونحن ممتنون لP. G. شولتز، TSRI، لا جولا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية لتوفير pEVOL-pAzF plasmid. نشكر موظفي مركز تصوير الحياة (LIC) في مركز تحليل الأنظمة البيولوجية (ZBSA) التابع لجامعة ألبرت لودفيغز-فريبورغ على المساعدة في مواردهم من الفحص المجهري المحوري، والدعم الممتاز في تسجيل الصور.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 µm and 0.2 µm Steril FilterVWR
1,4-DithiothreitolMerck
1-butanol. >99.5% p.a.Roth
2log DNA ladderNEB
2-MercaptoethanolRoth
50 mL Falcon tubesVWR
79249 Alkyne Mega Stokes dyeSigma Aldrich
Acetic acid glacialVWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8%Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99%Roth
BDP-FL-PEG4-DBCOJena Bioscience
BiofugeHeraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm)Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)Roth
BspQINEB
Camera DS Qi1Nikon
Centrifuge 5417rEppendorf
Centrifuge 5810rEppendorf
CF-400-Cu square mesh copper gridEMS
ChloramphenicolRoth
CompactStar CS 4VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutralLife Technologies
Digital sonifierBranson
Dimethylsulfoxide (DMSO)Applichem
Dnase IApplichem
EarINEB
EcoRI-HFNEB
Environmental shaker incubator ES-20Biosan
Ethanol absoluteRoth
Ethidium bromide solutionRoth
Filter supportsAvanti
Glass platesBio-Rad
Glycerol Proteomics GradeAmresco
GlycinApplichem
H4-Azido-Phe-OHBachhem
Heat plate MR HeiTecHeidolph
HindIIINEB
HisTrap FF crude columnGE Life SciencesNickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.Merck
Illuminator ix 20INTAS
Illuminator LAS-4000Fujifilm
ImidazoleMerck
Immersions oil for microscopyMerck
Incubators shakers Unimax 1010Heidolph
Inkubator 1000Heidolph
IPTG, >99%Roth
KanamycinsulfateRoth
L(+)-ArabinoseRoth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCESartorius
LB-MediumRoth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSCChrist
Lysozyme, 20000 U/mgRoth
Microscope CM 100Philips
Microscope Eclipse TS 100Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)VWR
Microscopy slidesVWR
MicrowaveStudio
Mini-Extruder SetAvanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a.Roth
Natriumhydroxid pelletsRoth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro5 Prime
Nucleopore Track-Etch MembraneAvanti
PH meter 766 calimaticKnick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)Roth
Polypropylene Columns (1 mL)Qiagen
PowerPac basicBioRad
Propanol-2-olEmplura
Protein ladder 10-250 kDaNEB
Recirculating cooler F12Julabo
Reinforcement ringsHerma
SacI HFNEB
SDS PelletsRoth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose AcetateVWR
T4 DNA LigaseNEB
TEMEDRoth
TexasRed Dextran-ConjugateMolecularProbes
Thermomix comfortEppendorf
THF, >99.5% p.a.Acros
Triton X 100Roth
Trypton/Pepton from CaseinRoth
Ultrasonic cleanerVWR
Urea p.a.Roth
Vacuum pump 2.5Vacuubrand
XbaINEB
XhoINEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)Roth

References

  1. Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
  2. Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
  3. Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
  4. Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
  5. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  6. Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
  7. Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
  8. Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
  9. Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
  10. Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
  11. Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
  12. Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
  13. Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
  14. Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
  15. Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
  16. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
  17. Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
  18. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
  19. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  20. Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
  21. Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
  22. Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  23. Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
  24. Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
  25. Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
  26. Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
  27. Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
  28. Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

158

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved