التحسين من الكلين Organoid وOrganotypic الثقافة للعوعية ، التنمية الموسعة ، وتحسين التصوير المجهري

Summary

يصف هذا العمل طريقتين لدراسة تطور الأعضاء، إعداد زينوزراعة محسنة على الغشاء chorioallantoic (CAM) من أجنة الطيور التي تسمح لالأوعية الدموية من الأعضاء الجنينية المستزرعة وorganoids ورواية ثابتة z الاتجاه طريقة ثقافة الجهاز مع الشروط التجريبية المعدلة التي تسمح للتصوير البؤري الفاصل الزمني عالي الدقة.

Abstract

الثقافات الكلى الجنينية organotypic، وخاصة الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستمدة من الكلى الأعضاء، هي أدوات ممتازة لمتابعة العمليات التنموية ونمذجة أمراض الكلى. ومع ذلك، فإن النماذج محدودة بسبب نقص الأوعية الدموية والأداء الوظيفي. لمعالجة هذا، تم تطوير بروتوكول محسن لطريقة xenografting الخلايا والأنسجة إلى الغشاء chorioallantoic (CAM) لجنين الطيور للحصول على الأوعية الدموية واستعادة تدفق الدم. يتم تراكب الطعوم مع الخزانات الصغيرة المصنوعة حسب الطلب التي تقوم بإصلاح العينات إلى CAM وتزويدها بالوسط الثقافي الذي يحمي الطعوم من التجفيف. تسمح طريقة الثقافة المحسنة لـ xenografts بالنمو لمدة تصل إلى 9 أيام. كما تصف المخطوطة كيفية توفير الظروف المثلى للتصوير البؤري على المدى الطويل للعضويات الكلوية والثقافات الأورغنية باستخدام طريقة Z-Direction الثابتة (FiZD) المنشورة سابقًا. تعمل هذه الطريقة بلطف على ضغط عضو جنيني أو عضو بين غطاء زجاجي وغشاء في كمية كبيرة من الوسط وتوفر ظروفًا ممتازة للتصوير لمدة تصل إلى 12 يومًا. معا، تسمح هذه الطرق الأوعية الدموية وتدفق الدم إلى الاعضاء الكلوية وثقافات الكلى organotypic مع تحسين التصوير البؤري. الطرق الموصوفة هنا مفيدة للغاية لدراسة الوظائف الأساسية والتطبيقية للكلى على سبيل الكفو. وتنطبق كلتا الطريقتين على أنواع مختلفة من الأنسجة والأنسجة.

Introduction

أصبحت الثقافة الأورجة للكلى الجنينية نموذجا هاما لدراسة الكلية منذ عقود^1،2،3. تمثل الرينالودات نظامًا نموذجيًا متقدمًا لدراسة تطور الكلى الصحية والمريضة^4. العيب الرئيسي لكلا الطريقتين، ومع ذلك، هو أن أيا من الأسلوبين خلاصة الوظيفة الرئيسية للكلية: ترشيح الدم. الكلى والأوعية الدموية تتطور في الحلقات الكلوية وثقافات الأورجان وبمماثلة إلى مرحلة مبكرة في التنمية الفيفو; ومع ذلك ، فإن الكبيبات التي تشكلت في المختبر لا تزال وعائية^5. الأوعية الدموية من الكلى الجنينية على سبيل لا ينف والأعضاء الكلوية وقد أظهرت سابقا في تجارب زرع فقط تحت في ظروف الجسم الحي. على سبيل المثال، زرع الأعضاء الكلوية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات تحت كبسولة كلية فأرة يسمح بتطوير الكلى في الجهازية إلى مرحلة وظيفية⁶.

النهج الوسيط بين الثقافات المختبرية البحتة وفي طرق زرع الجسم الحي هو زرع xenotransplant إلى CAM من أجنة الطيور. وقد ثبت الأوعية الدموية من primordia الكلى الماوس سليمة سابقا باستخدام هذا النظام^7,8. ومع ذلك ، فقد تبين أيضا أن الأوعية الدموية الكلوية في الكلى المورين المزروعة xenotransplanted مشتق من الإندوثيوليوم المضيف ، وليس الكسب غير المشروع⁹. وقد قللت هذه الملاحظة بشكل كبير من إمكانات النماذج الكيميرية (الثدييات الطيورية) للكلى الجنينية لدراسة تطور الأوعية الدموية الكلوية، لأن الظروف التجريبية كانت غير متساهلة لبقاء الخلايا البطانية المشتقة من المانحين.

عرض في الجزء الأول من هذا البروتوكول هو طريقة محسنة لزراعة الكلى الجنينية الماوس على CAM من بيض الطيور، والجمع بين الظروف البيئية الدقيقة من الثقافة organotypic وxenotransplant. التحسن الرئيسي في الأساليب السابقة هو أنه بدلا من وضع الكلى الجنينية الماوس والأعضاء الكلوية مباشرة على CAM، يتم تراكب منطقة زرع مع الخزانات الصغيرة نفاذية مليئة المتوسطة الثقافة التي تزود الأنسجة المزروعة مع المواد الغذائية وحمايتها من التجفيف. ويزداد معدل نجاح التجارب زيادة كبيرة وتتحسن ظروف تطوير الأوعية الدموية المستمدة من المانحين. تطبيق هذه الطريقة على الثقافات xenotransplant يؤدي إلى تطوير الأوعية الدموية الكبيبية تتألف من الخلايا الذاتية الذاتية من الكلى المانحة.

التحليل التفصيلي للمورفوجينيسيس الخلوي هو تطبيق مهم آخر لنماذج زراعة الكلى. أساليب ذكرت سابقا من الحصول على صورة الفاصل الزمني من الكلى الثقافات كافية فقط لتحليل مورفولوجيا العام ونقش الكلى الجنينية، ولكن ليس لتتبع الخلايا الفردية¹⁰. في الآونة الأخيرة، وصفت رواية ثابتة Z-الاتجاه (FiZD) طريقة تهدف إلى عالية الدقة confocal 3D الوقت الفاصل تصوير organoids الكلوية والثقافات organotypic¹¹. في هذه الطريقة ، يتم ضغط الأعضاء والأعضاء الجنينية بلطف بين غطاء زجاجي وغشاء نفاذي لإدراج ترانسويل في لوحة مصممة خصيصًا حتى يصل سمك العينة إلى 70 ميكرومتر ، مما يوفر الظروف البصرية المثلى للتصوير. في الجزء الثاني من الأساليب ، يتم وصف بروتوكول مفصل لتصنيع لوحة مصممة خصيصًا وإعداد تجارب FiZD للتصوير المنجري على المدى الطويل.

Protocol

وتتفق رعاية الحيوان وإجراءاته مع التشريعات الوطنية الفنلندية المتعلقة باستخدام الحيوانات المختبرية، والاتفاقية الأوروبية لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة لأغراض تجريبية وغيرها من الأغراض العلمية (ETS 123)، والتوجيه 86/609/الجماعة الاقتصادية الأوروبية الصادر عن الاتحاد الأوروبي.

1. تصنيع الخزانات الصغيرة لزراعة الكلى الجنينية الماوس وorganoids الكلى على CAM الدجاج وإقامة تجارب xenotransplant

1. استخدام الخلايا transwell الثقافة إدراج مصممة ل6 جيدا أو 12 لوحات جيدا.
   ملاحظة: اعتماداً على تجربة معينة، يمكن استخدام الخزانات الصغيرة الكبيرة أو الصغيرة. فمن الأفضل استخدام الخزانات الصغيرة لxenografting ما يصل إلى ثماني الكلى الجنينية أو عندما سيتم وضع العديد من الخزانات الصغيرة على نفس جنين الدجاج (على سبيل المثال، تجربة وعينات التحكم على CAM الدجاج نفسه).
2. خفض الجانبين من إدراج باستخدام أداة دوارة متعددة مع شفرة منشار دائري أو منشار اليد لإنشاء حلقة بلاستيكية عالية 2 مم مع غشاء نفاذي تعلق عليه.
3. تلميع حواف هذه الخزانات الصغيرة مع مشرط أو سكين حادة.
4. قم بتعقيم الخزانات الصغيرة في الإيثانول بنسبة 70% لمدة ساعة واحدة على الأقل.
5. اغسل الخزانات الصغيرة في الماء المقطر المزدوج الأوتوكلاف واتركه يجف في غطاء لامنار.
6. شطف الخزانات الصغيرة في برنامج تلفزيوني والمتوسطة الثقافة (ارتفاع الجلوكوز DMEM/10% FBS/1% البنسلين-العقديات).
7. ضع الخزان في طبق بيتري ، على رأس قطرة (600 ميكرولتر / 400 ميكرولتر) من وسط الثقافة مع مواجهة الغشاء.
8. ترتيب تشريح الكلى الجنينية الجسم ية أو الكلى بالتساوي على الغشاء بمساعدة ماصة أو أنبوب الشعيرات الدموية الزجاجية. تجنب ترك الكثير من السائل حول الكلى.
9. دع العينات تعلق على الغشاء لمدة 2-24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO_2.
   ملاحظة: يمكن ترتيب ما يصل إلى ثمانية كلى فأرة جنينية أو عضوية في الكلى على الغرز الصغير. يوصى بإدراج كبير إذا كان سيتم استخدام قطع أكبر من الأنسجة الجنينية لزراعة xenoأو خليط الهيدروجيل الخلوي على مساحة أكبر من CAM.
10. اتخاذ 8 أيام من العمر السابقين ovo المستزرعة الدجاج الجنينية أعدت وفقا لأساليب نشرت سابقا من حاضنة ثقافة الخلية^12,13.
11. نقل الخزانات الصغيرة إلى CAM بحيث الطعوم تواجه CAM، وتراكب الغشاء لهم. وضع الخزانات الصغيرة في محيط CAM، بحيث أنها لا تغطي جنين الدجاج.
    ملاحظة: عند استخدام الخزانات الصغيرة الصغيرة المصنعة من إدراج ترانسويل ل12 لوحات بئر، يمكن وضع ما يصل إلى ثلاثة خزانات صغيرة على كاميرا واحدة.
12. أضف 500 ميكرولتر (6 إدراج جيد) أو 300 ميكرولتر (12 إدراج جيد) من الثقافة المتوسطة إلى الخزانات الصغيرة.
13. زراعة العينات على CAM الدجاج لمدة أقصاها 9 أيام. استبدال وسط الثقافة في الخزانات الصغيرة يوميا.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة الأوعية الدموية للعينات في أقرب وقت 24-48 ساعة بعد زرعها.

2. تصنيع لوحات مصممة خصيصا واقامة الثقافات FiZD

1. حفر ثقوب قطرها 20 ملم في الجزء السفلي من لوحة بئر 6.
   ملاحظة: بالنسبة لتجارب FiZD، استخدم 6 لوحات بئر ذات عمق جيد 16 مم (المحدد في جدول المواد).
2. البولندية الحافات من الثقوب (وخاصة على الجانب العلوي) باستخدام حفر الكهربائية مع بت الحفر countersink، مشرط، أو سكين حادة.
3. قم بتعقيم الأطباق في الإيثانول بنسبة 70% لمدة ساعة واحدة على الأقل.
4. غسل لوحات في الماء المقطر المزدوج الأوتوكلاف والسماح لهم الجافة في ظروف معقمة.
5. غسل بدقة 22 ملم × 22 ملم المغطاة الزجاجية مع 70٪ الإيثانول أو تنظيفها وفقا للبروتوكول المنشور من قبل Saarela وآخرون^11.
6. الغراء coverslips إلى الجانب العلوي من الثقوب في 6 لوحات البئر باستخدام الغراء الأنسجة غير سامة. تطبيق الغراء حول الحفرة ووضع بلطف coverslip لتغطية ذلك. دع الغراء يجف.
7. فحص لوحات تحت ستيريوميكرور وإزالة الغراء المجفف الزائد من سطح coverslips إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: تأكد من عدم وجود الغراء فوق قسيمة الغطاء لضمان ضغط حتى من العينات.
8. خلط حبات البوليسترين (70 ميكرومتر حجم الجسيمات) مع حجم متساو من الهيدروجيل. حجم 50-100 ميكرولتر لكل بئر كاف.
   ملاحظة: الحفاظ على خليط من حبات الهيدروجيل والبوليسترين على الجليد.
9. وضع إدراج ترانسويل تحت المجهر تشريح مع الغشاء حتى.
10. ترتيب العينات (على سبيل المثال، الكلى الجنينية على سبيل المثال أو الكلى الكلوية) بالتساوي على الغشاء.
11. إضافة خليط خرز الهيدروجيل / البوليسترين بجانب العينات بعناية لتجنب الأضرار التي لحقت الأنسجة الهشة.
12. الوجه إدراج transwell بحيث الغشاء مع العينات المجمعة على ذلك هو مواجهة أسفل.
13. ضع الغرز برفق في بئر من لوحة 6 جيدة المعدلة واضغط بلطف عليه حتى يتم ضغط العينات إلى مستوى الخرز.
    ملاحظة: اتبع تقدم الضغط باستخدام المجهر.
14. الحفاظ على إدراج الضغط قليلا إلى البئر مع يد واحدة وإصلاحه إلى لوحة عن طريق ذوبان البلاستيك مع الحديد لحام في ثلاث نقاط على هامش إدراج.
15. عندما يتم إصلاح إدراج إلى لوحة، إضافة 2 مل من الثقافة المتوسطة (DMEM/10% FBS/1% البنسلين-streptomycin) إلى البئر والاستمرار في تجميع الآبار المتبقية في لوحة بنفس الطريقة.
16. نقل اللوحة النهائية إلى حاضنة على خشبة المسرح من المجهر المقلوب للتصوير الفاصل الزمني.
17. إجراء تصوير الفاصل الزمني للعينات باستخدام الإعدادات التجريبية المناسبة.
    ملاحظة: تغيير الثقافة المتوسطة في آبار لوحة أثناء تجارب الفاصل الزمني غير مطلوب ولكن يمكن القيام به بسهولة من خلال الثقوب على جانبي إدراج.

النتائج

مكن بروتوكول الثقافة CAM المقدمة هنا الأوعية الدموية عالية الكفاءة من الأعضاء الكلوية والكلى الجنينية نتيجة لزراعة xenotransplant على CAM الدجاج(الشكل 1، الفيلم 1). الخزانات الصغيرة التي تحتوي على الاستزراع المتوسطة زودت الأنسجة المانحة بالمواد المغذية وحمتها من التجفيف ?...

Discussion

يتم تقديم بروتوكولين مفصلين يصقلان طريقة الثقافة الكلوية الكلاسيكية، ويمكّنان من الأوعية الدموية، والتنمية الموسعة، والتصوير الأمثل 4D (أي الصورة والوقت ثلاثي الأبعاد) للكلى الجنينية الجنينية العضوية. يسلط هذا القسم الضوء على الخطوات الهامة في الأساليب ويناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها.<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610