JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن وصف بروتوكول لنموذج ثقافة ثلاثية الأبعاد المشتركة من الشعب الهوائية المصابة، وذلك باستخدام CFBE41o- الخلايا، الضامة THP-1، وSوى pseudomonas aeruginosa،التي أنشئت في واجهة الهواء السائل. يوفر هذا النموذج منصة جديدة لاختبار فعالية المضادات الحيوية في وقت واحد، وظيفة الحاجز الظهاري، وعلامات الالتهاب.

Abstract

البحوث fDrug لعلاج التهابات الرئة تتقدم نحو النماذج التنبؤية في المختبر عالية التعقيد. يمكن أن يؤدي وجود البكتيريا متعددة الأوجه في نماذج الرئة إلى إعادة تكييف الترتيب الظهاري ، في حين تنسق الخلايا المناعية استجابة التهابية ضد البكتيريا في البيئة الدقيقة. بينما في نماذج الجسم الحي كانت الخيار لاختبار جديدة مضادة للعدوى في سياق التليف الكيسي، فإنها لا تزال لا تحاكي بدقة في الظروف في الجسم الحي من هذه الأمراض في البشر ونتائج العلاج. ويمكن لنماذج معقدة في المختبر من الشعب الهوائية المصابة على أساس الخلايا البشرية (الظهارية الشعب الهوائية و الضامة) ومسببات الأمراض ذات الصلة سد هذه الفجوة وتسهيل ترجمة جديدة لمكافحة العدوى في العيادة. لهذه الأغراض، تم إنشاء نموذج مشترك للثقافة من التليف الكيسي البشري القصبي خط الخلايا الظهارية CFBE41o- و THP-1 monocyte المستمدة من الضامة، تقليد عدوى الغشاء المخاطي القصبي البشري من قبل P. aeruginosa في الهواء السائل واجهة (ALI) الظروف. تم إعداد هذا النموذج في سبعة أيام ، ويتم تقييم المعلمات التالية في وقت واحد: سلامة الحاجز الظهاري ، والهجرة الضامة ، والبقاء على قيد الحياة البكتيرية ، والالتهاب. ويصف هذا البروتوكول نظاما قويا ويمكن استنساخه لتقييم فعالية الأدوية والاستجابات المضيفة التي يمكن أن تكون ذات صلة باكتشاف مضادات جديدة للعدوى وتعظيم إيصالها للهباء الجوي إلى الرئتين.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa هو الممرض ذات الصلة في التليف الكيسي (CF) الذي يساهم في ضعف أنسجة الرئة1. إنتاج السكريات، مثل ألجينات وغيرها من exucoid exopolysaccharides، ينسق تقدم المرض، مما يؤدي إلى الالتزام البكتيري عنيد، يحد من تقديم المضادات الحيوية إلى البكتيريا ويحمي البكتيريا ضد الجهاز المناعي المضيف2. إن انتقال P. aeruginosa من مرحلة planktonic إلى تشكيل البيوفيلم مسألة حاسمة في هذا السياق ، مما يسهل أيضًا حدوث التسامح مع المضادات الحيوية.

في سياق CF، تم استخدام الفأرة في المقام الأول كنموذج. الفئران، ومع ذلك، لا تتطور تلقائيا هذا المرض مع إدخال الطفرات CF3. وقد أجريت معظم البكتيريا بيو فيلم التنمية والدراسات القابلية للأدوية على الأسطح غير الحيوية، مثل أطباق بيتري. غير أن هذا النهج لا يمثل التعقيدات الحيوية. على سبيل المثال، هناك حواجز بيولوجية مهمة غائبة، بما في ذلك الخلايا المناعية وكذلك ظهارة المخاطية. على الرغم من P. aeruginosa هو سامة جدا للخلايا الظهارية, وقد تمكنت بعض المجموعات للمشاركة في زراعة في وقت سابق P. aeruginosa بيو فيلم مع الخلايا القصبية البشرية. نشأت هذه الخلايا من مرضى التليف الكيسي مع طفرة CFTR (CFBE41o- الخلايا)4 وسمح لتقييم فعالية المضادات الحيوية5 أو تقييم تصحيح بروتين CFTR أثناء العدوى6. وقد تبين أن هذا النموذج لتحسين القدرة على التنبؤ بكفاءة المخدرات ، بالإضافة إلى تمكين توصيف القضايا مع الأدوية التي فشلت في المراحل اللاحقة من تطور المخدرات7.

ومع ذلك ، في الرئة ، يتعرض ظهارة المخاطية للهواء. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا المناعية الموجودة في الشعب الهوائية، مثل الضامة الأنسجة، تلعب دورا أساسيا ضد مسببات الأمراض المستنشقة أو الجسيمات8. تهاجر الضامة عبر طبقات الخلايا المختلفة للوصول إلى تجويف الشعب الهوائية ومحاربة العدوى. وعلاوة على ذلك، الأدوية المستنشقة أيضا للتعامل مع وجود المخاط كعنصر إضافي غير الخلوية من حاجز الدم الهوائية الرئوي9. في الواقع، تم تطوير العديد من النماذج المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) في المختبر، بهدف زيادة أهمية في الجسم الحي. ولا تزيد نظم الاستزراع المشترك من تعقيد نظم المختبرات لاكتشاف المخدرات فحسب، بل تمكن أيضا من دراسة تفاعلات الخلايا الخلوية. وقد تم تناول هذا التعقيد في دراسات حول هجرة الضامة10، والافراج عن الببتيدات المضادة للميكروبات من قبل العدلات11، ودور المخاط في العدوى9، ورد فعل الخلية الظهارية للضرر المفرط12. ومع ذلك، يمكن الاعتماد عليها CF المصابة في المختبر نموذج الذي يتميز الطفرة الجينية في CF، التي تتعرض للهواء (زيادة الحالة الفسيولوجية)، ويدمج الخلايا المناعية لا تزال تفتقر.

ولسد هذه الفجوة، فإننا نصف بروتوكولاً لثقافة الإنسان المشتركة المستقرة ثلاثية الأبعاد في الخطوط الجوية المصابة. النموذج هو الذي يتألف من الخلايا الظهارية 5 والخلايا الضامة، المصابة بP. aeruginosa وقادرة على تمثيل كل من حاجز الانتشار والمناعية. بهدف اختبار مضادات العدوى في إنتاجية عالية إلى حد معقول، تم تأسيس هذه الثقافة المشتركة على غشاء فلتر نفاذي من إدراج لوحة جيدا، وذلك باستخدام اثنين من خطوط الخلايا البشرية: CFBE41o- و THP-1 monocyte المشتقة من الضامة. وعلاوة على ذلك، لدراسة ترسب الهباء الجوي المضادللعدوى 13،تم إنشاء النموذج في واجهة الهواء السائل (ALI) بدلاً من الظروف المغطاة السائلة (LCC).

كما نحن التقرير هنا, هذا النموذج يسمح بتقييم البقاء على قيد الحياة ليس فقط البكتيرية على العلاج بالمضادات الحيوية ولكن أيضا السمية الخلوية الخلية, سلامة الحاجز الظهارية, الهجرة عبر الضامة, والاستجابات الالتهابية, التي هي معلمات أساسية لتطوير المخدرات.

يجمع هذا البروتوكول بين نوعين من الخلايا ذات الصلة لعلاج استنشاق الشعب الهوائية الرئوية: الضامة وظهارة الشعب الهوائية CF. وتُزرع هذه الخلايا على طرفي نقيض من إدراجات الدعم القابلة للنفاذ، مما يسمح بتعرض الخلايا للهواء (وتسمى ظروف الواجهة الهوائية السائلة (ALI). هذه الثقافة المشتركة للخلايا المضيفة المصابة في وقت لاحق مع P. aeruginosa. كلا خطوط الخلية المضيفة هي من أصل الإنسان: الخلايا الظهارية تمثل ظهارة الشعب الهوائية التليف الكيسي، مع طفرة على قناة CF (CFBE41o-) ، وخلايا THP-114 هي خط خلية تشبه الضامة. يسمح لأول مرة لطبقة ظهارية التقاء لتشكيل على الجانب العلوي من إدراج لوحة جيدا قبل أن تضاف الخلايا الضامة مثل إلى المقصورة المقابلة. بمجرد تأسيس الثقافة المشتركة في ALI ، يتم تلقيح النظام مع P. aeruginosa على الجانب apical. ثم يتم استخدام هذا النظام المصاب المشترك في الثقافة لتقييم فعالية المضادات الحيوية، مثل التوسرامايسين. يتم تحليل نقاط النهاية التالية: سلامة الحاجز الظهاري من حيث المقاومة الكهربائية عبر الطرفية (TEER) ، والتصور لتفاعلات الخلايا الخلوية والبكتيريا بواسطة المجهر المسح الضوئي بالليزر (CLSM) ، والبقاء على قيد الحياة البكتيرية من خلال عد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) ، والبقاء على قيد الحياة الخلية المضيفة (السمية الخلوية) وإطلاق سراح السيتوكين.

Protocol

1. نمو وتمايز الخلايا في إدراج الدعم نفاذة

  1. زراعة CFBE41o- في قارورة T75 مع 13 مل من الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية (MEM) التي تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ الأحماض الأمينية غير الضرورية و 600 ملغم / لتر الجلوكوز في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2 الغلاف الجوي. أضف وسطًا جديدًا إلى الخلايا كل 2-3 أيام.
    1. فصل الخلايا بعد الوصول إلى التقاء 70٪ في القارورة مع 3 مل من التربسين- حمض الإيثيلين اديامينيتيتراتيكتيك (EDTA) في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إضافة 7 مل من MEM الطازجة والطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تجاهل عظمى وإضافة 10 مل جديدة من MEM في حين تعطيل الكتل عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا.
    2. عد الخلايا التي تحتوي على عداد خلية تلقائي أو غرفة قياس الهيموسيت. خلايا البذور مع كثافة 2 × 105 خلايا / جيدا في 12-جيدا لوحات مع دعامات نفاذية (حجم المسام من 3 ميكرومتر، انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يحدد عداد الخلايا التلقائي رقم الخلية وتوزيع الحجم وملاءمة الخلايا (راجع جدول المواد). ويمكن استخدام دعامات نفاذية بحجم مسام 0.4 ميكرومتر هنا؛ ومع ذلك، يجب إضافة الضامة في هذه الحالة مباشرة إلى الجانب apical، ولن يتم تقييم الهجرة عبر الخلية الخاصة بهم في هذه الحالة.
    3. خلايا البذور في حالة السائل السائل (LLC) عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية على الجانب apical من الدعم نفاذية و 1.5 مل من المتوسطة الطازجة في الجانب الباسطية. ثم احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2، لمدة 72 ساعة.
    4. للانتقال إلى ثقافة واجهة الهواء والسائل (ALI)، في اليوم الثالث بعد البذر، قم بإزالة الوسط من الجانب الباسطي أولاً، ثم من الجانب الزكي. إلى الجانب القاعدي، إضافة 500 ميكرولتر من ميو الطازجة وتغيير المتوسطة كل يوم الثاني حتى الخلايا تشكل أحادية التقاء.
      ملاحظة: للشروط المستخدمة في هذا البروتوكول، تكون الخلايا CFBE41o- عادةً التقاء بعد 3-7 أيام في الثقافة.
    5. تقييم خصائص الحاجز الظهاري في اليوم 7 عن طريق احتضان CFBE41o- الخلايا مع 500 μL خلية متوسطة في الجانب apical و 1.5 مل في الجانب الباسطني لمدة 1 ساعة، في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
    6. قياس خصائص الحاجز عبر المقاومة الكهربائية عبر الذبذبات (TEER)، مع قطب عيدان STX2 ومقياس فولت الظهارية؛ بعد 7 أيام هذا هو أعلى من 300 Ω × سم2.
      ملاحظة: في نهاية المطاف، في بعض إدراج الغشاء، والخلايا لديها TEER منخفضة. لذلك لا تستخدم إدراج نفاذية مع TEER < 300 Ω × سم ².
  2. لزراعة THP-1 الخلايا، تنمو لهم في قارورة T75 باستخدام 13 مل من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة تكملها 10٪ FCS، واحتضان في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2. انقسام الخلايا كل يوم الثاني عن طريق البذر 2 × 106 الخلايا / خلايا مل في قارورة T75 جديدة.
    ملاحظة: تزرع خلايا THP-1 غير مميزة كوحدات أحادية في التعليق.
    1. التفريق بين الخلايا THP-1 على النحو التالي. محتويات أجهزة الطرد المركزي من T75 في 300 × ز لمدة 4 دقائق. تجاهل supernatant، resuspend بيليه في المتوسطة الطازجة ووضع في T75 جديدة. إضافة 10 نانوغرام/مل Phorbol 12-myristate 13-خلات (PMA) incubatig الخلايا في RPMI ل 48 ح في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 الغلاف الجوي15.
      ملاحظة: بعد التمايز مع PMA، لا تتكاثر الخلايا بعد الآن وتُلحق القارورة.
    2. لفصل الخلايا الشبيهة بالضمة THP-1، اغسل مرة واحدة بالمحلول الملحي العازل للفوسفات (PBS) عند 37 درجة مئوية واحتضانها مع 3 مل من محلول مفرزة الخلايا (مثل accutase) الذي يحتوي على 0.5 mM EDTA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. فحص الخلايا تحت مجهر مقلوب للبحث عن انفصال الخلية. أضف 7 مل من الوسيلة الجديدة والطرد المركزي عند 300 x ز لمدة 4 دقائق في RT.
      ملاحظة: يمكن أيضا فصل الضامة مع التربسين-EDTA، 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ومع ذلك، التربسين هو أقسى إلى الضامة من الحل المفرزة الخلية المختارة (انظر جدول المواد).
    4. بعد إزالة عظمى، إعادة تعليق خلايا الضامة في 3 مل من THP-1 المتوسطة في أنبوب مخروطي 15 مل، عد الخلايا كما هو موضح في 1.1.2. واحتضان لمدة أقصاها 1 ح في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 قبل إعداد ثقافة المشاركة.
      ملاحظة: يمكن أن تلطخ الخلايا THP-1 في التعليق مع الأصباغ قابلة للحياة لصورة ثقافة المشاركة كذلك. في هذه الخطوة، استخدم الإجراء أدناه (الخطوة 1.2.5).
    5. الضامة البقعة مع 10 μM من صبغة صلاحية الخلية (على أساس تحويل مزيتات خلات من قبل esterases داخل الخلايا، انظر جدول المواد)الذي يتم تطبيق 3 ميكرولتر من صبغة صلاحية الخلية إلى تعليق الخلية. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،ثم غسل 1x مع برنامج تلفزيوني 37 درجة مئوية لإزالة الصبغة.
      ملاحظة: الطرد المركزي الخلايا لإزالة الصبغة في 300 س ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).

2. إنشاء ثقافة الظهارية - الضامة المشتركة على دعامات نفاذية

  1. استخدام CFBE41o- monolayers في ALI مع TEER ≥ 300 Ω × سم² (الخطوة 1.1.6.). إزالة المتوسطة من الغرفة السفلية، وعكس بعناية الدعم داخل طبق بيتري الزجاج المعقم (50 مم × 200 ملم)، وإزالة الخلايا متضخمة من خلال مسام الغشاء على الجانب السفلي من الغشاء باستخدام مكشطة الخلية.
    ملاحظة: بسبب حجم المسام من 3 ميكرومتر، تميل الخلايا الظهارية إلى النمو من خلال المسام نحو الجانب القاعدي. لذلك، يحتاج أحد إلى إزالتها قبل إضافة الضامة على هذا الجانب. CFBE41o- يمكن أن تلطخ خلايا الظهارية الرئة في هذه الخطوة. يمكن استخدام الإجراء في الخطوة 1.2.5; ومع ذلك، بدلا من تعليق الخلية، يتم تطبيق حل صبغ في MEM (500 μL الجانب apical فقط) على الخلايا الملتزم بها على الدعم نفاذية.
  2. استخدام 2 × 105 خلايا / جيدا (في 200 μL من RPMI) من تعليق الخلية من الضامة THP-1 متمايزة PMA ووضع الخلايا على الجانب القاعدي من إدراج مقلوب.
  3. أغلق أطباق بيتري بعناية و احتضن لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
  4. ضع الإدراج مرة أخرى في الألواح الدقيقة ذات الـ 12 بئرًا وأضف 500 ميكرولتر من وسيط MEM في الجانب القاعدي من الإدراج المُفَرّر للحفاظ على شروط ALI. الخلايا جاهزة الآن للعدوى.

3. العدوى عن طريق P. aeruginosa

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات التالية من هنا في مختبر من مستوى السلامة الأحيائية 2 (BSL2).

  1. تطعيم 15 مل من مرق الليسوجيني (LB) تكملها 300 ميكروغرام / مل أمبيسيلين في قارورة Erlenmeyer (50 مل) مع مستعمرة واحدة من P. aeruginosa PAO1-GFP.
    ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام سلالات أخرى من P. aeruginosa هنا، على سبيل المثال، نوع البرية PAO1، PA14، أو السلالات السريرية، بعد بروتوكولات الزراعة الخاصة بهم.
  2. احتضان البكتيريا لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية، تهتز عند 180 دورة في الدقيقة.
  3. نقل محتويات بعد 18 ساعة إلى أنبوب مخروطي 50 مل والطرد المركزي في 3850 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل عظمى وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني عقيمة في 37 درجة مئوية.
  4. قياس الكثافة البصرية على مقياس الطيفي في الطول الموجي 600 نانومتر وضبط تركيز البكتيريا باستخدام متوسطة ثقافة الخلية إلى تركيز نهائي من 2 × 105 CFU / مل. وهذا يتوافق مع تعدد العدوى (MOI) من بكتيريا واحدة لكل خلية ظهارية.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري إلى الجانب apical من الدعم نفاذية (الخطوة 2.4.) واحتضان في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 ل 1 ساعة، للسماح للبكتيريا التعلق بالخلايا. ثم، إزالة السائل apical بعناية مع ماصة لاستعادة شروط ALI. إبقاء بعض العينات غير المصابة كتحكم.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يجب أن تكون مطلية البكتيريا المرفقة في أجار LB (انظر الخطوات 5.4/5.5) لتحديد البكتيريا الأولية inoculum.
  6. احتضان المخدرات ذات الاهتمام بعد الالتصاق البكتيري في الخلايا. لتجارب العلاج، إضافة 500 ميكرولتر من محلول المخدرات المخفف في خلية المتوسطة (في هذا البروتوكول tobramycin 6 تم استخدام ميكروغرام /مل) إلى الجانب apical. إضافة 1500 μL من خلية المتوسطة دون المخدرات على الجانب القاعدي.
    ملاحظة: بدلاً من غرس الأدوية كحل، يمكن أيضًا تكييف النموذج مع ترسب الهباء الجوي. لهذه الأغراض، يتم تغذية الخلايا في ALI من الجانب القاعدي مع 500 ميكرولتر من خلية متوسطة. ثم يتم ابخ المخدرات أولا ويسمح للإيداع في المقصورة apical من قبل جهاز مناسب (غير موصوفة هنا). يمكن فحص العينة المصابة والمعالجة من أجل نقاط النهاية الموضحة في الأقسام 4-7. من هذه الخطوة فصاعدا، يمكن استخدام دعامات نفاذية لخلق إما الصور (القسم 4) أو للحصول على نتائج نمو البكتيريا والخلايا الثدييات البقاء، من بين أمور أخرى (الأقسام 5-7).

4. إعداد العينة للمجهر الليزر المسح confocal (CLSM)

  1. بعد إنشاء الثقافة المشتركة، والعدوى والعلاج من المخدرات، وإزالة جميع المتوسطة من الجانب apical والبصلة. اغسل 1x مع PBS عند 37 درجة مئوية ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 3% شبه شكلي (PFA) مقابل 1 ساعة في RT (300 ميكرولتر على apical/600 μL على basolateral). تلطخ نواة الخلية بـ 5 ميكروغرام/مل من DAPI-PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    تنبيه: PFA خطرة.
  2. قطع الأغشية باستخدام مشرط ووضعها بين اثنين من الشرائح 12 مم المجهر غطاء باستخدام المتوسطة تصاعد (انظر جدول المواد). اتركها تجف داخل مقعد التدفق لمدة 30 دقيقة قبل التخزين عند 4 درجات مئوية. تصور عن طريق المجهر المسح confocal.
    ملاحظة: بعد المشتركة في الثقافة وقبل تصاعد، يمكن تنفيذ مناعة الوصلات الضيقة. لذلك، يتم إصلاح الخلايا مع paraformaldehyde 3٪ لمدة 30 دقيقة، وغسلها مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني، و permeabilized مع saponin 0.05٪/BSA 1٪ في برنامج تلفزيوني. في هذا البروتوكول، تم الكشف عن البروتين occludens zonula (زو-1) عن طريق الماوس المضادة للجسم المضاد 1 زو 1 (1:400، حضانة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها). ثم تم احتضان العينات لمدة 2 ساعة في RT مع الماعز المضادة للماوس IgG الأجسام المضادة اليكسا فلور 633 (1:2000 في الأحمر). كانت النوى ملطخة بـ DAPI (1 ميكروغرام/مل) ومثبتة مع متوسطة التركيب على الأغطية.
  3. استخدم مجهرًا مشتركًا لتصوير الأغشية المخزنة. اختر 25x أو 63x أهداف الغمر بالماء وأشعة الليزر على 405، 488، 505 أو 633 نانومتر للكشف. يجب أن يكون للصور دقة 1024 × 1024 بكسل.
    ملاحظة: يتم اختيار الليزر وفقا للصبغة المستخدمة.
  4. احصل على طرق عرض مُنَفَذة ومتقاطعة، واستخدم وضع كومة زيتا (10-15 مكدسات) لبناء نموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج التصوير.

5. قياس الانتشار البكتيري عبر وحدات تشكيل مستعمرة (CFU)

  1. جمع المتوسطة apical والبصلة (التي تحتوي على البكتيريا) لتقييم CFU من البكتيريا غير المرفقة. جمع 500 μL من الجانبين apical والبصلية و تجمع لهم.
    ملاحظة: استخدم هذا التعليق مباشرةً لحساب البكتيريا (الخطوة 5.4) أو الطرد المركزي عند 21,250 x غم لمدة 10 دقائق لتقييم اللاكتات dehydrogenase (LDH) من المُنْتَكَر (القسم 6) و/أو إعادة تعليقها في برنامج تلفزيوني لحساب البكتيريا خارج الخلية (الخطوة 5.4).
  2. تقييم بقاء البكتيريا المرفقة و / أو الداخل في الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الماء البارد المعقم غير المؤين في كل حجرة من الدعم نفاذية. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن إما أن تكون مطلية العينات على أجار LB (انظر الخطوة 5.4) أو المجمدة (كلوحة إدراج كاملة) في -20 درجة مئوية للطلاء لاحقاً.
  3. لتقييم CFU من البكتيريا المتمسكة / الداخلية، تذوب عينات في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (إذا المجمدة). باستخدام نصائح ماصة لكل بئر، كشط سطح الغشاء والماصة صعودا وهبوطا لإزالة جميع المحتوى الملتزم بها.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم lysed جميع الخلايا الظهارية والبكتيريا المتمسك / الداخلي متوفرة كمواد تعليق لتكون مطلية.
  4. مع تعليق البكتيرية من كل الكسور، أداء تخفيف المسلسل 1/10 باستخدام Tween-80 0.05٪ في برنامج تلفزيوني وطبقة البكتيريا على لوحات LB أجار.
    ملاحظة: يوصى بتخفيف الانبعاثات في ما بين 1 إلى 10. يجب أن تحسب البكتيريا في أعلى تخفيف ، حيث يتم تحديد مستعمرات واحدة لأول مرة.
  5. احتضان لوحات أجار في 30 درجة مئوية لمدة 16-72 ساعة لحساب المستعمرات، وحساب CFU وفقا لذلك.
    ملاحظة: درجة حرارة 30 درجة مئوية في وقت حضانة لوحة أمر ضروري للعينات المعالجة ولمراقبة تأخر النمو من المستعمرات.

6. تقييم السمية الخلوية عن طريق فحص اللاكتات ديهيدروجيناز

  1. استخدام ناظر الخلايا المصابة التي تحتوي على البكتيريا (من الخطوة 5.1) لتقييم صلاحية الخلية لLDH فحص16. أجهزة الطرد المركزي في 21250 س ز لمدة 10 دقائق ل بيليه البكتيريا وبقية في نهاية المطاف من الخلايا. استخدام البكتيريا خالية من البكتيريا فائقة لقياس الافراج عن LDH.
    ملاحظة: لا ينبغي أن يتم تجميد ناظر قبل قياس LDH بواسطة هذا الفحص.
  2. نقل 100 ميكرولتر من supernatant إلى لوحة 96-well، وإضافة 100 ميكرولتر من محلول اختبار LDH (انظر جدول المواد). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام، ثم قراءة امتصاص في 492 نانومتر.

7. تقييم إطلاق السيتوكينات البشرية

  1. للحصول على كمية السيتوكين، استخدم إما ELISA أو مجموعة الخرزة السيتوماتية المناعية17(انظر جدول المواد). لهذا، أجهزة الطرد المركزي الفائقة من الخطوة 5.1 في 21250 × ز لمدة 10 دقيقة وقياس إما على الفور أو مخزن -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 15 يوما حتى التحليل.
  2. تقييم المُنَاتس مع مجموعة ELISA المتاحة تجاريًا.
    ملاحظة: يتبع الإجراء تعليمات التصنيع، والتي تشمل طلاء الألواح مع الأجسام المضادة لالتقاط، إضافة عينات (100 ميكرولتر) ومعايير السيتوكين، الحضانة، والغسيل، وإضافة الأجسام المضادة للكشف عن توفير قياس colorimetric وجود السيتوكين. بدلا من ذلك، يمكن استخدام عملية استئصال التدفق لقياس السيتوكينات عن طريق مجموعات متاحة تجاريا (انظر جدول المواد).

النتائج

الشكل 1A يظهر مورفولوجيا الناتجة المشتركة في الثقافة من الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية و الضامة بعد تزايد كل من ل 24 ح على الجانب apical والبصلة من يدعم نفاذية، على التوالي. يظهر سلامة الحاجز الظهاري بواسطة TEER العالي (834 Ω × سم2)و CLSM عن طريق المناعة للبروتين وصلة ض?...

Discussion

هذه الورقة يصف بروتوكول لثقافة 3D المشتركة من الشعب الهوائية المصابة، التي شكلتها الإنسان التليف الكيسي القصبي خط الخلايا الظهارية CFBE41o- والإنسان أحادية الخلية المشتقة خط الخلية THP-1. البروتوكول يسمح بتقييم سلامة الحاجز الظهاري, هجرة الضامة, بقاء البكتيريا, والتهاب, التي هي معايير هامة عند ...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تلقى هذا العمل تمويلاً من برنامج آفاق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي للبحث والتطوير التكنولوجي والبيان العملي بموجب اتفاقية منحة رقم 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - تصميم وتطوير التقانات النانوية المتقدمة للتغلب على الحواجز البيولوجية ومعالجة الأمراض الشديدة. نشكر الدكتورة آنا كوستا والدكتورة جيني جونتك على الدعم الكبير في تطوير الثقافة المشتركة، أولغا هارتفيغ، للتوضيح العلمي، أنيا هونكر، لـ ELISA، بترا كونيغ، جانا ويستهويس والدكتورة كيارا دي روسي على الدعم على ثقافة الخلية، والتحليلات، والمجهر. كما نشكر تشيلسي ثورن على تدقيق مخطوطتنا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseAccutaseAT104
AmpicillinCarl Roth, GermanyHP62.1
CASY TT Cell Counter and AnalyzerOLS Omni Life Sciences-
CellTrace Far RedThermo FischerC34564
Centrifuge Universal 320RHettich, Germany1406
CFBE41o- cells1. Gruenert Cell Line Distribution Program
2. Sigma-Aldrich		1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert
2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mmWorld Precision Instruments, Sarasota, USASTX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSMLeica, Mannheim, GermanyTCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kitsAffymetrix eBioscience, USA15541037
Cytokines Panel I and IILEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)Roche11644793001
D-(+) GlucoseMerck47829
Dako Fluorescence Mounting MediumDAKOS3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo FischerD1306
Epithelial voltohmmeterWorld Precision Instruments, Sarasota, USAEVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, SterileCorning, Amsterdam, Netherlands353181
Fetal calf serumLonza, Basel, SwitzerlandDE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633InvitrogenA-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscleRoche, Mannheim, Germany10127230001
LB brothSigma-Aldrich, GermanyL2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.11140050
P. aeruginosa strain PAO1American Type Culture Collection47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFPAmerican Type Culture Collection10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%EMS DIASUM15710-S
Phosphate buffer solution bufferThermo Fischer10010023
Petri dishesGreiner664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma, GermanyP8139-1MG
Precision Cover GlassesThorLabsCG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibodyBD Transduction Laboratories610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumGibco by Lifetechnologies, Paisley, UK11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)Normax, Portugal5058561
SaponinSigma-Aldrich, GermanyS4521
T75 culture flasksThermo Fischer156499
THP-1 cellsDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)No. ACC-16
Tobramycin sulfate saltSigmaT1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fischer25300054
Tween80Sigma-Aldrich, GermanyP1754

References

  1. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
  2. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
  3. Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
  4. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
  5. Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
  6. Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
  7. Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
  8. Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
  9. Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
  10. Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
  11. Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  12. Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
  13. Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
  14. Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
  15. Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
  16. Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
  17. Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
  18. Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
  19. Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
  20. Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
  21. Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  22. Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
  23. Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  24. Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
  25. Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
  26. Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
  27. Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
  28. Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
  29. Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
  30. Ho, D. -. K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 160 interleukins TEER

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved