JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

استخدمنا بروتوكول أخذ العينات الجيولوجي (coring) لشراء عينات العظام القشرية من حجم موحد لتجارب SRμCT من الجانب الأمامي من femora الإنسان. هذه الطريقة هي الحد الأدنى من التدمير، والكفاءة، والنتائج في العينات أسطواني التي تقلل القطع الأثرية التصوير من الأشكال عينة غير منتظمة ويحسن التصور والتحليل microarchitectural.

Abstract

العظام هي الأنسجة الديناميكية والميكانيكية النشطة التي تتغير في هيكل على مدى عمر الإنسان. وقد درست منتجات عملية إعادة عرض العظام بشكل كبير باستخدام التقنيات التقليدية ثنائية الأبعاد. وقد سمحت التطورات الأخيرة في تكنولوجيا التصوير بالأشعة السينية عن طريق التصوير المقطعي المحوسب المكتبي (μCT) والتصوير المقطعي المحوسب بالإشعاع السنكروترون (SRμCT) بالحصول على فحوصات ثلاثية الأبعاد عالية الدقة (3D) لمجال رؤية أكبر (FOV) من تقنيات التصوير ثلاثية الأبعاد الأخرى (مثل SEM) التي توفر صورة أكثر اكتمالًا للهياكل المجهرية داخل العظام القشرية البشرية. وينبغي أن تركز العينة بدقة داخل FOV، ومع ذلك، للحد من مظهر القطع الأثرية المتتالية المعروفة لتأثير تحليل البيانات. وقد أفادت الدراسات السابقة شراء كتل العظام المستقيمة على شكل غير منتظم التي تؤدي إلى تصوير القطع الأثرية بسبب حواف متفاوتة أو اقتطاع الصورة. لقد طبقنا بروتوكول أخذ العينات الجيولوجية (coring) لشراء عينات من العظم القشري بالحجم باستمرار لتجارب SRμCT من الجانب الأمامي من femora الإنسان. هذا الأسلوب coring هو كفاءة والحد الأدنى من التدمير لالأنسجة. فهو يخلق عينات أسطوانية موحدة تقلل من القطع الأثرية التصويرية بطبيعتها من كونها متساوي القياس أثناء الدوران وتوفر طول مسارًا موحدًا لشعاع الأشعة السينية طوال المسح الضوئي. إن معالجة الصور لبيانات التصوير الشعاعية السينية للعينات ذات الشكل الوصويف والمجسّد بشكل غير منتظم تؤكد إمكانية هذه التقنية لتحسين التصور والتحليل للرقم المجهري للعظام القشرية. هدف هذا البروتوكول هو تقديم طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لاستخراج نوى العظام القشرية التي يمكن تكييفها لأنواع مختلفة من تجارب التصوير العظام عالية الدقة. الهدف الشامل للعمل هو إنشاء شراء عظام كورتيكال موحدة لـ SRμCT بأسعار معقولة ومتسقة ومباشرة. ويمكن أيضاً تكييف هذا الإجراء من قبل الباحثين في المجالات ذات الصلة الذين يقومون عادة بتقييم المواد المركبة الصلبة مثل الأنثروبولوجيا البيولوجية أو العلوم الجيولوجية أو علوم المواد.

Introduction

مع التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير، أصبح من الممكن الآن الحصول على بيانات التصوير بالأشعة السينية بدقة عالية جداً. أجهزة التصوير المقطعي الصغرى لسطح المكتب (μCT) هي المعيار الحالي لتصوير العظام الملغاة بسبب طبيعتها غير المدمرة1. عند تصوير السمات المجهرية للعظم القشري، ومع ذلك، كان استخدام μCT أكثر محدودية. بسبب قيود الدقة، لا يمكن أن تصل أنظمة سطح المكتب إلى الدقة المطلوبة لصورة ميزات microstructural أصغر من المسام القشرية، مثل الثغرات في الجهاز العظمي. لهذا التطبيق، SRμCT مثالية نظراً لقرار أكبر من هذه الأنظمة1. على سبيل المثال، أنتجت التجارب في "مصدر الضوء الكندي" (CLS) على خطوط الشعاع البيولوجية الطبية للتصوير والعلاج (BMIT)2 صورًا ذات voxels صغيرة مثل 0.9 ميكرومتر. الدراسات السابقة1,3,4,5 استخدمت هذا القرار للحصول على الإسقاطات ولاحقة ثلاثية الأبعاد (3D) يجعل من عينات العظام القشرية من العظام الطويلة البشرية ( الشكل1) لتحديد كثافة الثغرات في العظام4,6,7,8,9 والاختلاف في شكل الثغرات والحجم3 عبر عمر الإنسان وبين الجنسين. وقد أظهرت دراسات أخرى وجود عصابة أوستيون في البشر10، وهي ظاهرة معترف بها سابقا أن تكون مرتبطة فقط مع الثدييات غير البشرية في الأدب الأنثروبولوجيا الطب الشرعي.

من أجل تحقيق قرار استثنائي، يجب أن تكون تركيز شعاع الأشعة السينية بدقة داخل مجال الرؤية (FOV)، والذي غالبا ما يحد من حجم العينة القصوى إلى بضعة ملليمترات في القطر. في الوقت الحالي، لا توجد إجراءات شاملة وموحدة موصوفة في المؤلفات التي تحدد شراء عينات العظام التي تفي بهذه القيود. تمركز العينات داخل FOV أمر بالغ الأهمية لضمان أن 1) العينة لا تزال مركزة لأنها تدور 180 درجة أثناء التصوير، و 2) القطع الأثرية المسح محدودة لأنه لا يوجد اقتطاع صورة. وبعبارة أخرى، لا تتداخل أي أجزاء من العينة خارج FOV مع الشعاع الذي يدخل نقطة الاتصال داخل FOV. إذا حدث ذلك، يتم حرمان خوارزمية إعادة البناء من بعض بيانات التوهين اللازمة لإعادة بناء صحيحة تماماً. ومن الجدير بالذكر كذلك أن 360 درجة (دوران كامل) بمسح يقلل من آثار تصلب شعاع ولكن زيادة القطع الأثرية الناجمة عن سوء المحاذاة وحركة العينة أثناء التصوير. وهكذا، في حين أن المسح الضوئي 360 درجة عادة ما تولد بيانات أنظف، يتم مضاعفة وقت التصوير، وبالتالي يجب معالجة حل وسط بين التكلفة التجريبية وجودة البيانات.

جانب مهم وغالبا ما يغفل من تجارب تصوير العظام هو دقيقة وقابلة للتكرار تقنية إعداد العينة التي أجريت قبل المسح الضوئي. تشير الدراسات التي تدمج أساليب SRμCT في تجاربها بإيجاز إلى بروتوكول أخذ العينات، ولكن المؤلفين يقدمون القليل من التفاصيل أو لا يقدموا أي تفاصيل حول المنهجية المعينة المستخدمة لجمع عيناتهم. العديد من هذه الدراسات تذكر قطع كتل العظام المستقيمة من أبعاد التعسفي، ولكن عموما لا تقدم المزيد من المعلومات حول الأدوات أو تضمين المواد المستخدمة3،4،10،11،12،13،14. يستخدم بعض الباحثين عادة أدوات دوارة محمولة (على سبيل المثال ، Dremel) لإزالة كتل العظم المستقيم من منطقة ذات أهمية (ROI)3،4،10،11،12،13،14. ينتج هذا الأسلوب في نماذج غير ذات حجم غير مُتّمَسَر قد تكون أكبر من FOV، مما يزيد احتمالية مسح artifacts و اقتطاع الصورة. وكثيراً ما تتطلب هذه العينات المزيد من التكرير باستخدام منشار دقيق منشار الماس ويفر (مثل بوهلر إيسميت). 10 - إن شراء عينات ذات أبعاد متسقة (إلى مئتين/مم) أمر بالغ الأهمية لضمان أن تكون مجموعات البيانات المكتسبة على أعلى مستوى من الجودة وأن تكون النتائج اللاحقة قابلة للتكرار.

ويضيف الإبلاغ المحدود عن منهجية الشراء العينية طبقة إضافية من الصعوبة عند محاولة استخدام و/أو التحقق من الأساليب التي تم تنفيذها في دراسة سابقة. وفي الوقت الحالي، يجب على الباحثين الاتصال بواكّبهم مباشرة للحصول على مزيد من التفاصيل حول إجراءات أخذ العينات الخاصة بهم. البروتوكول المفصل هنا يوفر للباحثين في الطب الحيوي تقنية أخذ العينات الموثقة تمامًا وقابلة للتكرار وفعالة من حيث التكلفة. الهدف الأساسي من هذه المقالة هو توفير برنامج تعليمي شامل حول كيفية شراء عينات جوهر العظام القشرية ذات الحجم الثابت باستخدام ضغط مطحنة الحفر والماس coring بت للتصور الدقيق واستخراج البيانات microarchitectural. يتم تعديل هذه الطريقة من الإجراءات المستخدمة لجمع بشكل روتيني موحد، صغيرة القطر (1-5 ملم) اسطوانات من كتل من المواد الصلبة في الميكانيكا الصخور عالية الضغط15،16،17،18،19.

Protocol

تم الحصول على جميع العينات من المتبرعين كادافيك المحنطة في جامعة توليدو، كلية الطب وعلوم الحياة وجامعة شمال شرق أوهايو الطبية (NEOMED)، مع الموافقة المستنيرة من المانح نفسه أو أقرب الأقارب للمتبرع. وقد اعتبر مجلس الاستعراض المؤسسي لحماية الأشخاص التابع لجامعة أكرون هذه العينات معفاة من المراجعة الكاملة لمجلس الهجرة واللاجئين لأنها لم تُشتر من الأفراد الأحياء. وأتيحت لجميع المانحين معلومات ديموغرافية تشمل السن والجنس وسبب الوفاة. لم يكن لدى الأفراد المختارين حالات موثقة تؤثر على العظام ولا التعرض لنظم العلاج التي قد تكون أثرت على إعادة تشكيل العظام في وقت الوفاة. تم الحصول على عينات العظام القشرية من الفيمورا من الذكور والإناث الحديثة كادافيريك مع الأعمار تتراوح بين 19 إلى 101 سنة من العمر (متوسط = 73.9 سنة). وقد درست منتصف الهيكل الفخذي على نطاق واسع بما في ذلك فحوص الاختلاف في المسامية القشرية20،21،22،23،24 وكثافة المواد من الأنسجة العظمية25،26،27، وهكذا أصبح موقعا يستخدم عادة للتحليلات microstructural.

1. الأنسجة المشتريات وMaceration

  1. استخدام المنشار المتذبذب مجهزة يغرق قطع شفرة كربيد (للمواد المركبة) لشراء ~ 7.5 سم كتل العظام من منتصف diaphyses من الفخذ الأيسر.
  2. نقع كتل الفخذ في طبق زجاجي آمن بالفرن مليء بأنزيم البروتياز المجفف ومحلول مياه الصنبور لمدة 1 ساعة في ح ح ح في ح ح مجموعة في 45 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة، وإزالة بعناية أي الأنسجة الرخوة المتبقية و periosteum باستخدام تشريح حادة أو أدوات الأسنان.
    ملاحظة: تجنب استخدام أدوات حادة (مثل مشرط) لإزالة الأنسجة الرخوة. قد تسبب هذه الأدوات تلفًا للعظم يمكن اكتشافه في عمليات المسح بالميكت، مما يؤثر على حفظ العينات وجودة بيانات المسح الضوئي.
  4. إزالة الحطام أو انسداد في تجويف النخاع عن طريق وضع كتل العظام في نظافة بالموجات فوق الصوتية لمدة 5-10 دقائق مع 20:1 أجزاء مياه الصنبور إلى محلول التنظيف (انظر جدول المواد) أو باستخدام خيط الماء المحمولة (على سبيل المثال، Waterpik).
  5. تزج كتلة العظام في كوب عينة وملء مع 70٪ الإيثانول. السماح للعظم لنقع لمدة 24 ساعة على الأقل لإزالة الدهون.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم إكسيلين لإزالة الدهون. ومع ذلك، قد يجعل التمرن الممتد في الزيلينات العظم هشًا أو طباشيريًا لأنه مستحلب.
  6. بعد 24 ساعة، وإزالة كتل العظام من الإيثانول والسماح للهواء الجاف في درجة الحرارة المحيطة لمدة 24-48 ساعة.
    ملاحظة: قد يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

2. تقسيم الأنسجة

  1. ضع شريحة مجهر زجاجي 75 × 25 مم على لوحة ساخنة من المقرر أن تكون 140 درجة مئوية. تذوب كمية سخية من راتنج الايبوكسي الحراري (انظر جدول المواد)على وسط الشريحة.
    1. إذا كان إعداد أقسام رقيقة إضافية للمجهر (<50 ميكرومتر)، قد تحتاج كتلة العظام إلى أن تكون جزءا لا يتجزأ من الايبوكسي من جزأين للحفاظ على trabeculae. علاوة على ذلك، عند تنفيذ هذا البروتوكول للعينات الهشة (على سبيل المثال، العظام الزوغينية أو العينات ذات المنظار العالي) من الضروري تضمين العينات في الايبوكسي.
      ملاحظة: تم استرجاع عينات العظام المستخدمة في هذا البروتوكول من عينات كادافيريك المحنطة. إذا تم جمع عينات جديدة عند التشريح أو من حالة جراحية لفحص هياكل الأنسجة الرخوة (مثل، الأوعية الدموية) عن طريق SRμCT، قد يسبب التشريب مع الايبوكسي تلف هذه الأنسجة. في هذه الحالات، ويوصى لاصقة بديلة أو تركيب المتوسطة (على سبيل المثال، الشريط على الوجهين، والطين النمذجة).
  2. اضغط على الجانب السفلي من كتلة العظام في راتنج الايبوكسي الحراري على شريحة المجهر ، مع طول عمودي العظام على الشريحة. قم بتحول العينة ذهاباً وإياباً من أجل اغطية الجانب السفلي من العظم وضمان التصاق آمن بالشريحة.
  3. السماح للعينة التي شنت بقية على لوحة ساخنة لمدة 5 دقائق ~ للسماح الايبوكسي الحرارية إلى الفتيل في المسام و / أو الشقوق.
    ملاحظة: يجب أن يكون الايبوكسي على الشريحة خالية من فقاعات للحصول على أفضل الالتصاق. لإزالة الفقاعات، قم بتحويل العينة للخلف والخلف على الشريحة. فقاعات غالبا ما تشكل بسبب الماء و / أو الإيثانول المحاصرين داخل العظام الهروب والتبخر.
  4. إزالة الشريحة مع العينة التي شنت من لوحة ساخنة باستخدام ملقط حادة والسماح لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة تقريبا. إزالة أي الايبوكسي من حافة الشريحة باستخدام شفرة حلاقة لضمان تشاك قبضة كافية الشريحة.
  5. إرفاق الشريحة مع العينة الملتزم بها إلى شريحة الزجاج تشاك وجبل تشاك إلى ذراع دوارة من رأى قسم بطيئة السرعة (انظر جدول المواد، الشكل 2).
    ملاحظة: في حين أن منشار بوهلر IsoMet كان يعمل في هذا البروتوكول، فإن مناشير اقسام دقيقة أخرى متاحة يمكن استخدامها بدلاً من IsoMet (على سبيل المثال، Leco، Exakt، Smartcut، CT3، بوهلر بيتروتين، بئر الماس واير).
  6. اضبط ذراع الدوران باستخدام قرص تحديد المواقع لضمان اتصال النصل و احرف العينة. ضع العينة بحيث يتم قطع مقطع عامودي من العظم على طوله.
  7. إضافة الأوزان إلى الجانب البعيد من الذراع قطع لمواجهة وزن الذراع.
    ملاحظة: إذا تم استخدام وزن موازن غير كاف، قد تتحمل العينة أسفل على النصل وتسبب كسر النصل.
  8. إضافة قطع السوائل (20:1 أجزاء الماء لقطع السوائل) إلى وعاء السوائل من المنشار.
  9. تأمين بإحكام شفرة رقاقة الماس وضمان مستوى السوائل غمر الجزء قطع من النصل. تعيين السرعة إلى 200 دورة في الدقيقة وخفض ببطء العينة على شفرة (الشكل 3).
  10. ضمان شفرة وتشاك ليست المتذبذبة و / أو كذاب. إذا لوحظت الحركة المفرطة، فورا وقف المنشار وتشديد النصل و / أو تشوك تجمع الذراع قبل استئناف القطع. إضافة الأوزان الموازن إضافية إذا كان تشاك يتحرك بقوة صعودا وهبوطا. قد تؤدي الحركة المفرطة بما في ذلك الحركة الجانبية إلى الجانبية المرئية إلى كسر الشفرة.
  11. القسم السميك الأول هو "قطع النفايات" لتوفير سطح محدد بشكل جيد بالتوازي مع كل قطع إضافي. بعد قطع النفايات الأولية، رفع ذراع دوارة وتحريك تشاك نحو شفرة 5 ملم باستخدام قرص تحديد المواقع. ويمكن أيضا أن يتم جمع أقسام إضافية سميكة (~ 1 مم) للمجهر مع هذه الطريقة.
    ملاحظة: من أجل حفظ الأنسجة القيمة، يمكن حذف قطع النفايات. عند تقسيم عينة مع حافة متفاوتة، ومع ذلك، فمن الأهمية بمكان أن تكون ذروة العينة اصطف بشكل عرضي إلى حافة بت الحفر الحفر.
    1. تأكد من حساب لتكف شفرة عند قسم. على سبيل المثال، للحصول على مقطع 5 مم من شفرة التي لديها كيرف من 0.5 ملم، حرك العينة وتشاك 5.5 ملم نحو شفرة.
  12. بعد اكتمال القسم ، ضع الشريحة الزجاجية مع العينة المثبتة على لوحة ساخنة لإذابة الايبوكسي الحراري. وهذا يسمح لإزالة سريعة من كتل العظام من الشريحة.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

3. عينة coring

  1. جبل 5 ملم أقسام العظام إلى الجزء السفلي من القصدير الألومنيوم الضحلة (~ 8 سم في القطر) باستخدام تقنية الربط الايبوكسي الحرارية كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.4.
  2. ضع القصدير على طاولة آلة XY من الصحافة طاحونة الحفر (انظر جدول المواد)واليد تشديد المثبت المشابك(الشكل 4).
  3. إدراج 2 ملم الداخلية قطرها جوفاء رمح صائغ الماس يميل الحفر بت (انظر جدول المواد)إلى تشاك طاحونة الحفر. ضبط محدد العمق لمنع coring من خلال القصدير (الشكل 5).
  4. محاذاة الجانب الأمامي المركزي من العينة العظام تحت بت الحفر مع تجنب الاتصال الوثيق مع إما المناطق الداخلية، الضمان، أو المناطق trabecularized للغاية.
    ملاحظة: الاختيار الآلي للقشرات الفخذية الأمامية المتوسطة غير ممكن لأن سمك القشرية يختلف بين الأفراد، خاصة مع زيادة العمر.
  5. ملء القصدير مع الماء المقطر لتغطية العينة تماما. وهذا يمنع تراكم الحرارة، وحرق العينة، و / أو تلف بت الحفر أثناء الحفر.
    ملاحظة: لتقييم إمكانية تلف الحرارة الناجمة عن الوراق، تم استخدام مقياس حرارة الأشعة تحت الحمراء لتحقيق قراءات درجة الحرارة من الماء المقطر كما أن بت الكورينج اخترقت سطح العظام لأول مرة. تباينت درجة الحرارة بمقدار 1 درجة مئوية، من 22.9 إلى 23.9 درجة مئوية بين العينات العشر التي تم تصميمها لهذا الاختبار. وهكذا، فإننا نجادل بأن الضرر الناجم عن الحرارة لا يكاد يذكر.
  6. في الحالات القليلة الأولى من الاتصال بين بت الأساسية والعظام، وتطبيق ضغط لطيف من أجل ارتداء حلقة على السطح متفوقة من العظام. وهذا يمنع انحراف بت الحفر في بداية عملية الضم ويضمن الموضع الصحيح للبت.
  7. أثناء التمرن، ارفع جزء الحفر داخل العينة وخارجها مع الحفاظ على طرف البتة تحت سطح الماء. مواصلة هذه التقنية كل بضع ثوان لطرد تراب العظام المحاصرين وضمان الحطام لا يحاصر بت الحفر.
    ملاحظة: إذا كان جوهر هو تشكيل شكل مخروطي، فمن المرجح أن يرجع إلى 1) السماح الوقت غير الكافي لطرد غبار العظام من بت coring، و 2) يتم قطع بسرعة كبيرة جدا. زيادة السرعة قد كسر قطع كبيرة من العينة وسحق الجانب متفوقة.
  8. بعد اكتمال الوَرَك، قد يصبح قلب العظام الناتج قد استقر في بت الحفر المجوف(الشكل 6). استخدام زوج من ملقط غرامة يميل أو وجع ألن صغيرة لطرد الأساسية من بت (الشكل 2).
  9. تخزين العينة cored في أنبوب microcentuge المسمى في مكان بارد وجاف حتى التصوير.

4. روتين معالجة الصور لتقييم المعلمات microarchitectural العظام من قلب العظام القشرية

  1. إعادة بناء صور ميكروت
    1. تحميل وتثبيت أحدث نسخة NRecon في https://www.bruker.com/products/microtomography.html لإعادة بناء الصور SRμCT الإسقاط.
    2. حدد اختصار NRecon على سطح المكتب وسيظهر GPUReconServer المقترن.
    3. افتح مجموعة البيانات المطلوبة في الإطار المنبثق. إذا لم يظهر الإطار، حدد رمز المجلد في الزاوية العلوية اليمنى من إطار "مُشاهد البيانات".
    4. حدد الإسقاط الأول من عملية الاستحواذ على SRμCT. ضمن الإخراج، قم بإزالة التحديدات الخاصة باستخدام عائد الاستثمار والمقاييس على.
    5. اختر وجهة ملف إعادة البناء. حدد استعراض وإنشاء مجلد جديد يسمى ريكون. يجب أن يكون تنسيق الملف المحدد BMP(8).
    6. التحقق من تعويض عدم المحاذاة.
      ملاحظة: غالباً ما يكون هذا التقدير قريباً من التصحيح. يمكن ضبط التجسيد ثلاثي الأبعاد التقريبي يدويًا عن طريق تحريك الأسهم لأعلى ولأسفل لتحويل الصور المتداخلة بحيث تتحاذى الحواف اليمنى واليسرى بأكبر قدر ممكن.
    7. ضمن إعدادات، اختر التحديدات المطلوبة لتطبيق النعومة، و التصّد الحزمة ، CS Rotation ، كائن أكبر من FOV ، وخوارزميات القطع الأثرية الدائرية.
    8. اضبط الرسم البياني ضمن الإخراج عن طريق تحديد تلقائي.
      ملاحظة: قد تكون الصورة الناتجة خافتة.
    9. حدد بدء لبدء معالجة إعادة البناء.
    10. استخدام التسميات القياسية للقناة / مؤشرات الثغرات في العظام28. وقد تشمل هذه الكميات: إجمالي حجم أنسجة VOI (TV)، وحجم القناة (Ca.V)، والعدد الإجمالي للقناة (Ca.N)، ومتوسط قطر القناة (Ca.Dm)، والمسامية القشرية (Ca.V/TV)، التي تُعطى كنسبة مئوية، والعدد الإجمالي للثغرات (N.Lc)، ومتوسط حجم الثغرات (Lc.V)، من بين أمور أخرى. لتحديد كثافة الثغرات لكل مم3 (N.Lc/BV)، يتم حساب حجم العظام (BV) على أنه الحجم الإجمالي ناقص حجم القناة (TV-Ca.V).
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
  2. جمع بيانات التارخية الدقيقة من الصور المعاد بناؤها
    1. تحميل وتثبيت أحدث إصدار من CTAnalyser في https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html لتحليل المعلمات microarchitectural.
      ملاحظة: الإصدار المجاني من CTAnalyser محدود في الأداء الوظيفي. لذلك، فمن المستحسن لشراء رخصة كاملة لإجراء تحليلات أكثر تفصيلا.
    2. تحت | الصورة | العقارات تغيير حجم البيكسل، تأكد من أن حجم البيكسل يطابق حجم بروتوكول التصوير المُطبَّق للميكت.
      ملاحظة: إذا تحرير الصور في ImageJ أو برنامج مشابهة، لاحظ أنه عند الحفظ، سيتم تعديل رأس المضمنة في ملف TIFF و برنامج التحليل سوف يغير حجم البكسل عند استيراد مجموعة البيانات.
    3. حدد معالجة مخصصة لإنشاء قائمة مهام (راجع المواد التكميلية) لتحليل المجهر العظمي من مجموعة البيانات المسح الضوئي. بروتوكول عام للمعايير شبكة الثغرات osteocyte باستخدام الإضافات الملكية لCTAnalyser يلي هنا:
      ملاحظة: تعمل قائمة المهام الملحقة بشكل جيد لمجموعات البيانات حيث تكون العينة هي الموضوع الوحيد المرئي في FOV. إذا كانت المساحة الفارغة تحيط بالعينة، فإن تطبيق عائد الاستثمار مطلوب. وإلا، سيتم تقليل القيم التي تم جمعها في التحليل ثلاثي الأبعاد وتحليل الكائنات الفردية بشكل مصطنع.
      1. إعادة تحميل الصور لإعادة تعيين و / أو ضبط أي تعديلات (على سبيل المثال، من التحرير في ImageJ أو ما شابه ذلك) قبل فتح القائمة معالجة مخصصة في برنامج التحليل.
      2. لتقليل الضوضاء في الصور، قم بتطبيق فلتر غاوسي منخفض التمرير في مساحة ثلاثية الأبعاد مع نواة مستديرة ونصف قطرها 2-3.
        ملاحظة: تم تطبيق هذه الإعدادات على مجموعات البيانات من تجارب SRμCT التي تم الإبلاغ عنها من خلال اختبار التجربة والخطأ. وكان الهدف هو الحصول على أفضل نوعية إعادة البناء للبيانات. ضبط إعدادات إعادة البناء لتناسب كل إعداد تجريبي فريد.
      3. تطبيق عتبة تدرج الرمادي العمومي على الصور عن طريق تحديد القيم المنخفضة والعالية لتسليط الضوء على قنوات الأوعية الدموية. والشرائح التي أعيد بناؤها التي شوهدت في الشكلين 8B و 8D تصور عتبة مثال من 0-155.
        ملاحظة: مماثلة إلى الخطوة 4.2.3.2، تم اختيار إعدادات العتبة المطبقة هنا من خلال تجربة شاملة والخطأ. وينبغي تعديل العتبة لكل نظام تجريبي للتصوير المُستخدم في كل من الميكت.
      4. Despeckle (denoise) لإزالة البقع البيضاء في الفضاء 3D التي تقع ضمن حجم بكسل (voxel) حجم الثغرات في العظام من أجل عزل القنوات فقط.
        ملاحظة: بالنسبة لمسح SRμCT للعظام القشرية البشرية التي تم التقاطها بحجم 0.9 ميكرومتر بكسل، فإن الحد الأدنى لثغرات العظم هي 13 voxels.
      5. Despeckle لإزالة أي بقع سوداء في الفضاء 2D لإزالة القطع الأثرية في القنوات. يمكن أن تكون هذه كبيرة جدا في 2D، وبالتالي إزالة الميزات التي هي < 15،000 بكسل.
      6. تمدد المسام في الفضاء ثلاثي الأبعاد باستخدام وظيفة التشغيل المورفولوجية مع نواة مستديرة من نصف قطر 2 أو 3 ، اعتمادًا على جودة الصور ، من أجل عزل أي أنسجة لينة محاصرة في القنوات.
      7. تنفيذ دالة Despeckle إضافية باستخدام نفس الإعدادات كـ الخطوة 4.2.3.5. من أجل إزالة الأنسجة الرخوة المعزولة داخل القنوات.
      8. تآكل تمدد من الخطوة 4.2.3.6. باستخدام وظيفة عملية مورفولوجية باستخدام نواة مستديرة مع إما 2 أو 3 نصف قطرها. يجب أن تتطابق نصف القطر لهذه الخطوة نصف القطر المستخدم في الإجراء 4.2.3.6.
      9. قم بتشغيل التحليل ثلاثي الأبعاد وحدد المعلمات التي يجب حسابها لحجم القنوات الوعائية. عموما، سوف توفر القيم الأساسية معلومات كافية.
      10. حفظ الصور المعالجة باستخدام الصور النقطية حفظ في مجلد فرعي مخصص في الدليل.
        ملاحظة: إذا خلق صورة إعادة الإعمار 3D من الصور المعالجة باستخدام برنامج مثل أميرة / أفيزو، Dragonfly، دريشتي، الخ. ، حفظ الصور أحادية اللون (بت 1) ويوصى.
      11. احسب عدد قنوات الأوعية الدموية واصف حجمها وشكلها واتجاهها باستخدام وظيفة تحليل الكائنات الفردية.
      12. كرر الخطوات 4.2.3.1 - 4.2.3.3. لإعادة تعيين الصورة لتحليل الثغرات في العظام.
      13. إزالة البقع البيضاء في الفضاء 3D باستخدام وظيفة Despeckle، وضمان أن هذه القطع الأثرية هي أصغر من الحد الأدنى لحجم الثغرات. تزيل هذه الخطوة الضوضاء من الفحص الذي قد يبدو أنه مسام القشرية، مع الحفاظ على الثغرات الحقيقية في العظم. بالنسبة لمسح SRμCT البشري بحجم 0.9 ميكرومتر بكسل، يكون هذا الحد الأدنى هو 13 voxels.
      14. Despeckle مرة أخرى لإزالة البقع البيضاء التي هي أكبر من الحد الأعلى لحجم الثغرات. بالنسبة لمجموعات البيانات SRμCT البشرية مع الإعدادات المدرجة في الخطوة 4.2.3.13، يكون هذا الحد هو 2743 voxels.
      15. إجراء تحليل ثلاثي الأبعاد لاستخراج المعلومات microstructural المتعلقة بثغرات العظم على وجه التحديد.
      16. حدد حفظ الصور النقطية لحفظ الصور المعالجة من أجل عزل الثغرات في أوستيوسيت.
      17. إجراء تحليل كائن فردي لحساب عدد من osteocytes في 3D ضمن حجم الفائدة المحدد (VOI).
        ملاحظة: بمجرد إنشاء قائمة المهام واختبارها، فإن CTAnalyser لديه وظيفة مدير الدفعات (BatMan) التي يمكن استخدامها لتسريع استخراج البيانات وضمان معالجة الصور الموحدة. قائمة مهام مع إعدادات المثال للإجراء 4.2.3. يمكن العثور عليها في المواد التكميلية.

النتائج

11 - وقد ثبت أن الطريقة الموصوفة لأخذ العينات الأساسية تتسم بقدر كبير من الفعالية والكفاءة. سمحت عينات الCoring باستخدام هذا البروتوكول بشراء > 300 عينة ذات حجم ثابت للتجارب على خط شعاع CLS BMIT-BM2، مع FOV من ~ 2 مم في حجم فوكسل 1.49 ميكرومتر. للتحقق من اتساق القطر الأساسي، تم أخذ ثلاثة قياسات ...

Discussion

لم يكن هناك بروتوكول شامل وموحد لشراء عينات من اللبات العظمية القشرية الموحدة والاسطوية للتصوير SRμCT عالي الدقة مع أجهزة FOV محدودة. البروتوكول مفصلة هنا يملأ هذا الفراغ من خلال توفير البرنامج التعليمي الشامل بشأن كيفية شراء باستمرار الحجم عينات العظام الأساسية القشرية للتصوير SRμCT والتصو?...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد أجريت البحوث الموصوفة في هذه الورقة في مرفق BMIT في المصدر الضوئي الكندي، الذي تدعمه المؤسسة الكندية للابتكار والعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا، وجامعة ساسكاتشوان، وحكومة ساسكاتشوان، وغرب كندا لتنويع الاقتصاد، والمجلس الوطني للبحوث الكندية، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية. الكتاب يود أن يشكر العلماء في شعاع مصدر الضوء الكندي ، ولا سيما آدم ويب ، دينيس ميلر ، سيرجي Gasilov ، ونينغ زو للمساعدة في إعداد واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من أنظمة SRμCT وSRμCT شعاع أبيض. كما نود أن نشكر بيث دالزيل من كلية الطب وعلوم الحياة في جامعة توليدو والدكتور جيفري وينستروب من جامعة أوهايو الطبية الشمالية الشرقية على الحصول على عينات كادفيكريك لهذه الدراسة. يتم دعم JM Andronowski من خلال صناديق الأبحاث الناشئة التي تقدمها جامعة أكرون والمعهد الوطني لبحوث العدالة والتنمية في مجال علوم الطب الشرعي لأغراض العدالة الجنائية منحة (2018-DU-BX-0188). يتم دعم RA ديفيس من قبل مساعد الدراسات العليا التي تقدمها جامعة أكرون. تم شراء المعدات واللوازم المستخدمة في التعبئة و الانتشار من خلال أموال بدء التشغيل المقدمة من جامعة أكرون و NSF منحة EAR-1624242 إلى CW Holyoke.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-1/8" plunge cutting carbide for compositesWarrior6181228.6mm plunge
70% EthanolFisher ScientificBP82015003.8 Liters
Blunt-tipped forcepsFisher Scientific10-300
Centrifuge tubesThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 EpoxyTed Pella821-3
CTAnalyserBruker microCTv.1.15.4.0Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Dental Tool KitAmazon787269885110
Diamond wafering saw blade for composite materialBuehler#11-4247
Drill PressJet Mill/Drill350017Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem
Fine-tipped forcepsFisher Scientific22-327379
Fixturing clamps for XY machine table for mill/drillMSC Industrial Supply#04804571
Glass microscope slidesTed Pella2600575x50mm slides, 1mm thick
Glass slide chuckBuehler#112488Large enough to hold 75x50mm glass slides
Hot plate capable of reaching 140 °CThermoScientificHP88850105
IncubatorNAPCOModel 4200
Isocut FluidBuehler111193032Lubricant; 30mL
Jeweler's diamond coring drill bitOtto Frei#119.0502mm inner diameter hollow stem coring bit
NReconBruker microCTv.1.6.10.2Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html
Oscillating sawHarbor Freight62866
Oven-safe glass dishesPyrex1117715Glass food storage container
Precision slow-speed saw (Isomet 1000)Buehler111280160
Razor bladesAmazon25181
Shallow aluminum tinsAmazonB01MRWLD0R~8cm diameter
Specimen cupsAmazon616784425436 885334344729
Tergazyme detergentAlconox1304-11.8kg box
Ultrasonic cleanerMTI CorporationKJ201508006

References

  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
  3. Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
  4. Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
  5. Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
  6. Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
  7. Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
  8. Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
  9. Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
  10. Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
  11. Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
  12. Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
  13. Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
  14. Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
  15. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
  16. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
  17. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
  18. Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
  19. Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
  20. Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
  21. Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
  22. Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
  23. Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
  24. Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
  25. Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
  26. De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
  27. Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
  28. Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
  29. Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
  30. Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
  31. Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
  32. . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
  33. Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
  34. Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved