تحسين تقنية الكفة لزراعة القلب مورين

Summary

نقدم نهج أنبوب داخلي لتقنية الكفة لزراعة القلب غير الرحمي الماوس لمساعدة إيفرت السفينة على الكفة. وجدنا أن التعاون بين اثنين من الجراحين ذوي الخبرة بشكل ملحوظ يقصر وقت العملية.

Abstract

تم إجراء عملية زرع القلب مورين لأكثر من 40 عاما. مع التقدم في الجراحة المجهرية ، تم استخدام تقنيات جديدة معينة لتحسين الكفاءة الجراحية. في مختبرنا، قمنا بتحسين تقنية الكفة مع خطوتين رئيسيتين. أولاً، استخدمنا تقنية الأنبوب الداخلي لإدخال أنبوب داخلي مؤقت في الوريد الوداجي الخارجي والأوعية الدموية الشريان السباتي لتسهيل تحويل الوعاء على الكفة. ثانيا، قمنا بزراعة القلب غير الرحمية بالكامل من خلال تعاون جراحين من ذوي الخبرة. وقد خفضت هذه التعديلات بشكل فعال وقت التشغيل إلى 25 دقيقة، مع نسبة نجاح 95٪. في هذا التقرير، نحن وصف هذه الإجراءات بالتفصيل وتقديم فيديو إضافي. ونحن نعتقد أن هذا التقرير عن تحسين تقنية الكفة سوف تقدم التوجيه العملي لزرع القلب غير الرحمي المورين، وسوف تعزز فائدة هذا النموذج الماوس للبحوث الأساسية.

Introduction

وكان إنشاء زرع القلب الماوس غيريروتوبيك من خلال نهاية إلى نهاية anastomosis داخل البطن في عام 1973 معلما رئيسيا في البحوث الأساسية مناعة زرع¹. قدم هذا النموذج أداة هامة وصالحة لتحليل آليات الإقفار إصابة², رفض مناعي , و التسامح^3,4. ومع ذلك، فإن الطبيعة المعقدة والمستهلكة للوقت للجراحة وكذلك احتمال الإصابة بالعدوى يمكن أن تؤدي إلى الالتصاقات البطنية الحادة حول العملية وردود الفعل الالتهابية، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة نموذج زرع القلب غيريروتوبيك.

وقد وصفت تقنية زرع القلب غير الرحمي عنق الرحم لأول مرة من قبل تشن في عام 1991^5. في هذا النموذج، يتم استنشاق الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي إلى الشريان الرئوي للكسب غير المشروع ويتم استئصال الشريان السباتي إلى الشريان الأورطي الصاعد. المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب هي الراحة للرصد والحد من الصدمة للمتلقي. في نفس العام، وصف ماتسورا تقنية محسنة، حيث تم ثني نهاية الوريد الوداجي الخارجي والشريان السباتي فوق كفة تفلون وثابتة بأربطة حريرية محيطية⁶. كما قام بعض الباحثين بسد الكفة إلى الشريان الرئوي الأيمن في قلب المتبرع قبل إدخال الكفة في الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي⁷. حتى الآن، وقد تم تطبيق تقنية الكفة على نطاق واسع في مختلف نماذج زرع الرّاقي الوعائيّة، بما في ذلك تلك الخاصة بالرئتين^8،الكبد^9،والزرع الكلوي^10.

حتى الآن، هناك العديد من الصعوبات المرتبطة تقنية الكفة. على سبيل المثال، من الصعب على الشريان السباتي إلى إيفرت على الكفة بسبب مرونة إضافية، مما أدى إلى الأنسجة التقليب إلى الوراء. وبالتالي، قد تكون هناك حاجة إلى ممارسة إضافية ومتوسعة مجهرية لإكمال هذه الخطوة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يستغرق إعداد الأوعية العنقية ما يصل إلى 25 دقيقة.

لحل هذه القضايا، نقدم تقنية الأنبوب الداخلي، والتي تعتمد على تقنية الكفة وتشمل تثبيت الكفة على الوريد الوداجي الخارجي والشريان السباتي باستخدام أنبوب داخلي للمساعدة في الإباء من جدار الوعاء. وبالإضافة إلى ذلك، مع التدريب البسيط، يتم تخفيض إعداد المتلقي إلى 15.5 دقيقة. هذه التقنية يقلل من تعقيد العملية ولا تتطلب ممارسة إضافية أو استخدام موسع الأوعية الدموية. ويمكن تطبيقها في جميع البحوث المناعية زرع، وخاصة للتحقق من طرف ثالث التسامح المناعي الذي يتلقى المتلقي اثنين من allografts القلب، واحد داخل البطن والآخر في الرقبة¹¹. كما نوصي بالتعاون بين جراحين ماهرين لإنشاء هذا النموذج، حيث يقوم أحد الجراحين بإعداد الحيوان المتلقي والآخر الذي يقوم بحصاد وزرع قلب المتبرع. ويمكن لهذا التعاون تقصير وقت التشغيل إلى 25 دقيقة. باستخدام هذا الإجراء الأمثل، أنشأنا syngeneic، الزوج^{12،,13،,14،,15،,16،,17،,18،,19،}وxenogeneic فأر زرع القلب نماذج^20.

وكان الأساس المنطقي لتطوير تقنية الأنبوب الداخلي هو تقليل وقت التشغيل لإنشاء نموذج زرع قلب الفأر بمعدل نجاح مرتفع. تحسين نموذج زراعة القلب العنقي يسهل الحصول على معدلات نجاح عالية في فترة قصيرة من وقت الجراحة مقارنة مع تقنية الخياطة التقليدية والكفة²¹. علاوة على ذلك، يمكن لنموذج التعاون تقليل الوقت الإقفار الدافئ للقلب المانح مقارنة بالعمليات الجراحية التي تتم مع مشغل واحد.

Protocol

الحيوانات (BALB / c، C57BL/6، الذكور، 8-12 أسبوعا) يتم إيواء في منشأة محددة خالية من مسببات الأمراض في جامعة شيامن مركز الحيوانات المختبرية. ويستخدم C57BL/6 كمتلقي ويستخدم BALB/c كمتبرع. يتم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (IACUC).

ملاحظة: مجموعة من الأدوات الجراحية الدقيقة، بما في ذلك مقص الصغرى، ملقط مستقيمة الصغرى، ملقط منحنية الصغرى وأصحاب الإبرة الصغيرة، ضرورية للعملية (الجدول والمواد، الشكل 1B، C، D، E). زوج واحد من المشابك البلدغ واحد الاستخدام(الشكل 1F)وهناك حاجة. يتم إعداد الأصفاد اثنين للورد الوداجي الخارجي والشريان السباتي عن طريق قطع أنابيب البولي أميد المخصصة مع مشرط رقم 10 تحت المجهر. قطر الوريد والشريان هو 0.9 مم و 0.55 ملم ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قطر الأنبوب الداخلي للوقي المقابل للرقي هو 0.6 مم ، وهذه من الأنبوب الداخلي للصفة الشريانية المقابلة هي 0.28 مم (الشكل 1G).

1 - إعداد المتلقي

1. تخدير الفأرة المتلقي مع pentobarbital (60 ملغم / كغ ، i.p). استخدام المقصات الميكانيكية الاتراومية لإزالة الشعر في منطقة عنق الرحم الجانبي الأيمن.
2. استخدام قضيب طرف القطن العقيمة لمسح المنطقة الجراحية مع مطهر اليود تليها 70٪ الإيثانول.
3. ضع الماوس في موضع supine على منصة التشغيل. تغطية الماوس مع الشاش العقيمة.
4. استخدم مقصًا لـ ophthalmic لإجراء شق مستعرض من خط منتصف الرقبة السفلي من الثلث إلى مفصل الكتف الترقوة الأيمن.
5. عزل الوريد الوداجي الخارجي الأيمن مع ملقط منحنية صغيرة لفضح ما يكفي من الطول، وقطع الفروع عن طريق التخثر الكهربائي، وligate السفينة في نهاية القعر باستخدام خياطة الحرير 6-0.
6. المشبك الوريد الوداجي الخارجي proximally باستخدام المشبك بلدغ ومن ثم تحويل الوريد proximally إلى الرباط باستخدام مقص صغير.
7. غسل تجويف السفينة مع 100 U/mL 0-4 ° C heparinized المالحة لإزالة أي الدم المتبقية.
8. سحب الوريد الوداجي الخارجي من خلال الكفة الوريدية باستخدام ملقط مستقيمة الصغرى; إدراج الوريد الداخلي أنبوب في التجويف باعتباره الدعامة، و evert جدار السفينة على الكفة مع ملقط مستقيمة الصغرى(الشكل 2A).
9. إصلاح endothelium السفينة everted في الطرف القريب من الكفة باستخدام 8-0 ظرفي خياطة الحرير (الشكل 2B).
10. استخدام ملقط مستقيمة الصغرى لسحب الوريد الداخلي أنبوب من وعاء الوريد.
11. قم بإجراء تشريح حاد مع ملقط منحنية صغيرة لعزل الشريان السباتي الأيمن المجاور للحافة الداخلية للرونميوماستوئي.
12. المشبك الشريان السباتي الأيمن proximally باستخدام المشبك البلدغ، ligate الشريان السباتي distally باستخدام خياطة الحرير 6-0، واستخدام مقص صغير لإعادة تحديد الشريان السباتي proximally إلى الرباط.
13. غسل الشريان السباتي مع 100 U/mL 0-4 درجة مئوية heparinized المالحة لإزالة أي الدم المتبقية.
14. تمرير الشريان السباتي من خلال كفة الشريان وأدخل الشريان الداخلي أنبوب في وعاء الشريان باستخدام ملقط مستقيم الصغرى(الشكل 2C).
15. إيفرت السفينة على الكفة باستخدام ملقط مستقيمة الصغرى; إصلاح endothelium السفينة everted باستخدام circumferential 8-0 خياطة الحرير (الشكل 2D).
16. سحب الأنبوب الداخلي الشريان من وعاء الشريان مع ملقط مستقيمة الصغرى.
    ملاحظة: الحفاظ على الغدة دون المهاوية للمستلم.

2 - إعداد المانحين

1. تخدير الفأر المانح باستخدام pentobarbital (60 ملغم/كغ، i.p). استخدام المقصات الميكانيكية الاتراومية لإزالة الشعر في منطقة البطن.
2. ضع الماوس في موضع supine على منصة التشغيل. تغطية الماوس مع الشاش العقيمة.
3. استخدام قضيب طرف القطن العقيمة لمسح المنطقة الجراحية مع مطهر اليود تليها 70٪ الإيثانول.
4. إجراء شق في منتصف البطن مع مقص العيون وفضح تجويف البطن.
5. استخدام ملقط المنحنية الصغرى لفضح الوريد السفلي cava، ومن ثم حقن عن طريق الوريد 200 ميكرولتر من 100 U/mL 0-4 °C heparinized المالحة لكل 20 غرام من وزن الجسم من خلال الوريد السفلي الكافا.
6. أداء thoracotomy مع مقص العيون، وقطع الأضلاع من خلال شقوق خط منتصف الساكسل الثنائية، الوجه جدار الصدر الأمامي إلى الخارج لفضح تجويف الصدر.
7. اكوس الغدة الصعترية مع ملقط منحنية صغيرة.
8. فضح الشريان الأورطي، ومن ثم 200 μL من 100 U/mL 0-4 درجة مئوية heparinized المالحة إلى الشريان التاجي من خلال القوس الأبهر.
   ملاحظة: تجنب الضخ أي فقاعات الغاز في قلب المانحة.
9. استخدام مقص صغير لتنقص الشريان الأورطي التصاعدي في بداية القوس الأبهري.
10. احول الشريان الرئوي في بداية الفرعين الرئيسيين مع مقص صغير.
11. Ligate فينا كافا متفوقة وسفاح الوريد السفلية cava بالوكالة باستخدام خياطة الحرير 6-0 واستخدام مقص صغير لتنفط الوريد distally إلى الرباط.
12. Ligate الأوردة الرئوية معا، محيطا، وذلك باستخدام خياطة حريري واحد 6-0، وقطع فروع الوريد distally إلى الرباط باستخدام مقص صغير.
13. إزالة الكسب غير المشروع القلب من الأنسجة الرخوة المحيطة بها; الحفاظ عليه في 0-4 درجة مئوية heparinized المالحة.

3. زرع القلب

1. ضع قلب المتبرع رأساً على عقب في منطقة الرقبة اليمنى للمتلقي.
2. أدخل الشريان الرئوي للقلب المانح إلى حلقة حريرية 6-0 مع ملقط مستقيمة صغيرة.
3. التفاف تجويف السفينة حول الكفة الوريد، ومن ثم تشديد حلقات خياطة الحرير 6-0 حول الكفة لتربط مفصل السفينة.
4. إجراء استئصال الشريان الأورطي من الكسب غير المشروع وكفة الشريان باتباع الخطوات الموضحة في الخطوة 3.2.
5. حرر الوريد الوداجي المشبك متبوعاً بالشريان الوداجي المشبك. الحفاظ على السفينة المشتركة untwisted وضمان أن تدفق الدم هو دون عائق.
   ملاحظة: يعتبر إيقاع الجيوب الأنفية العائد إلى أكثر من 200 مرة في غضون 1 دقيقة طبيعي.
6. ترطيب القلب المانح باستخدام ماء ملحي دافئ (37 درجة مئوية) وفحص ما إذا كان الكسب غير المشروع ينزف أم لا. تعيين الكسب غير المشروع القلب النابض في الفضاء تحت الجلد، ومن ثم خياطة شق.

4. الرعاية بعد الجراحة وتقييم الكسب غير المشروع

1. سجل الوقت إلى إيقاع الجيوب الأنفية الطبيعية والحفاظ على إيقاع الجيوب الأنفية الطبيعية لمدة 5 دقائق على الأقل بعد إطلاق المشبك لمراقبة وظيفة الكسب غير المشروع بعد العملية الجراحية.
2. ضع المتلقي وحده على بطانية دافئة حتى يستيقظ المتلقي من التخدير. إدارة مسكة البوبرينورفين، 0.05 ملغم / كغ، s.c، في نهاية الجراحة وكل 12 ساعة لمدة 72 ساعة بعد الجراحة.
3. تسجيل الوزن وحالة الاسترداد بعد العملية الجراحية للمستلم يوميًا. في حالة > 15٪ فقدان الوزن بالنسبة إلى ذلك في تاريخ الجراحة، شلل الشلل العضلي، أو العدوى، euthanize المتلقي عن طريق استنشاق isoflurane محطة²¹.
4. مراقبة البقاء على قيد الحياة الكسب غير المشروع عن طريق الجس يوميا. تعتبر الجراحة ناجحة إذا نجا المورين allograft لمدة >72 ساعة. الصف وظيفة الكسب غير المشروع, كما ذكر سابقا²²: مقياس 3 - نبض بقوة والتردد; الجدول 2 - أقل نبض؛ مقياس 1- الرجفان والرفض الوشيك؛ أو مقياس - 0، وفقدان ضربات القلب والرفض الكامل.

النتائج

وقت العملية الجراحية

بعد التدريب، يمكن للجراح الماهر إجراء العملية بنجاح في غضون 35 دقيقة باستخدام تقنية الأنبوب الداخلي، حيث يلزم حوالي 15.5 دقيقة لإعداد المتلقي، و10.9 دقيقة لإعداد المتبرع، و4.4 دقيقة مطلوبة لمصابي حشرات القلب المانحة. يتم تقليل وقت الإقفار البارد و?...

Discussion

نماذج زرع قلب الماوس هي أدوات مهمة لأبحاث علم المناعة زرع، والأدوات والمواد اللازمة لتقييم الآليات المناعية لهذا النموذج وعدد كبير من الفئران المعدلة الجينات المتاحة. ومع ذلك، فإن التحديات التقنية المجهرية، مثل خياطة السفن والإيجاز، حدت من استخدامها على نطاق واسع. في هذه الدراسة، قمنا ب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artery cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.55 mm,length: 1.0 mm
Artery inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.28mm
Micro curved forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3050	1/8 arc, 0.3-mm tip without a hook
Micro needle holders	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA2050	0.2-mm tip
Micro scissors	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA1050	Straight, blade length: 10 mm
Micro straight forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3060	0.15-mm tip without a hook
Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps	Scanlan International Inc	1001-531	Clamping pressure 20–25 grams
Vein cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.9 mm,length: 1.2 mm
Vein inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.6 mm