JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقيس قياس Flypub السلوكيات التي تعرضها ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster تحت تأثير الإيثانول. يمكن أن يتقن الفحص بسهولة من قبل المجربين على جميع المستويات وتطبيقها على مختلف المحفزات المتبخرة ، مما يسهل تعاطي المخدرات ودراسات الإدمان.

Abstract

اضطراب تعاطي الكحول (AUD) لا يزال مشكلة خطيرة في مجتمعنا. لتطوير تدخلات فعالة للإدمان ، من المهم فهم الآليات العصبية البيولوجية الأساسية ، والتي تحتاج إلى نهج تجريبية متنوعة وأنظمة نموذجية. المكون الرئيسي للمشروبات الكحولية هو الإيثانول ، والذي يسبب تغييرات التكيفية في الجهاز العصبي المركزي والسلوك عند المدخول المزمن. التوعية السلوكية (أي الاستجابات المتصاعدة) على وجه الخصوص تمثل تغييرًا رئيسيًا في التكيف يقوم عليه الإدمان. وقد أجريت معظم الدراسات التوعية السلوكية الناجمة عن الإيثانول في النماذج الحيوانية على تأثير تنشيط locomotor من الإيثانول. ومن الآثار البارزة للإيثانول تثبيط السلوك. ومع ذلك، فإن التوعية السلوكية لتأثير تثبيط الإيثانول ممثلة تمثيلاً ناقصاً. لمعالجة هذه المسألة، وضعنا القول Flypub التي تسمح قياس الزيادة المتصاعدة في أنشطة المغازلة المثبطة على التعرض الإيثانول المتكررة في drosophila melanogaster. هنا ، نقوم بالإبلاغ عن القول السريع التدريجي بما في ذلك تجميع غرف التعرض للإيثانول ، وإعداد محطة القياس ، ومعايير رعاية الذبابة وجمعها ، وتسليم الإيثانول ، والتقدير الكمي لأنشطة المغازلة المثبطة ، ومعالجة البيانات والتحليل الإحصائي. كما يتم توفير كيفية استكشاف الأخطاء وإصلاحها الخطوات الحرجة، والتغلب على القيود وتوسيع فائدتها لتقييم السلوكيات الإضافية الناجمة عن الإيثانول. سوف القول Flypub في تركيبة مع أدوات وراثية قوية في drosophila melanogaster تسهيل مهمة اكتشاف آلية الكامنة وراء التوعية السلوكية الناجمة عن الإيثانول.

Introduction

الكحول هي واحدة من المخدرات الأكثر سهولة والمستهلكة على نطاق واسع في العالم. لديها احتمال كبير لسوء الاستخدام والإدمان. ومع ذلك، فإن الآلية التي تقوم عليها هذه العملية لا تزال مفهومة تماما. الإيثانول يحفز تثبيط، والنشوة، وضعف الإدراك، فرط النشاط، وفقدان التحكم الحركي والرضاعة في الديدان1،ذباب الفاكهة1،2،23،3الفئران4،الفئران5 والبشر6،مما يشير إلى المكونات العصبية البيولوجية المشتركة التوسط آثار الإيثانول من اللافقاريات إلى الثدييات بما في ذلك البشر. تناول الإيثانول المزمن يسبب التكيفات العصبية والتعديلات السلوكية التي تكمن وراء AUD. واحدة من التعديلات هي التوعية السلوكية التي تعرف بأنها الاستجابة المعززة مع التجارب المتكررة من الإيثانول7،8،9 أو غيرها من المواد الإدمانية10،11،12.

على مر العقود ، ركزت الدراسات على التوعية السلوكية الناجمة عن الإيثانول (EIBS) على التأثير المحفز للمحرك ، والذي يستخدم كوكيل لاستجابة بهيجة7،8،9،13. على سبيل المثال ، الفئران أو الفئران المتكررة (كل 24 ، 48 أو 72 ح) إدارة الإيثانول عرض النشاط الحركي المعزز كما يقاس سرعة المشي8،14،1515،16،1717،18،19،20،21. وبالمثل، فإن ذباب الفاكهة يتعرض للتعرض الثاني لبخار الإيثانول 4 ساعة بعد التعرض الأول عرض استجابة locomotor المحسنة كما تقاس سرعة المشي وكذلك22. في حين لا تتوفر معلومات عن الآلية الكامنة وراء EIBS لتأثير محفز ة للمركبات في ذباب الفاكهة ، كشفت الدراسات في الفئران والجرذان عن المكونات الجزيئية والإشارات (على سبيل المثال ، الدوبامين والغلوتامات وأنظمة GABA) وكذلك الركائز العصبية والدائرة (على سبيل المثال ، منطقة tegmental البطنية ، النواة accumbens ، amygdala والقشرة الجبهية) التي تلعب أدوارًا رئيسية لـ EIBS6،9،23.

التثبيط هو تأثير رئيسي من الإيثانول ويؤدي إلى مظاهر السلوكيات التي عادة ما تكون مقيدة. يتم ممارسة تأثير تثبيط على الوظائف الحركية والعاطفية والاجتماعية والجنسية والمعرفية ، والتي قد تؤدي إلى السلوك الجنسي غير اللائق ، والعدوان اللفظي أو البدني والأفعال المتهورة في البشر والنماذج الحيوانية24،25،26،27،28،29. وقد تم التحقيق في تثبيط الإيثانول الناجم ة في النماذج الحيوانية للدراسات الميكانيكية وأنها تشمل الاندفاع الحركي والعدوان في القوارض والقرود وكذلك تثبيط الأعلاف في الديدان6,9,24,28,29,30. لقد أثبتنا أن ذباب الفاكهة يظهر السلوك الجنسي المثبط تحت تأثير الإيثانول31. على وجه التحديد، الذكور البرية من نوع الذباب نادرا ما البلاط الذكور الآخرين دون الإيثانول31 وعندما يفعلون ذلك، كورتس ترفض بنشاط مغازلة الذكور. تحت تأثير الإيثانول، ومع ذلك، الذباب الذكور تظهر المزيد من المغازلة تجاه الذكور الآخرين والمغازل تظهر أقل الرفض، مما أدى إلى تعزيز المغازلة بين الذكور عموما. وتجدر الإشارة إلى أن الذباب يطور التوعية السلوكية لتأثير تثبيط التثبيط على التعرض المتكرر للإيثانول ، والذي يعمل كنظام فريد لدراسة EIBS31،32.

في هذا التقرير، ونحن نصف كيفية إعداد وتنفيذ واستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتحليل القول Flypub والبيانات لدراسة تثبيط الإيثانول الناجم عن والحساسية في ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster. لتوفير فائدته وفعاليته، اختبرنا البرية من نوع كانتون-S (CS؛التحكم في سلالة الذباب) جنبا إلى جنب مع الذباب ناقص في الثيامين α هيدروكسيلاز (tβh) التي توليف octopamine (الزراعة السبوة). OA هو المموّل العصبي الرئيسي في اللافقاريات33،34 ويلعب دورا رئيسيا في تطوير التسامح الإيثانول في الذباب22. ونحن نبلغ هنا لأول مرة أن OA مهم لـ EIBS.

Protocol

ملاحظة: يفصّل قسم البروتوكول الخطوات التحضيرية والفرعية والتحليلية لـ Flypub التي تشمل (1) تجميع الغرفة، (2) رعاية الذبابة وجمعها، (3) إعداد محطة المشاهدة، (4) التعرض للإيثانول، (5) تسجيل التودد وتحليل البيانات، و(6) التحليل الإحصائي. يتم تصوير الخطوات الرئيسية لإجراء القول والتحليل Flypub في سير العمل(الشكل 1).

1- جمعية الغرفة(الشكل 2)

  1. قطع الجزء السفلي من زجاجة دروسوفيلا جولة في علامة 25 مل باستخدام شفرة حلاقة.
  2. جعل حفرة، 5 ملم في القطر، في علامة 50 مل من الزجاجة باستخدام الحديد لحام الساخنة.
    ملاحظة: هذه هي نقطة الوصول حيث سيتم نقل الذباب إلى الغرفة.
  3. قطع ورقة شبكة في دائرة، 54 ملم في القطر، لتناسب في زجاجة دروسوفيلا في علامة 75 مل.
  4. تأمين شبكة في علامة 75 مل من الزجاجة باستخدام الغراء الساخن.
  5. قطع ورقة بلاستيكية البولي في دائرة، 70 ملم في القطر.
  6. إرفاق ورقة بلاستيكية البولي إلى زجاجة في علامة 25 مل (أسفل منطقة مفتوحة المحرز في الخطوة 1.1) باستخدام الغراء الساخن.
  7. الضغط لأسفل باستخدام الأوزان لضمان أن يتم إرفاق جولة البولي بحزم إلى أسفل.
  8. غسل الحانات مع الإيثانول لإزالة أي الروائح وشطف بغزارة لهم عدة مرات تحت الماء المقطر الجاري. يهز الحانات بقوة لإزالة المياه الزائدة.
  9. تجفيف الحانات عن طريق وضعها أفقيا على المناشف الورقية في درجة حرارة الغرفة.

2. يطير الرعاية وجمع

  1. الحفاظ على الذباب على دقيق الذرة القياسية / أجار / السكر / الخميرة الغذاء المتوسطة (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).
  2. جمع الذباب الذكور من يوم واحد إلى يومين في مجموعة من 33، والتي تمثل نقطة بيانات واحدة، تحت ثاني أكسيد الكربون (CO2)التخدير. تأكد من اختيار الذباب مع مورفولوجيا سليمة ووضعها في قارورة الطعام لاسترداد.
    ملاحظة: ذبابتان أقل أو ثلاث ذبابة لكل مجموعة مقبولة. يمكن أن تكون السلوكيات حساسة للإعدادات التجريبية وبالتالي قد يحتاج إجمالي عدد الذبابة لكل حانة إلى تعديل خط طيران التحكم.
    ملاحظة: تأكد من وضع قارورة الطعام على الجانب حتى لا يعلق الذباب المُسَسَسَس َإلى الطعام.
  3. الحفاظ على الذباب في حاضنة 25 درجة مئوية مع ما لا يقل عن 50٪ الرطوبة النسبية و12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورة مظلمة لمدة 2 أيام قبل التعرض للإيثانول.
    ملاحظة:إزالة ثاني أكسيد الكربون أمر بالغ الأهمية للقضاء على أي آثار فسيولوجية أو سلوكية مستحثة من CO2قد تغير الاستجابات الناجمة عن الإيثانول.
  4. استخدام رموز لالأنماط الجينية ذبابة أعمى أو ظروف العلاج إلى المجربين إجراء التعرض الإيثانول وتسجيل السلوكيات المغازلة.
    ملاحظة: تساعد الاختبارات العمياء في القضاء على التحيز التجريبي.

3. محطة اعادة تعيين(الشكل 3A)

  1. قم بإعداد حامل نسخة مع ذراع مركز مرفق على أعلى مقعد في غرفة جيدة التهوية.
    ملاحظة: حامل النسخ غير إلزامي. أي جهاز التدريج الذي يوفر منصة مستوى كافية.
  2. المشبك الذراعين الجانبي إلى موقف، مع كل ذراع ما يقرب من 18 سم من وسط الموقف.
  3. وضع ضوء الفلورسنت على كل ذراع من الوقوف واحد في الوسط.
  4. إرفاق مسجل الفيديو إلى الذراع الوسطى، ما يقرب من 38 سم فوق مركز القاعدة. سيؤدي ذلك إلى تسجيل الحانات من وجهة نظر أعلى.
  5. تغطية قاعدة الموقف مع ورقة بيضاء، مما يساعد على تصور الذباب داكنة اللون لخلق التباين.
  6. خلال يوم التعرض، قم بتشغيل أضواء الفلورسنت والكمبيوتر المتصل بكاميرا الفيديو المرفقة بحامل النسخة(الشكل 3A).
    ملاحظة: توفر شدة الضوء 2100-2200 لوكس نوعية جيدة من السلوكيات المسجلة للتسجيل. ومع ذلك، فإن ظروف الإضاءة المحيطة في المختبر كافية لمراقبة أنشطة المغازلة الناجمة عن الإيثانول.
  7. إعداد العناصر التي سيتم استخدامها للتعرض للإيثانول المبينة في الشكل 3B.
  8. جمع ستة نظيفة، والحانات تجميعها لمجموعة من التجارب وتسمية لهم مع رمز 1 إلى 6.
    ملاحظة: تأكد من وضع الرموز العشوائية على الأنماط الجينية للذبابة أو ظروف العلاج.

4. التعرض للإيثانول(الشكل 3)

  1. نقل بلطف مجموعة من 33 الذكور في غرفة Flypub من خلال ثقب في علامة 50 مل باستخدام قمع صغير.
    ملاحظة: لتقليل الضغط الميكانيكي على الذباب، ضع وسادة الماوس أو أي مادة توسيد تحت الحانة أثناء النقل.
  2. غطي الحفرة بشريط
    ملاحظة: يتم استخدام الشريط لإغلاق الحفرة، ومنع الذباب من الهروب من الحانة.
  3. محاذاة الحانات على خشبة المسرح من 1 إلى 6.
  4. تكييف الذباب إلى الغرفة لمدة 10 دقيقة(الشكل 3D).
  5. ضبط إعدادات الكاميرا بما في ذلك التركيز والتكبير والسطوع، وتسجيل آخر 5 دقيقة من التأقلم لقياس مستوى المغازلة القاعدية.
    ملاحظة: للقضاء على الوهج الناتج عن انعكاس الضوء من حانة، ضع مناديل المختبر (عادةً 4 طبقات أو أقل من سمك 1 مم) في الجزء السفلي من الحانة لضبط الزاوية.
  6. إعداد منصات القطن لتسليم الإيثانول عن طريق قطع وسادة في أربعة أرباع متساوية مع مقص نظيفة ومن ثم تقليم زوايا لجعلها تناسب في طبق بيتري أثناء التأقلم(الشكل 3C).
    ملاحظة: لا تستخدم الأيدي العارية للتعامل مع منصات القطن. استخدام ملقط للتعامل مع منصات القطن لتجنب أي نقل محتمل للروائح.
  7. إضافة وسادة القطن في كل طبق بيتري.
  8. أضف 1 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ إلى كل وسادة قطنية، وتأكد من توزيع محلول الإيثانول بالتساوي على كامل مساحة اللوحة.
  9. تغطية مع مناديل مختبر ذات طبقات مزدوجة لتجنب تبخر الإيثانول السريع.
  10. ضع طبق بيتري الصغير الذي يحتوي على وسادة القطن المنقوعة بالإيثانول ومناديل المختبر ذات الطبقات المزدوجة من خلال الفتحة السفلية للحانة بعد التأقلم.
  11. قم بمحاذاة الحانات على المسرح، وابدأ التسجيل وابدأ مؤقتًا في وقت واحد.
  12. سجل الحانات التي تحتوي على الذباب أثناء التعرض للإيثانول حتى يتوقف الذباب عن التودد أو الحركة بسبب التأنيب.
  13. إزالة طبق بيتري التي تحتوي على الإيثانول من كل حانة مع ملعقة عندما يتم وضع أكثر من 90٪ من الذباب.
  14. نقل بلطف الذباب مرة أخرى إلى قواريربهم المخصصة من خلال ثقب في علامة 50 مل في الحانة.
    ملاحظة: ضع قمعًا فوق قوارير الطعام للمساعدة في النقل. تأكد من وضع الذباب السبّاق على جانب قوارير الطعام لمنعهم من التعلق في الطعام.
  15. تنظيف الحانات مع الإيثانول لإزالة أي الروائح وشطف بغزارة لهم عدة مرات تحت الماء المقطر الجاري. يهز الحانات بقوة لإزالة المياه الزائدة.
  16. تجفيف الحانات عن طريق وضعها أفقيا على المناشف الورقية في درجة حرارة الغرفة.
  17. الحفاظ على الذباب في حاضنة 25 درجة مئوية مع ما لا يقل عن 50٪ الرطوبة النسبية و12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورة مظلمة.
  18. كرر الخطوات 4.1-4.17 كل 24 ساعة لمدة ستة أيام متتالية وتأكد من إجراء التعرض للإيثانول في نفس الوقت من اليوم لتجنب أي آثار circadian.
    ملاحظة: تغيير قوارير الطعام كل 2 -3 أيام للحفاظ على الذباب صحية.

5. سجل المغازلة وتحليل البيانات(الشكل4-6)

  1. افتح مقاطع الفيديو المسجلة باستخدام مشغل وسائط (على سبيل المثال، VLC) وقم بتكبير الفيديو لمراقبة الذباب بوضوح للتسجيل(الشكل 4A).
  2. إرفاق رمز الوقت إلى الفيديو(الشكل 4B).
  3. عد عدد الذكور المشاركين في أنشطة المغازلة بما في ذلك التالية، تمديد الجناح من جانب واحد، سلسلة المغازلة، دائرة المغازلة، الانحناء البطن وتركيب لكل 10 s كتلة الوقت31 (الشكل 5).
  4. أدخل عدد الذكور الذين يعرضون المغازلة لكل كتلة زمنية 10 s في ورقة عمل(الشكل 6A).
  5. استخدام العدد الأقصى من الذكور التودد في ثلاثة متتالية 10 ق كتل الوقت كنقطة بيانات تمثيلية(الشكل 6B).
  6. حساب متوسط 10 نقاط بيانات متتالية لها أعلى قيمة(الشكل 6C)وهذا يمثل النسبة المئوية للمغازلة بين الذكور لكل حانة(الشكل 6A).

6 - التحليل الإحصائي (الشكل التكميلي 1)

  1. فتح برنامج التحليل الإحصائي (على سبيل المثال، Minitab 17) وإضافة بيانات المغازلة في ورقة العمل.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي برنامج تحليل إحصائي.
  2. لتحديد توزيع البيانات (إما التوزيع العادي أو غير العادي)، انتقل إلى علامة التبويب Stat، حدد الإحصاءات الأساسية،وانقر على خيار اختبار العادي (الشكل التكميلي 1Ai).
  3. في متغير، حدد أعمدة فردية (كل عمود يمثل مجموعة بيانات من النمط الجيني أو العلاج قيد الدراسة) ، اختر اختبار Anderson-Darling ، وانقر فوق موافق (الشكل التكميلي 1Aii).
    ملاحظة: سوف تظهر "مخطط احتمال العادي" حساب P-القيمة: إذا كانت القيمة P أكبر من 0.05، ثم يتم توزيع البيانات عادة. إذا كانت القيمة P أقل من 0.05، يتم توزيع البيانات بشكل غير عادي(الشكل التكميلي 1Aiii).
  4. للمقارنة بين مجموعات متعددة، قم بتكديس الأعمدة للمقارنة بالنقر فوق علامة التبويب البيانات، وحدد المكدس، ثم الأعمدة (الشكل التكميلي 1Bi).
  5. في إطار أعمدة المكدس، حدد أعمدة البيانات المراد تكديسها، حدد التراص الذي تم إما في ورقة عمل جديدة أو عمود ورقة العمل الحالية مع العمود التالي المخصص للتّهي بـsubscript (على سبيل المثال، هوية مجموعة البيانات؛ الرقم التكميلي 1Bii-1Biii).
  6. انقر فوق علامة التبويب Stat، وحدد اختبار ANOVA، وحدد النموذج الخطي العام ثم انقر فوق النموذج الخطي العام المناسب (الشكل التكميلي 1Ci).
  7. في إطار النموذج الخطي العام، حدد الأعمدة المراد مقارنتها في مربع الاستجابات، حدد العمود مع النص الفرعي في مربع العوامل وانقر فوق موافق، مما يؤدي إلى نتائج التحليل الإحصائي(الشكل التكميلي 1Cii-1Ciii).
  8. لمقارنة مجموعتين مع البيانات الموزعة عادة، انقر فوق علامة التبويب الإحصائيات، حدد الإحصاءات الأساسية،وحدداختبار t -Sample 2(الشكل التكميلي 1Di).
  9. في 2-عينة t للإطار المتوسط، حدد كل عينة في عمودها الخاص،من مربع منسدل، حدد المجموعتين للمقارنة في مربعات العينة 1 وعينة 2 ثم انقر فوق موافق، مما يؤدي إلى نتائج التحليل الإحصائي(الشكل التكميلي 1Dii-1Diii).
  10. لمقارنة مجموعتين مع البيانات الموزعة غير عادة، انتقل إلى علامة التبويب ستات، حدد Nonparametrics وانقر على مان ويتني (الشكل التكميلي 1Ei)
  11. في نافذة Mann-Whitney، حدد المجموعتين للمقارنة في مربعات العينة الأولى والعينة الثانية ثم انقر فوق موافق، مما يؤدي إلى نتائج التحليل الإحصائي(الشكل التكميلي 1Eii-1Eiii).
  12. للمقارنة بين ثلاث مجموعات أو أكثر من البيانات الموزعة غير الموزعة عادة، انتقل إلى علامة التبويب Stat، حدد Nonparametrics،ثم انقر فوق اختبار Kruskal-Wallis (الشكل التكميلي 1Fi).
  13. في إطار Kruskal-Wallis، حدد الأعمدة المراد مقارنتها في مربع الاستجابة، حدد العمود مع النص الفرعي في مربع عامل وانقر فوق موافق، مما يؤدي إلى نتائج التحليل الإحصائي(الشكل التكميلي 1Fii-1Fiii).

النتائج

يوضح هذا القسم نتائج تجربة Flypub تمثيلية. دروسوفيلا الذكور نادرا ما البلاط الذكور الآخرين35,36. خلال التعرض الأول للإيثانول ، أظهر نوع البرية كانتون - S (CS) الذكور زيادة صغيرة ولكنها ضئيلة في المغازلة بين الذكور المثبطة31 (الشكل 7A). ومع ذلك، أظهر الذكور CS الزيادات المتصاعدة في نشاط المغازلة المثبطة في التعرض الإيثانول اللاحقة (ANOVA GLM، CS: R2= 0.83، F(5,66) = 65.21، p < 0.0001; n = 12؛ الشكل 7A)،الذي يشير إلى التوعية السلوكية لتأثير تثبيط الإيثانول. لقد أظهرنا سابقا أن هذا النوع من بنك الاستثمار الأوروبي يتطلب الدوبامين ومستقبلات الدوبامين DopEcR في الخلايا العصبية الفطر31,32.

لتحديد ما إذا كانت تشارك الموجات العصبية الإضافية في EIBS ، قمنا بالتحقيق في دور OA عن طريق اختبار الذباب(tαh ؛ nM18 null allele)37،38 تفتقر إلى الستيرامين α هيدروكسيلاز ، الإنزيم الذي يحد من المعدل في التمثيل الحيوي لـ OA ، وبالتالي نقص في OA. tαح الذكور في الخلفية الوراثية CS (هدية لطيفة من الدكتور أندرياس ثوم، جامعة لايبزيغ، ألمانيا) عرض استجابة التودد المثبطة الحساسة على التعرض الإيثانول اليومي (ANOVA GLM، tαh: R2= 0.67، F(5,66) = 27.60، p < 0.0001; n = 12؛ الشكل 7B) ولكن على مستوى انخفاض بالمقارنة مع CS (ANOVAGLM، تأثير التفاعل: F = 2.50، ف <0.034). عند التحليل المخصص ، أظهر الذكور tα h مستويات أقل من المغازلة بين الذكور في كل تعرض أكثر وضوحًا خلال التعرض للإيثانول من الرابع إلى السادس بالمقارنة مع CS (اختبار t من عينتين: P < 0.002 في EXP4 ، p & 0.004 في EXP5 ، p & 0.021 في EXP6 ؛ n = 12؛ الشكل 7C). وتشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن اليافة للسكان قد تلعب دوراً في بنك الاستثمار الأوروبي إلى تأثير تثبيط الإيثانول. والأهم من ذلك، أن مجموعات البيانات هذه تبين بوضوح فائدة وفعالية القول بـ Flypub في دراسة التثبيط والتوعية الناجمعن الإيثانول.

figure-results-2405
الشكل 1: سير عمل القول Flypub. رسم تخطيطي لسير العمل يسلط الضوء على الخطوات الرئيسية لإجراء القول بـ Flypub. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2813
الشكل 2: مواد غرفة Flypub والتجميع. (أ)المواد اللازمة لبناء غرفة Flypub تشمل (ط) عصا الغراء الساخن الغراء ،(ii)بندقية الغراء الساخن ،(3)شفرة الحلاقة ،(4)لحام الحديد ،(الخامس)الحاكم ،(6)شبكة ،(7)البولي ورقة بلاستيكية ، و(8)جولة القاع drosophila زجاجة. (ب)التمثيل التخطيطي لجمعية غرفة Flypub. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3582
الشكل 3: التعرض للإيثانول. (أ)محطة Flypub مجمعة بالكامل. (ب)تشمل المواد اللازمة للتعرض للإيثانول (1)P1000 ميكروبيبيت ،(ii)الشريط ،(iii)وسادة القطن ،(iv)طبق بيتري ،(v)مناديل المختبر ،(vi)قمع صغير ،(7)مؤقت ،(8)قمع متوسط الحجم ،(التاسع)وسادة الماوس ،(x)مقص ،(15٪الإيثانول) (( 11) القوة و (الثالث عشر) (C)خطوات حول كيفية قطع منصات القطن. (D)صورة العرض العلوي للحانات المنحازة على المسرح. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4554
الشكل 4: إعداد الفيديو للتسجيل السلوكي. يظهر هو دليل خطوة بخطوة على (أ)كيفية التكبير على الفيديو و (ب)كيفية إدراج ملف رمز الوقت في مشغل الوسائط VLC لتسجيل الأهداف السلوكية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5060
الشكل 5: سلوكيات المغازلة الذكورية. صور تمثيلية توضح سلوكيات التودد الذكور Drosophila بما في ذلك التالية والانفرادية تمديد الجناح ل (A)التودد أغنية ،(ب)سلسلة المغازلة ،(C)دائرة التودد(D)الانحناء البطني و(E)تصاعد التي تستخدم لتسجيل السلوكية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5694
الشكل 6: إدخال البيانات وتحليلها. (أ)يتم نسخ عدد الذكور المنخرطين في المغازلة في كل كتلة زمنية 10 s في ورقة عمل. يستخدم أكبر عدد من الذكور التودد من ثلاث كتل زمنية متتالية 10 s (السهم الأخضر) كنقطة بيانات تمثيلية. ويمثل متوسط 10 نقاط بيانات متتالية (قوس أزرق أو برتقالي) لها قيمة قصوى النسبة المئوية للمغازلة بين الذكور لكل حانة [قوس برتقالي؛ ماكس (متوسط)، السهم الأسود]. (B, C) صيغ ورقة العمل المستخدمة لحساب نقطة البيانات التمثيلية القصوى والمعدل الأقصى لـ 10 نقاط بيانات تمثيلية متتالية لكل حانة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6527
الشكل 7: الإيثانول الناجم عن تثبيط السلوكية والتوعية في CS و tαح. (أ، ب) وعرض الذكور CS و tαh تثبيط المغازلة الحساسة مع التعرض الإيثانول المتكررة (ANOVA GLM, CS: R2= 0.83, F(5,66)= 65.21, p < 0.0001; tαh: R2= 0.67، F(5,66)= 27.60، p < 0.0001؛ ن = 12). (C)أظهر الذكور tα h مغازلة أقل تثبيطمقارنة CS (n = 12). وترد قيم p من التحليلات المخصصة posts فوق السطر. تم تحليل نشاط المغازلة بين الذكور من مقاطع الفيديو التي تم إنشاؤها لكل تعرض للإيثانول. يتم الإبلاغ عن جميع البيانات كوسيلة ± خطأ قياسي للمتوسط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: التحليل الإحصائي. الخطوات في برنامج Minitab 17 حول كيفية تنفيذ (أ) اختبار العادى ، (ب) تكديس البيانات ، (ج) نموذج خطي عام ANOVA اختبار ، (D) اختبار تي من عينتين ،(E)اختبار مان ويتني و (F)Kruskal - Wallis الاختبار. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

في هذا التقرير، قمنا بوصف الإعداد والبروتوكول التفصيلي للوصف Flypub. طريقة جديدة لقياس كيفية التعرض المتكرر للإيثانول يؤدي إلى تثبيط المغازلة والتوعية السلوكية. على الرغم من أن القول Flypub بسيط نسبيًا ، تتطلب عدة خطوات الرعاية والاهتمام لضمان نتائج موثوقة. أولاً ، يجب أن يكون الذباب للاختبار مصطبغًا تمامًا (أي الذباب البالغ المتطور بالكامل) ، صحيًا وسليمًا. يمكن أن تؤثر التشوهات أو الأضرار خاصة في أجنحتهم أو أرجلهم على قدرة الذكر على المحكمة. ثانياً، عصر الذبابة مهم ويجب أن يكون متطابقاً بين مجموعات التحكم والتجريبية (العمر الأمثل: 3-5 أيام من العمر عند التعرض للإيثانول 1). أسبوعين وكبار السن الذباب الذكور البرية تميل إلى عرض مستويات مرتفعة من المغازلة المثبطة31. وبالتالي، فإن مطابقة العمر السليم للذباب قيد الدراسة أمر ضروري لتجنب النتائج المتغيرة. ثالثا، رقم يطير لكل حانة أمر حيوي (الأمثل: 33 لكل حانة). يمكن أن تحرف أرقام الطيران المنخفضة أو الأعلى لكل حانة درجات المغازلة بشكل كبير (لا تظهر البيانات). رابعا، غرف Flypub تحتاج إلى وحدات تخزين متطابقة كما هو موضح في الشكل 2B. وهذا يضمن أن الذباب تلقي بخار الإيثانول بشكل متزامن والسلوكيات أثار متسقة. خامسا، من الضروري تسجيل فيديو واضح وتسجيل دقيق للمغازلة. يعتمد هذا البروتوكول بشكل كبير على الملاحظات السلوكية ، لذا فإن التقيد الدقيق ببروتوكول تسجيل المغازلة الموحد أمر أساسي لتقليل النتائج غير المتسقة. وأخيراً، يوصى بشدة بأن يتم تنفيذ كل من التعرض للإيثانول وخطوات تسجيل المغازلة بشكل أعمى، حيث لا يكون المجرب على علم بالأنماط الجينية للذبابة أو العلاجات التجريبية، وبالتالي منع التحيز التجريبي.

إن ّ مُقاة Flypub لها مزايا متعددة. أولاً، يمكن اختبار مجموعات متعددة من الذباب ومقارنتها في وقت واحد. ثانياً، أنها غير مكلفة وسهلة الإعداد وسهلة التعلم، مما يجعلها قابلة للغاية للتجارب على جميع المستويات بما في ذلك الابتدائية من خلال طلاب المدارس الثانوية والجامعية والدراسات العليا، والدراسات العليا والكليات والكليات، فضلا عن تدريس المختبرات ذات المساحة المحدودة والميزانيات. ثالثا، يمكن استخدامه لقياس السلوكيات الإضافية مثل التودد تثبيط الذباب الإناث وتأثير مهدئ من الإيثانول أو المهدئات الأخرى لتقييم الحساسية الأولية وتطوير التسامح والصيانة31،32. معا، Flypub هو طريقة متعددة الاستخدامات لدراسة ميزات متنوعة من AUD.

القيد الرئيسي للاقافية Flypub هو نظام التهديف المغازلة الصارمة والشاقة. سلوك المغازلة تحت تأثير الإيثانول ديناميكي للغاية بطريقة تتراوح مدة المغازلة من أقل من ثانية إلى عدة دقائق والذباب المنخرط في المغازلة يتغير بشكل متكرر. تم تطوير نظام التسجيل المعروض هنا لدمج هذه الطبيعة الديناميكية وتوفير درجات متسقة على التعرض للإيثانول الفردية لنوع جينويوم معين31،32. وكما لوحظ في البروتوكول، فإن نشاط المغازلة يُسجل يدوياً، وهو أمر يستغرق وقتاً طويلاً. وقد تم تطوير العديد من برامج التسجيل الآلي لتسهيل الفحص السلوكي عالي الإنتاجية غير المتحيز وكلها تعتمد على حركات الذباب الفرديةومواقعها 39، 40،41،,42،43،44،45.41 كما حاولنا تطوير برنامج كمبيوتر لحساب نشاط المغازلة تلقائيًا، ولكننا لم نتمكن من الحصول على نتائج متسقة وموثوقة. يمكن أن يكون هذا يرجع إلى حقيقة أن التهديف السلوكي يتضمن خطوات مغازلة متعددة (أي ، بعد ، تمديد الجناح من جانب واحد ، الانحناء البطني وتصاعد)35،36،46 من الذباب متعددة في وقت واحد. وحتى مع هذا القيد، ينبغي أن يكون المجرب الذي يُدرَب تدريباً كافياً قادراً على قياس سلوكيات المغازلة الناجمة عن الإيثانول باتساق ودقة. ومع ذلك، سيكون من الأهمية والمساعدة الكبيرة اعتماد التعلم الآلي أو الخوارزميات المتقدمة الأخرى كمتابعة.

على غرار نماذج القوارض ، ركزت الدراسات على الإيثانول في نموذج الذبابة إلى حد كبير على تأثيرات تحفيز ومهدئ ة للإيثانول. وFlypub القول ومع ذلك, التدابير التودد تثبيط, نوع من تثبيط المعرفي الذي هو رواية31,,32. لذلك ، يمكن أن تساعد Flypub في توضيح اللاعبين الجزيئيين والمسارات الخلوية والدوائر العصبية بالإضافة إلى عوامل الخطر (مثل العمر أو النوم أو النظام الغذائي أو البيئة الاجتماعية) الحرجة للتثبيط السلوكي والتوعية. لقد أثبتنا سابقا أن إشارات الدوبامين مطلوبة لـ EIBS ، وهو ما يتماشى مع النتائج في نماذج القوارض والموضوعات البشرية6،9،31. أيضا كدليل على المفهوم، درسنا tαh متحولة تفتقر إلى OA (النظير اللافقاري من النورادرينالين) ووجدنا أن OA مهم أيضا للتوعية السلوكية لتأثير تثبيط الإيثانول على الرغم من مساهمتها صغيرة نسبيا بالمقارنة مع الدوبامين31. هذه النتيجة هي على النقيض من ملاحظة Scholz47 أن tαh الذباب متحولة تظهر أي ضعف واضح في التوعية لتأثير تنشيط locomotor الإيثانول47. وهذا يشير إلى مسارات جزيئية وخلوية وعصبية متميزة تُسْلِّط بالتوعية السلوكية للتثبيط مقابل التنشيط الحركي. وينبغي أن تزيد دراسات المتابعة من التعاون مع هذا المفهوم المحير.

باختصار، فإن Flypub هي طريقة منخفضة التكلفة ومتعددة الأوجه وفعالة للتحقيق في الاستجابات السلوكية للإيثانول، وخاصة تثبيط التثبيط والتوعية السلوكية، التي قد تساعد في تعزيز فهمنا لAUD وتوفير نظرة ثاقبة للتدخلات الفعالة لهذا الاضطراب المزمن.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل NIAAA 1R15AA020996 ، NIMH R21MH109953 ، مؤسسة أبحاث الدماغ والسلوك NARSAD ، وNIMHD 2G12MD007592 المنح العنقودية NMD. كما أننا ممتنون لبرنامج RISE الممول من المعاهد القومية للصحة (NIGMS 5R25GM069621) لدعم NMD و CMS ، وبرنامج UTEP COURI-تجاوز لدعم NMD ، وبرنامج MARC الممول من المعاهد القومية للصحة (NIGMS 2T34GM008048-31) لدعم AA ، وزمالة الدكتور كيلونغ هونغ للدراسات العليا لدعم EBS. نحن نقدر كثيرا قسم الاتصالات UTEP: دارلين باراخاس، كريستيان ريفيرا، كارينا مورينو، خوسيه لويا فرنانديز وقسم الموسيقى: ستيفن أ. حداد لمساعدتهم في إنتاج الفيديو والصوت. وأخيرا، نحن ممتنون جدا للدكتور أندرياس ثوم لتقاسم tαh متحولة في خلفية كانتون-S جنبا إلى جنب مع التحكم كانتون-S الذباب; وجيسيكا Burciaga لمساهمتها القيمة في الدراسات الأولية على octopamine وأعضاء مختبر هان للمناقشة والدعم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
95 % EthanolVWR ChemicalsBDH1158-4LP
Canton-S--wild-type strain used as a control
Copy stand with armsKaiser205411model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station
Cotton roundsSwisspersCOT-027to deliver ethanol
ExcelMicrosoft-to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used
Fluorescent light bulbLights of America7108Nmaximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station
Microsoft LifeCam softwareMicrosoft-version 3.60; to videotape flypubs
Microsoft LifeCam StudioMicrosoftQ2F-000131080P HD sensor; to videotape flypubs
Minitab 17Minitab-version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used
Nylon mesh sheetSefar Nitex-model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub
Petri dishesFalcon08-757-100A35 x 10 mm; to deliever ethanol
Plastic funnel - mid sizeFisher scientific10-348A65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial
Plastic funnel - smallFisher scientific07-202-1214 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub
Polycarbonate sheetLexan-0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub
Round-bottom bottleFisher scientificAS115polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub
Soldering ironWellerWES51to make a hole in a flypub
Time code--.smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used
Tyramine β hydroxylase (tβh)--mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany)
VLC media playerVideoLAN-version 3.0.8; any media player can be used to score courtship

References

  1. Scholz, H. Unraveling the Mechanisms of Behaviors Associated With AUDs Using Flies and Worms. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (11), 2274-2284 (2010).
  2. Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual Review of Neuroscience. 36, 121-138 (2013).
  3. Park, A., Ghezzi, A., Wijesekera, T. P., Atkinson, N. S. Genetics and genomics of alcohol responses in Drosophila. Neuropharmacology. 122, 22-35 (2017).
  4. Kippin, T. E. Adaptations underlying the development of excessive alcohol intake in selectively bred mice. Alcoholism: Clinical Experimental Research. 38 (1), 36-39 (2014).
  5. Bell, R. L., et al. Rat animal models for screening medications to treat alcohol use disorders. Neuropharmacology. 122, 201-243 (2017).
  6. Nona, C. N., Hendershot, C. S., Le, A. D. Behavioural sensitization to alcohol: Bridging the gap between preclinical research and human models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 173, 15-26 (2018).
  7. Robinson, T. E., Berridge, K. C. The neural basis of drug craving: an incentive-sensitization theory of addiction. Brain Research Reviews. 18 (3), 247-291 (1993).
  8. Masur, J., Boerngen, R. The excitatory component of ethanol in mice: a chronic study. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 13 (6), 777-780 (1980).
  9. Camarini, R., Pautassi, R. M. Behavioral sensitization to ethanol: Neural basis and factors that influence its acquisition and expression. Brain Research Bulletin. 125, 53-78 (2016).
  10. Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology (Berl). 52 (2), 185-191 (1977).
  11. Short, P. H., Shuster, L. Changes in brain norepinephrine associated with sensitization to d-amphetamine. Psychopharmacology (Berl). 48 (1), 59-67 (1976).
  12. Vanderschuren, L. J., Pierce, R. C. Sensitization processes in drug addiction. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 3, 179-195 (2010).
  13. Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5 (4), 9954(2010).
  14. Broadbent, J., Harless, W. E. Differential effects of GABA(A) and GABA(B) agonists on sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in DBA/2 J mice. Psychopharmacology (Berl). 141 (2), 197-205 (1999).
  15. Camarini, R., Andreatini, R., Monteiro, M. G. Prolonged treatment with carbamazepine increases the stimulatory effects of ethanol in mice. Alcohol. 12 (4), 305-308 (1995).
  16. Camarini, R., Hodge, C. W. Ethanol preexposure increases ethanol self-administration in C57BL/6J and DBA/2J mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 79 (4), 623-632 (2004).
  17. Hoshaw, B. A., Lewis, M. J. Behavioral sensitization to ethanol in rats: evidence from the Sprague-Dawley strain. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 68 (4), 685-690 (2001).
  18. Kawakami, S. E., Quadros, I. M., Takahashi, S., Suchecki, D. Long maternal separation accelerates behavioural sensitization to ethanol in female, but not in male mice. Behavioural Brain Research. 184 (2), 109-116 (2007).
  19. Lessov, C. N., Phillips, T. J. Duration of sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in mice. Psychopharmacology (Berl). 135 (4), 374-382 (1998).
  20. Melon, L. C., Boehm, S. L. Role of genotype in the development of locomotor sensitization to alcohol in adult and adolescent mice: comparison of the DBA/2J and C57BL/6J inbred mouse strains. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (7), 1351-1360 (2011).
  21. Pastor, R., Aragon, C. M. The role of opioid receptor subtypes in the development of behavioral sensitization to ethanol. Neuropsychopharmacology. 31 (7), 1489-1499 (2006).
  22. Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
  23. Cofresi, R. U., Bartholow, B. D., Piasecki, T. M. Evidence for incentive salience sensitization as a pathway to alcohol use disorder. Neuroscience & Biobehavrioal Reviews. 107, 897-926 (2019).
  24. Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. Plos One. (93), 92965(2014).
  25. Stoner, S. A., George, W. H., Peters, L. M., Norris, J. Liquid courage: alcohol fosters risky sexual decision-making in individuals with sexual fears. AIDS and Behavior. 11 (2), 227-237 (2007).
  26. Marinkovic, K., Halgren, E., Klopp, J., Maltzman, I. Alcohol effects on movement-related potentials: a measure of impulsivity. Journal of Studies on Alcohol and Drugs. 61 (1), 24-31 (2000).
  27. Prause, N., Staley, C., Finn, P. The effects of acute ethanol consumption on sexual response and sexual risk-taking intent. Archives of Sexual Behavior. 40 (2), 373-384 (2011).
  28. Miczek, K. A., DeBold, J. F., Hwa, L. S., Newman, E. L., de Almeida, R. M. Alcohol and violence: neuropeptidergic modulation of monoamine systems. Annals of the New York Academy of Sciences. 1349, 96-118 (2015).
  29. Heinz, A. J., Beck, A., Meyer-Lindenberg, A., Sterzer, P., Heinz, A. Cognitive and neurobiological mechanisms of alcohol-related aggression. Nature Reviews Neuroscience. 12 (7), 400-413 (2011).
  30. Schwandt, M. L., Higley, J. D., Suomi, S. J., Heilig, M., Barr, C. S. Rapid tolerance and locomotor sensitization in ethanol-naive adolescent rhesus macaques. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (7), 1217-1228 (2008).
  31. Lee, H. G., Kim, Y. C., Dunning, J. S., Han, K. A. Recurring ethanol exposure induces disinhibited courtship in Drosophila. Plos One. 3 (1), 1391(2008).
  32. Aranda, G. P., Hinojos, S. J., Sabandal, P. R., Evans, P. D., Han, K. A. Behavioral Sensitization to the Disinhibition Effect of Ethanol Requires the Dopamine/Ecdysone Receptor in Drosophila. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, 56(2017).
  33. Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Progress in Neurobiology. 59 (5), 533-561 (1999).
  34. Gallo, V. P., Accordi, F., Chimenti, C., Civinini, A., Crivellato, E. Catecholaminergic System of Invertebrates: Comparative and Evolutionary Aspects in Comparison With the Octopaminergic System. International Review of Cell Molecular Biology. 322, 363-394 (2016).
  35. Curcillo, P. G., Tompkins, L. The ontogeny of sex appeal in Drosophila melanogaster males. Behavior Genetics. 17 (1), 81-86 (1987).
  36. Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annual Review of Entomology. 19, 385-405 (1974).
  37. Monastirioti, M., Linn, C. E., White, K. Characterization of Drosophila tyramine beta-hydroxylase gene and isolation of mutant flies lacking octopamine. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3900-3911 (1996).
  38. Certel, S. J., Savella, M. G., Schlegel, D. C., Kravitz, E. A. Modulation of Drosophila male behavioral choice. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 104 (11), 4706-4711 (2007).
  39. Kido, A., Ito, K. Mushroom bodies are not required for courtship behavior by normal and sexually mosaic Drosophila. Journal of Neurobiology. 52 (4), 302-311 (2002).
  40. Winbush, A., et al. Identification of gene expression changes associated with long-term memory of courtship rejection in Drosophila males. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 2 (11), 1437-1445 (2012).
  41. Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neuroscience. 10 (12), 1587-1593 (2007).
  42. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nature Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  43. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  44. Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (2), 105-111 (2013).
  45. Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 10 (10), 20140749(2014).
  46. Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. Courtship in Drosophila. Annual Reviews of Genetics. 34, 205-232 (2000).
  47. Scholz, H. Influence of the biogenic amine tyramine on ethanol-induced behaviors in Drosophila. Journal of Neurobiology. 63 (3), 199-214 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159 melanogaster Disinhibition Octopamine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved