JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا هو بروتوكول لأداء التلاعب الجيني في الدماغ النمس الجنيني باستخدام في كهربائي الرحم. هذه الطريقة تسمح لاستهداف الخلايا السلف العصبي في القشرة العصبية في الجسم الحي.

Abstract

التلاعب في التعبير الجيني في الجسم الحي أثناء التطور الجنيني هو الطريقة المفضلة عند تحليل دور الجينات الفردية أثناء تطور الثدييات. في كهربائي الرحم هو تقنية رئيسية لتلاعب التعبير الجيني في الدماغ الثديي الجنيني في الجسم الحي. يتم تقديم بروتوكول لكهربية الرحم من القشرة الجديدة الجنينية من النمس، آكلة اللحوم الصغيرة، هنا. يتم استخدام النمس بشكل متزايد كنموذج لتطوير القشرة الجديدة ، لأن القشرة الجديدة يعرض سلسلة من الميزات التشريحية والهلوسية والخلوية والجزيئية الموجودة أيضًا في الرئيسيات البشرية وغير البشرية ، ولكنها غائبة في نماذج القوارض ، مثل الفئران أو الفئران. في الرحم الكهربائي تم تنفيذها في يوم الجنين (E) 33، مرحلة منتصف النشأة في النمس. في الإلكتروبور الرحمي يستهدف الخلايا السلف العصبية بطانة البطينين الجانبي للدماغ. أثناء تكوين الخلايا العصبية، هذه الخلايا السلف تؤدي إلى جميع أنواع الخلايا العصبية الأخرى. يُظهر هذا العمل النتائج والتحليلات التمثيلية في E37، ويوم ما بعد الولادة (P) 1، و P16، بما يعادل 4 و9 و24 يوماً بعد الحمل الكهربائي الرحمي، على التوالي. في المراحل السابقة، وذرية الخلايا المستهدفة يتكون أساسا من مختلف الأنواع الفرعية السلف العصبي، في حين أن في المراحل اللاحقة معظم الخلايا المسماة هي الخلايا العصبية ما بعد التورم. وهكذا، في كهربائي الرحم تمكن من دراسة تأثير التلاعب الجيني على السمات الخلوية والجزيئية لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية. من خلال تأثيره على مجموعات الخلايا المختلفة، في القطب الرحمي يمكن أيضا أن تستخدم للتلاعب في الخصائص النسيجية والتشريحية من النمس القشرة الجديدة. الأهم من ذلك ، كل هذه الآثار حادة ويتم تنفيذها مع خصوصية اصمية يحددها المستخدم.

Introduction

القشرة الجديدة هي الورقة الخارجية للدماغ النخاعي الثديي ومقعد الوظائف المعرفية العليا1,2,3,4,5. من أجل تحقيق تلاعب وراثي حاد في القشرة الثديية في الجسم الحي خلال التطور الجنيني ، تم استكشاف طريقتين مختلفتين: العدوى الفيروسية6 وفي الإلكتروبورات الرحمية7. كلتا الطريقتين تسمحان باستهداف الخلايا القشرية الجديدة بكفاءة ولكنها تعاني من بعض القيود. الميزة الرئيسية في الإلكتروبورات الرحمية مقارنة بالعدوى الفيروسية هي القدرة على تحقيق خصوصية المكان داخل القشرة الجديدة ، والتي تتحقق من خلال تنظيم اتجاه المجال الكهربائي.

منذ أن تبين لأول مرة الكهربائي لتسهيل دخول الحمض النووي إلى الخلايا في المختبر8، فقد تم تطبيقه على تسليم الحمض النووي إلى مختلف الفقاريات في الجسم الحي. في علم الأعصاب التنموي، في كهربائي الرحم من الماوس نيوكورتيكس ذكرت لأول مرة في 20019،10. هذه الطريقة تتكون من حقن خليط الحمض النووي في البطين الجانبي للدماغ الجنيني وتطبيق لاحق من المجال الكهربائي باستخدام أقطاب الملاقط، والذي يسمح الدقة المكانية7،11. في الرحم الكهربائي ومنذ ذلك الحين تم تطبيقها لتقديم الأحماض النووية من أجل التعامل مع التعبير عن الجينات الذاتية أو مُضافة خارج الرحم في الماوس نيوكورتيكس. وقد أحرز تقدم هام في الآونة الأخيرة من خلال تطبيق منهجية تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 بوساطة عبر في الإلكتروبور في الفيرريكتيكس الماوس لأداء (1) اضطراب الجينات في الخلايا العصبية ما بعد الديمومتوية12,13 والخلايا السلف العصبي14, و (2) الجينوم15 و epigenome16 التحرير.

بعد وقت قصير جدا من التقرير الأول في الماوس، في كهربائي الرحم تم تطبيقها على الجرثان الجنينية17،18. ظلت غير القوارض تحديا حتى الأول في كهربائي الرحم من النمس, آكلة اللحوم الصغيرة, وذكرت في 201219,20. ومنذ ذلك الحين، في الكهربائي الرحمي من النمس وقد طبقت لدراسة آليات تطوير القشرة الجديدة من خلال وضع العلامات على السلف العصبية والخلايا العصبية20،21،22،23، التلاعب في التعبير عن الجينات الذاتية ، بما في ذلك استخدام CRISPR / Cas9 التكنولوجيا24، وتقديم الجينات خارج الرحم21،22،25، بما في ذلك الجينات البشريةالمحددة 26. وعلاوة على ذلك، في كهربائي الرحم من النمس وقد استخدمت لمعالجة ملامح التنمية في القشرة البشرية في الظروف المرضية27،28.

في سياق تطور القشرة الجديدة ، تعود مزايا استخدام النمس ككائن حي نموذجي مقارنة بالفئران إلى حقيقة أن النمس تُلخي بشكل أفضل سلسلة من الميزات الشبيهة بالبشر. على المستوى التشريحي، تظهر النمس نمطاً مميزًا للطي القشري، والذي هو موجود أيضًا في الإنسان ومعظم الرئيسيات الأخرى، ولكنه غائب تمامًا في الفئران أو الفئران4،29،30،31. على مستوى النسيج النمس اثنين من مناطق فرعية فرعية متميزة، ويشار إلى المناطق الفرعية البطينية الداخلية والخارجية (ISVZ وOSVZ، على التوالي)32،33، مفصولة طبقة الألياف الداخلية23. يتم أيضا تقاسم هذه الميزات مع الرئيسيات، بما في ذلك البشر، ولكن ليس مع الفئران34. وSSVZ وOSVZ في النمس والبشر هي المأهولة مع خلايا السلف العصبية وفيرة، في حين أن المنطقة دون البطينية (SVZ) من الفئران تحتوي فقط على السلف العصبية21،32،35،36. على المستوى الخلوي، تظهر النمس نسبة عالية من نوع فرعي من السلف العصبية المشار إليها باسم glia القاعدية أو الخارجية شعاعي (bRG أو oRG، على التوالي)، والتي تعتبر مفيدة للتوسع التطوري للcorcortex الثدييات34،37،38. bRG وبالتالي وفيرة للغاية في الجنينية النمس النمس النضر ، لكنها نادرة جدا في الماوس الجنيني35،36. وعلاوة على ذلك، يظهر bRG النمس التجانس المورفولوجية مماثلة لتلك التي من bRG الإنسان، متفوقة بكثير على الماوس bRG21. وأخيرا، على المستوى الجزيئي، وتطوير النمس القشرة الجديدة يظهر أنماط التعبير الجيني مشابهة جدا لتلك التي من العصر الجديد الإنسان الجنيني، والتي يفترض أن السيطرة على تطوير للطي القشرية، من بين أمور أخرى39.

الخصائص البيولوجية والجزيئية الخلية من bRG النمس جعلها تكاثرية للغاية، على غرار bRG الإنسان. وهذا يؤدي إلى زيادة إنتاج الخلايا العصبية وتطوير34neocortex موسعة ومعقدة للغاية . هذه الخصائص تجعل النمس كائنات نموذجية ممتازة لدراسة السمات الشبيهة بالبشر من التنمية القشرة الجديدة التي لا يمكن نمذجة في الفئران26،40. للاستفادة الكاملة من النمس ككائن حي نموذجي تم تطوير الطريقة المقدمة. وهو يتألف من كهربائي الرحم من الأجنة النمس E33 مع plasmid التعبير عن GFP (pGFP) تحت سيطرة المروج في كل مكان، CAG. ويمكن بعد ذلك تحليل الأجنة الكهربائية الجنينية أو بعد الولادة. من أجل تقليل عدد الحيوانات التي تم التضحية بها ، يتم تعقيم النمس الإناث (جيلس) عن طريق استئصال الرحم ويتم التبرع بها لاعتمادها كحيوانات أليفة. إذا تم حصاد الأجنة المستهدفة في مراحل جنينية ، يتم إجراء عملية جراحية ثانية وإزالة الأجنة عن طريق عملية قيصرية ، في حين أن الجيل يتم استئصال الرحم. إذا تم تحليل الأجنة المستهدفة في مراحل ما بعد الولادة ، يتم استئصال الجيل بعد فتومة الجراء أو التضحية بها. وبالتالي ، يتم تقديم بروتوكول لاستئصال الرحم من جيلس أيضا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية بالاتفاق مع التشريعات الألمانية لرعاية الحيوان بعد موافقة Landesdirektion Sachsen (تراخيص TVV 2/2015 و TVV 21/2017).

1- الاستعداد للكهربة في الرحم

  1. إعداد خليط الحمض النووي. في هذا البروتوكول يتم استخدام تركيز نهائي من 1 ميكروغرام/ميكرولتر من pGFP. حل الحمض النووي في برنامج تلفزيوني والملحق مع 0.1٪ الأخضر السريع لتسهيل التصور. مرة واحدة على استعداد، مزيج خليط الحمض النووي عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات أو عن طريق التنصت على الإصبع. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
    ملاحظة: بالنسبة للcoelectroporations، يتم إعداد خليط الحمض النووي لاحتواء تركيز نهائي من 1 ميكروغرام/ميكرولتر من بلازميد ترميز جين من الاهتمام جنبا إلى جنب مع 0.5 ميكروغرام /ميكرولتر من pGFP المخفف في برنامج تلفزيوني.
  2. إعداد طاولة الجراحة مع جميع الأدوات والأدوات المطلوبة.
  3. سحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام جرة micropipette. ضبط قطر طرف شعرية بقطع الجزء من الشعرية باستخدام ملقط كما سبق وصفه41.

2. إعداد النمس للجراحة

  1. الحفاظ على جيل الحوامل مع الأجنة في E33 الصيام لمدة 3 ساعات على الأقل قبل الجراحة للحد من خطر القيء.
  2. قبل الجراحة تعقيم جميع الأدوات عن طريق autoclaving. إجراء عملية جراحية في غرفة مخصصة خصيصا في ظروف معقمة للقضاء على المصادر المحتملة للتلوث.
  3. وضع جيل الحوامل في مربع المخدرات مع isoflurane 4٪ .
  4. عندما تخدير, وضع النمس على طاولة العملية مع وسادة الحرارة وإرفاق قناع المخدرات مع تدفق isoflurane ثابت 2-3% إلى الأنف. لضمان المستوى المناسب للتخدير ، تحقق من عدم وجود ردود الفعل التالية:
    1. منعكس palpebral من خلال لمس الجلد حولية
    2. منعكس من خلال قرص الجلد بين 2و 3rd، أو 3و 4th إصبع القدم من كلا الأطراف الخلفية
    3. إذا كان رد الفعل palpebral غائبة ويتم تقليل منعكس بوضوح، والتحقق من رد الفعل الألم عن طريق معسر إصبع القدم واحد من كل طرف خلفي.
      ملاحظة: تأكد من وجود سماعة في متناول اليد لمراقبة معدل ضربات القلب والإيقاع إذا لزم الأمر.
  5. حقن تحت الجلد النمس مع مسكن (0.1 مل من ميتاميزول, 50 ملغ / كغ من وزن الجسم), مضاد حيوي (0.1 مل / كغ من وزن الجسم من 20 ملغم / كغم من أموكسيسيلين + حمض clavulanic), والجلوكوز (10 مل من 5% محلول الجلوكوز).
  6. ضع قطرة من محلول مرهم العين على العينين لمنع جفاف العين أثناء العملية الجراحية.
  7. حلق بطن النمس باستخدام آلة الحلاقة.
  8. تنظيف الجلد بالماء والصابون، وتطهير البطن مع فرك الإيثانول 70٪، وتطهير 2x مع اليود، والسماح لها الجافة.

3. في الرحم الكهربائي من النمس

  1. تأكد من أن المنطقة الجراحية معقمة: ضع أدوات جراحية معقمة على الأنسجة المعقمة، وتغيير المعطف والقفازات.
  2. وضع الستائر الجراحية العقيمة على الحيوان.
  3. باستخدام مشرط، جراحيا فتح البطن في ألبا linea مع ~ 5 الطول قطع طويلة.
  4. قطع طبقة العضلات باستخدام مقص.
  5. ضع مسحات الشاش حول موقع الشق ونبتلها بـ PBS. سوف تمتص مسحات الشاش برنامج تلفزيوني إضافي سيتم إضافته أثناء الجراحة.
    ملاحظة: الحفاظ على الحرارة ودعم برنامج تلفزيوني طوال الجراحة.
  6. كشف الرحم النمس ووضعها على مسحات الشاش.
  7. تحميل الشعيرات الدموية الزجاج مع محلول الحقن باستخدام ماصة مع طرف تحميل طويلة. تأكد من أن حجم التحميل يتراوح بين 5 و20 ميكرولتر تقريبًا حسب عدد الأجنة وعدد الحالات التجريبية المختلفة. يبلغ متوسط حجم الحقن لكل جنين 3-5 ميكرولتر.
  8. افحص أول جنين والعثور على الرأس.
  9. ضع مصدر ضوء الألياف البصرية بجوار رأس الجنين لتسهيل التصور.
    ملاحظة: جدران الرحم النمس مظلمة جدا، وأنه من الصعب أن نرى من خلالها ما لم يتم تلمع ضوء مباشرة عليها.
  10. إجراء حقنة واحدة داخل البطين في البطين من نصفي الدماغ والحفاظ على نصف الكرة الأرضية الآخر سليمة لتكون بمثابة عنصر تحكم داخلي. البطين نفسه ليس من السهل تمييزها عن طريق العين ، لذلك يتم تقدير موقعه على أساس موقع القزحية المصطبغة ، والتي هي مرئية. يتم الحقن داخل البطين عن طريق أخذ حامل تعلق على الشعرية الزجاجية واختراق الجلد والجمجمة، والأنسجة الدماغية مع غيض من الشعرية الزجاجية.
    ملاحظة: تأكد من عدم إتلاف المشيمة، التي هي أكثر قتامة من مشيمة المورين.
    1. عندما يكون طرف الشعيرات الدموية الزجاجية في البطين، يحقن حوالي 3-5 ميكرولتر من محلول الحقن عن طريق أنبوب الفم باستخدام لسان الفم المتصل بصاحب الشعيرات الدموية الزجاجية. لأن الحل المحقون يحتوي على 0.1٪ أخضر سريع، فإن البطين المحقون سوف يتحول الآن إلى اللون الأخضر الداكن، وسيكون مرئيًا كبنية على شكل كلية.
  11. ضع أقطاب الملاقط على الرحم فوق رأس الجنين بحيث يتم وضع القطب الإيجابي فوق المنطقة التي سيتم استهدافها والقطب السلبي تحت المنطقة المحقونة.
  12. تعيين الظروف الكهربائية التالية على electroporator: نبض طول = 50 مللي ثانية; نبض الجهد = 100 V؛ الفاصل الزمني النبض = 1 s؛ عدد النبضات = 5. ثم، اضغط على زر"نبض"على electroporator.
  13. إسقاط بسرعة عدة قطرات من برنامج تلفزيوني 1x دافئ على الجنين الكهربائي.
  14. كرر الإجراء لجميع الأجنة. إبقاء الرحم الرطب باستمرار مع برنامج تلفزيوني دافئ.
    ملاحظة: إذا لم يكن من السهل الوصول إلى الأجنة الأولى التي تواجه المهبل، فمن الأفضل عدم كهربها.
  15. عندما يتم كهربية جميع الأجنة، ضع الرحم مرة أخرى في تجويف البريتوني.
  16. خياطة طبقة العضلات مع الصفاق باستخدام خياطة 4-0.
  17. خياطة الجلد باستخدام نفس سمك ورذاذ الجرح مع رذاذ الألومنيوم.
  18. ضع الحيوان في قفص وأبقيه دافئًا مع مصدر حراري. مراقبة بعناية الحيوان حتى يستيقظ.

4- الرعاية اللاحقة للزُرَب وسكن الحيوانات المستهدفة

  1. لمدة 3 أيام بعد الجراحة تأكد من أن الحيوانات تخضع للرعاية التالية بعد الجراحة: 20 ملغم / كجم أموكسيسيلين (مضاد حيوي) 1x يوميا؛ 20 ملغم /كغ أموكسيسيلين (مضاد حيوي) 1x يوميا; 25 ملغم / كغ metamizol (مسكن) 3x يوميا.
  2. تأكد من أن النمس يتم إيواءها بشكل فردي.
  3. تأكد من فحص النمس من قبل البيطرية على الأقل 1x في اليوم الواحد.
  4. تأكد من أن يتم إزعاج النمس أقل قدر ممكن أثناء الولادة.
  5. بعد فُتم الجراء أو التضحية بها، أعدّي الجيل لاستئصال الرحم.

5- استئصال الرحم من النمس

ملاحظة: يتم إجراء استئصال الرحم لتقليل عدد الحيوانات التي يتم التضحية بها بحيث يمكن التبرع بالحيوانات المعقمة لاعتمادها كحيوانات أليفة. الإجراء ما قبل الجراحة لاستئصال الرحم هو نفسه كما هو الحال في الخطوة 2.

  1. حلاقة وتعقيم بطن النمس كما هو موضح في الخطوتين 3.1 و 3.2.
  2. جراحيا فتح البطن في ألبا linea. قطع طبقة العضلات. رفع طبقة العضلات والمأوى القناة الهضمية مع إصبع في حين فتح طبقة العضلات تماما.
  3. ضع مسحات الشاش حول موقع الشق ونبتلها بـ PBS العقيم. كشف الرحم النمس والمبايض ووضعها على مسحات الشاش.
  4. بدء استئصال الرحم على جانب واحد عن طريق ربط الشريان ovarica وفينا ovarica الجمجمة إلى الميزوفار. وضع المشبك على كل جانب من ربط وتنفيذ آخر ربط الجمجمة إلى المشابك. إرفاق المشبك الثالث في نهايات الربط لإنقاذهم. كرر على الجانب الآخر.
  5. قطع بين المشابك وفصل uteri cornua من mesentery على كلا الجانبين.
  6. Ligate الشريانية uterina على جانبي الرحمcaudal إلى أوستيوم uteri. ثم ligate المهبل وإصلاح الرباط. إرفاق المشبك في نهايات الربط لإنقاذها. ضع مشابك حفّة على الرباط قطع بين المشابك وفصل الرحم من المهبل. إزالة الرحم والمبايض والتخلص منها. كشط الغشاء المخاطي المتبقي من بعقب الرحم.
  7. فصل جميع المشابك المتبقية وتقصير نهايات الرباط. تأكد من السيطرة على النزيف بعد إزالة المشابك.
  8. خياطة طبقة العضلات والجلد كما هو موضح في الخطوتين 3.16 و 3.17. اتبع بروتوكول ما بعد الجراحة كما في الخطوتين 3.18 و 4.1-4.3. إبقاء الحيوانات في منشأة الحيوانات لمدة أسبوعين على الأقل مع زيارات بيطرية منتظمة. بعد أن يتم استرداد الحيوانات بالكامل ، يمكن التبرع بها للتبني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في الصعق الكهربائي الرحمي للنمس في E33 أدى إلى استهداف الخلايا السلف العصبية بطانة سطح البطين من القشرة الجديدة الجنينية (الشكل 1). وتسمى هذه الخلايا السلف apical وهي تكاثرية للغاية، مما يؤدي إلى جميع أنواع الخلايا الأخرى أثناء التنمية. عند التقسيم غير المتماثل، ولدت السلفة apica...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في كهربائي الرحم في النمس هو تقنية هامة، مع مزايا وعيوب فيما يتعلق بطرق أخرى. هناك خطوات حاسمة والقيود على هذا الأسلوب، فضلا عن التعديلات المحتملة والتطبيقات المستقبلية أن نضع في اعتبارنا.

منذ العمل الرائد من فيكتور بوريل وزملاؤه على التلاعب الجيني من النمس النمس بعد الولا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نحن ممتنون لخدمات ومرافق معهد ماكس بلانك لبيولوجيا الخلايا الجزيئية وعلم الوراثة على الدعم المتميز المقدم ، ولا سيما الفريق بأكمله من الخدمات الطبية الحيوية (BMS) لتربية ممتازة من النمس وJ. Peychl وفريقه من مرفق المجهر الخفيفة. ونحن ممتنون بشكل خاص لكرينت ريبي وآنا فايفر من إدارة المباني للدعم البيطري الاستثنائي ولي شينغ من مجموعة هوتنر للمساعدة في العمليات الجراحية النمس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1ml syringeBD309628Electroporation
4-0 Vicryl sutureEthiconV392ZGSurgery
Aluminium spraycp-pharma98017Surgery
Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU)WDT6301Surgery
Cappilary holderWPIMPH6S12Electroporation
Dexpanthenol Ointment solutionBayer6029009.00.00Surgery
Drape sheet 45x75cmHartmann2513052Surgery
Electrode Tweezer, platinum plated 5mmBTX45-0489Electroporation
ElectroporatorBTXECM830Electroporation
Fast GreenSigmaF7258-25GElectroporation
Ferret Mustela putorius furoMarshallNAExperimental organism
Fiber optic light sourceOlympusKL1500LCDElectroporation
ForcepsAllgaier instrumente08-033-130Surgery
Forceps 3C-SARubis Tech3C-SASurgery
Forceps 55Dumostar11295-51Surgery
Forceps 5-SARubis Tech5-SASurgery
Gauze swabs largeHartmann401723Surgery
Gauze swabs smallHartmann401721Surgery
GFAP antibodyDakoZ0334Antibody
GFP antibodyAves labsGFP1020Antibody
Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length)Sutter InstrumentBF120-69-10Electroporation
GlucoseBela-pharmK4011-02Surgery
Heat padHans DinslageSanitas SHK18Surgery
Iodine (Betadine solution 100 mg/ml)Meda997437Surgery
IsofluranCP21311Surgery
Loading tips 20µlEppendorf#5242 956.003Electroporation
MetamizolWDT99012Surgery
Metzenbaum dissecting scissorsAesculapBC600RSurgery
Micropipette pullerSutter InstrumentModel P-97Electroporation
pCAGGS-GFPNANAFrom Kalebic et al., eLife, 2018
PCNA antibodyMilliporeCBL407Antibody
pH3 antibodyAbcamab10543Antibody
ScalpelAesculap294200104Surgery
ShaverBraunEP100Surgery
Sox2 antibodyR+D SystemsAF2018Antibody
Surgical clamp 13cmWDT27080Surgery
Surgical double spoon (Williger)WDT27232Surgery
Surgical drapeWDT28800Surgery
Surgical scissors smallFST14090-09Surgery
Suturing needle holderAesculapBM149RSurgery
Tbr2 antibodyAbcamab23345Antibody
Transfer pipette 3mlFischer scientific13439108Surgery
Water bathJulaboTW2Surgery

References

  1. Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
  2. Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
  3. Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
  4. Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  5. Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
  6. Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
  8. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  9. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  10. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239(2007).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584(2014).
  13. Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611(2016).
  14. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  15. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
  16. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  17. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  18. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236(2007).
  19. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24(2012).
  20. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  21. Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
  22. Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812(2016).
  23. Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
  24. Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
  25. Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285(2017).
  26. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241(2018).
  27. Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370(2015).
  28. Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
  29. Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
  30. Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
  31. Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
  32. Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
  33. Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
  34. Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
  35. Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  36. Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
  37. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  38. Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
  39. De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
  40. Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
  41. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).
  42. Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
  43. Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
  44. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  45. Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276(2018).
  46. Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved