تقييم الهيكل العالمي للرّيّة بعد الرحلات الفضائية باستخدام طريقة التصوير المقطعي المحوسبة الدقيقة (الدقيقة CT)

Summary

نقدم بروتوكولًا باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق عالي الدقة لتحديد ما إذا كانت الرحلات الفضائية تسبب تلفًا على هياكل العين. يُظهر البروتوكول القياس المشتق من التصوير المقطعي المحوسب الصغير للهياكل البصرية للقارض السابقة. نبرهن على القدرة على تقييم التغيرات المورفولوجية البصرية بعد الرحلات الفضائية باستخدام تقنية tridimensional غير مدمرة لتقييم تلف العين.

Abstract

وتبين التقارير أن التعرض الطويل الأمد لبيئة الرحلات الفضائية يحدث تغيرات في العيون في الفضاء أثناء وبعد بعثة محطة الفضاء الدولية. غير أن الآليات الأساسية لهذه التغيرات التي تُستحثها الرحلات الفضائية غير معروفة حاليا. وكان الغرض من هذه الدراسة هو تحديد أثر بيئة الرحلات الفضائية على هياكل العين عن طريق تقييم سمك شبكية العين الماوس، وظهارة صبغ الشبكية (RPE)، وطبقة المشيمية، وطبقة الصريبة باستخدام التصوير المقطعي المجهري. تم إيواء الفئران الذكور C57BL/6 البالغة من العمر عشرة أسابيع على متن جهاز ISS في مهمة تستغرق 35 يومًا ثم عادت إلى الأرض حية لتحليل الأنسجة. وللمقارنة، فإن فئران التحكم الأرضي على الأرض تُحفظ في ظروف وعتاد بيئيين متماثلين. تم جمع عينات من الأنسجة العينية لتحليل الأشعة المقطعية الدقيقة في غضون 38 (±4) بعد ساعات من splashdown. تم تسجيل صور المقطع العرضي للشبكية ، RPE ، المشيمية ، وطبقة الصُلب من العين الثابتة في منظر محوري و برجي باستخدام طريقة اقتناء التصوير المقطعي الصغرى. وأظهر التحليل المجهري المقطعي المحوسب أن المناطق المقطعية في شبكية العين، وRPE، وسمك طبقة المشيمية قد تغيرت في عينات الرحلات الفضائية مقارنة بائحته، حيث أظهرت عينات الرحلات الفضائية أجزاء عرضية وطبقات أرق بكثير مقارنة بالضوابط. وتشير النتائج التي توصلت إليها هذه الدراسة إلى أن التقييم المقطعي المجهري هو طريقة حساسة وموثوق بها لتوصيف تغيرات بنية العين. ومن المتوقع أن تحسن هذه النتائج فهم أثر الإجهاد البيئي على هياكل العين العالمية.

Introduction

في بيئة الجاذبية الصغرى لرحلات الفضاء، قد يكون الضغط داخل الجمجمة (ICP) الناجم عن تحول السوائل قد ساهم في متلازمة العين العصبي المرتبطة بالرحلات الفضائية (SANS)^{1،2،3،4،5}. في الواقع، أكثر من 40٪ من رواد الفضاء قد شهدت سانس أثناء وبعد محطة الفضاء الدولية (محطة الفضاء) بعثة⁶، بما في ذلك موضوع الرحلات الفضائية من دراسة التوائم ناسا^7. يشمل علم الفيزيولوجيا المرضية الحالي لـ SANS التغيرات الفسيولوجية مثل وذمة القرص البصري ، وتسطيح الكرة الأرضية ، والطيات المشيمية والشبكية ، وتحولات الخطأ الانكساري المفرط ، وطبقات الألياف العصبية (أي بقع الصوف القطني) وهي موثقة جيدًا^5،8. غير أن الآليات الأساسية للتغييرات والعوامل التي تسهم في تطور الضرر غير واضحة. 11- ومن أجل الحصول على فهم أفضل لـ "SANS"، تتوافر نماذج حيوانية لتصفيف التغيرات المرتبطة بتحليقات الفضاء في بنية الشبكية ووظيفته.

في تحقيق سابق على نفس الحيوانات، أبلغنا عن تأثير 35 يوما من الرحلات الفضائية على شبكية العين الماوس. النتائج توضح أن الرحلات الفضائية تسبب ضررا كبيرا في شبكية العين وشبكية الأوعية الدموية، وبعض البروتينات / المسارات المرتبطة بموت الخلايا والالتهاب والإجهاد الأيضي قد تغيرت بشكل كبير بعد رحلة الفضاء⁹.

حاليا، هناك مجموعة متنوعة من تقنيات التصوير غير الباضع التي أنشئت لرصد تطور المرض وتطوره، فضلا عن الاستجابات الفسيولوجية لمختلف الضغوطات البيئية، والتي تستخدم أيضا على نطاق واسع في نماذج القوارض الصغيرة. واحدة من هذه التقنيات هي الدقيقة CT، الذي يقيم الهياكل التشريحية والعمليات المرضية، وقد استخدمت بنجاح على الكائنات الحية الصغيرة مثل الفئران¹⁰.

يمكن أن تحقق الأشعة المقطعية الدقيقة دقة صغيرة الحجم ، ويمكن أن توفر تباينًا كبيرًا للتحليل الحجمي للأنسجة الرخوة مع إضافة عامل التباين المناسب^{10،11،12،13،14}. تكنولوجيا التصوير المقطعي المجهري مفيدة مقارنة بالطرق التقليدية مثل التشريح الإجمالي، والمجهر الخفيف، وفحص الأنسجة، حيث أنها تقلل من الأضرار المادية للملامح الهندسية للعينات ولا تغير العلاقة المكانية بين الهياكل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إعادة بناء ثلاثي الأبعاد (3D) نماذج من الهياكل من الصور الدقيقة CT^12،14. 11- وحتى الآن، وعلى الرغم من وجود أدلة تثبت ضعف الرؤية بعد التعرض للبيئة الفضائية، لا تتوافر سوى بيانات قليلة في النماذج الحيوانية من أجل فهم أفضل للتغيرات المرتبطة بالرحلات الفضائية في بنية الشبكية ووظيفته. وفي الدراسة الحالية، نُقلت الفئران جوا في مهمة استغرقت 35 يوما على متن محطة الفضاء الدولية لتحديد أثر بيئة الرحلات الفضائية على هياكل الأنسجة العينية عن طريق قياس البنية المجهرية لشبكية العين، وRPE، والطبقات المشيمية باستخدام الأشعة المقطعية الدقيقة.

Protocol

وقد اتبعت الدراسة التوصيات الواردة في دليل رعاية المختبرات واستخدامها الذي تتبعه المعاهد الوطنية للصحة، ووافقت عليها كل من اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة لوما ليندا والإدارة الوطنية للملاحة الجوية والفضاء .() ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات التفصيلية بشأن هذه التجربة الرحلة في مكان آخر^9,15.

1. ظروف الطيران والتحكم

ملاحظة: تم إطلاق حمولة خدمة إعادة التموين التجارية الثانية عشرة (CRS-12) من قبل SpaceX في مركز كينيدي الفضائي (KSC) في مهمة استغرقت 35 يومًا في أغسطس 2017 والتي شملت على متن 10 أسابيع من الفئران C57BL/6 الذكور (n = 20) لتجربة أبحاث القوارض التاسعة لوكالة ناسا (RR-9).

1. قبل العودة إلى الأرض عبر كبسولة التنين SpaceX، يكون الفئران تعيش في موائل القوارض التابعة لوكالة ناسا على متن ISS لمدة 35 يوما في درجة حرارة محيطة من 26-28 درجة مئوية مع دورة ضوء/ الظلام لمدة 12 ساعة طوال الرحلة.
2. مكان مراقبة الأرض (GC) الفئران في نفس الأجهزة الإسكان المستخدمة في الطيران وتطابق المعلمات البيئية مثل درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون (CO₂₎مستويات أقرب ما يمكن استناداً إلى بيانات القياس عن بعد.
3. تغذية GC الفئران نفس الغذاء ناسا بار النظام الغذائي كنظرائهم في الفضاء. تزويد كل من الرحلات الفضائية وفئران GC بنفس الوصول إلى الماء والغذاء.

2- تقييم الفئران بعد الطيران

1. في غضون 28 ساعة من splashdown على الأرض، ونقل الفئران إلى جامعة لوما ليندا (LLU). مرة واحدة هناك، وإزالة الفئران من الأجهزة الضميمة الحيوانية وتقييم للبقاء على قيد الحياة والصحة.
   ملاحظة: عند المراقبة، أفاد العاملون في عمليات التفتيش بأن جميع الفئران قد نجت من المهمة الفضائية التي استغرقت 35 يوماً وأنها في حالة جيدة، أي أنها لا تعاني من أوجه قصور/شذوذ ملحوظة.

3. تشريح والحفاظ على عيون الماوس بعد الرحلات الفضائية

1. في غضون 38 (±4) ساعات من splashdown (ن = 20/group) ، euthanize الفئران في 100 ٪ CO₂ وجمع عيونهم.
2. تشريح العين اليمنى شبكية العين ووضع بشكل فردي في cryة العقيمة، المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل، والحفاظ على في -80 درجة مئوية قبل استخدامها.
3. إصلاح العيون اليسرى كلها في 4٪ شبهformaldehyde في المالحة الفوسفات المخزنة مؤقتا (PBS) لمدة 24 ساعة ثم شطف مع المالحة الفوسفات المخزنة (PBS) لمقايس الأشعة المقطعية الدقيقة.

4. إعداد العينة للمسح الضوئي الدقيقة CT

1. بعد التثبيت ، يجفف عيون الفئران في الإيثانول. لمنع أي انكماش إضافي أو مفاجئ للعينة الثابتة ، استخدم سلسلة متدرجة من حلول الإيثانول: بدءًا من الإيثانول بنسبة 50٪ لمدة ساعة واحدة ثم زيادة تركيزات حلول الإيثانول على النحو التالي لمدة ساعة واحدة لكل من: 70 و 80 و 90 و 96 و 100٪.
   ملاحظة: يجب معالجة عيون الفئران في حجرة غطاء محرك السيارة.
2. حمض فوسفوموليبيديك (PMA) تلطيخ
   تنبيه: بسبب تآكل PMA ، وهو مسرطنة ، وسامة للأعضاء ، من الضروري توفير المعدات الشخصية الواقية المناسبة ، بما في ذلك استخدام غطاء الدخان.
   1. إعداد حل تلطيخ: 10 ملغ من PMA في 100 مل من الإيثانول المطلق.
   2. وصمة عينا الفئران (10 wt. ٪ حمض فوسفولوليبيديك - PMA حل في الإيثانول المطلق) لمدة 6 أيام.
   3. قبل المسح الضوئي، أولاً غسل العين العين العين في الإيثانول المطلق ومن ثم وضع كل العينين في الحاويات البلاستيكية 2 مل الفردية التي تمتلئ بالإيثانول المطلق 100٪. أضف لوحًا من القطن إلى عينات استقرت أثناء الفحص.

5- المسح الضوئي والتحليل الدقيقين

ملاحظة: تم استخدام الماسح الضوئي SkyScan 1272، وهو نظام تصوير مقطعي صغير بالأشعة السينية المكتبية، لتقييم تلف الشبكية في عيون الفئران

1. قم بتركيب عينة الأنسجة الرخوة إلى حامل عينة مناسب. لمنع أي حركة أثناء قياسات الأشعة السينية المقطعية، وضمان نوبة ضيقة من العينة على حاملها (الشكل 1).
2. عند المحاذاة الدقيقة لكل عينة، قم بمسح العينة ضوئيًا بشكل فردي عبر الأشعة السينية.
   1. بعد فتح البرنامج، مركز العينة في الإطار. في البروتوكول، لا تستخدم أي مرشح وتعيين المصفوفة لزيادة بكسل في 4 ميكرومتر. استخدام تحديد المواقع الصغيرة للحفاظ على مركز العينة على الإطار.
   2. بعد ذلك، تحقق من المعلمة لتكبير عامل التباين. لإجراء المعايرة، قم بإزالة العينة وتحقق من أن تصحيح الحقل المسطح أكبر من 80%.
   3. بعد المعايرة، أعد إدخال العينة إلى غرفة المسح. للمسح الضوئي، استخدم خطوة دوران 0.400، إطار متوسط 4، حركة عشوائية من 30، وتدوير العينات 180 درجة.
3. استخدام تجز تحديد المواقع للقياسات المتكررة. نظرا لتعزيز المرحلة التباين التي يتم تنفيذها على النحو المبين، يمكن الكشف عن تفاصيل الكائن صغيرة مثل 4 ميكرومتر من الأشعة السينية التي تم إنشاؤها بواسطة أنبوب الأشعة السينية مختومة التركيز الجزئي (الأنود التنغستن) في 50 كيلوفولت و 80 mA مع وقت التكامل من 90 دقيقة.
   ملاحظة: معلمات الاكتساب المحددة في هذا القسم للتحديد لإنتاج فحوصات مقطعية عامة ذات جودة أعلى صورة.
4. بعد المسح الضوئي، استخدم البرامج (مثل NRecon) لإعادة بناء البيانات.
   1. اضبط الرسم البياني واستخدم نفس النطاق (0 - 0.24) لجميع العينات. وكانت منطقة إعادة البناء ذات الاهتمام دائرة، ولم تستخدم أي جداول أو تسميات.
   2. للحد من القطع الأثرية أثناء المسح الضوئي ، واستخدام تصحيح شعاع تصلب 20 ، وتصحيح تجانس 1 ، والحد من قطعة أثرية حلقة من 6 ، وعدم إجراء أي تغيير في التعويض سوء المحاذاة. وبعد إعادة الإعمار، تأكد أن العينة كانت ضمن منطقة الاهتمام.
   3. إعادة وضع الصور باستخدام طائرة موازية للأعصاب البصرية وعدسة العينين.
5. بعد المسح الضوئي ، استخدم البرامج (مثل DataViewer) لتصور الصور التي أعيد بناؤها في جميع المشاهدات الثلاث.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر، مع هذا البرنامج، يمكن إعادة وضع الصور باستخدام طائرة موازية للأعصاب البصرية وعدسة العينين لإجراء تحليل موحد.
6. التحليل الوصفي
   1. قياس الهياكل باستخدام أداة قياس في البرنامج (مثل CTAn). استخدم العصب البصري لتحديد المنطقة التي تهم للتحليل. حسب الحساب، استخدم البروتوكول الشريحة الوسطى لإجراء القياسات. وقد تم إجراء هذا التقييم عن طريق التحليل الوصفي (الشكل 2 والشكل 3).
   2. إجراء قياسات شبكية العين، ظهارة صبغ الشبكية (RPE)، المشيمية، وطبقة سُلبة في القوس (الشكل 2) و النظرة المحورية (الشكل 3). اتخاذ ثلاثة قياسات لكل هيكل من أجل حساب متوسط.

النتائج

تم تسجيل متوسط سمك شبكية العين ، RPE ، المشيمية ، وطبقة sclera باستخدام الأشعة المقطعية الدقيقة بعد اتباع البروتوكول أعلاه (الشكل 1). وأظهرت هذه التقنية إعادة بناء متعددة الكواكب للعيون في ثلاث وجهات نظر مختلفة. أثناء التحليل، كان المراقب قادرا على التمرير خلال عينة كاملة لتوحيد التحليل الحق في منتصف العينة.

أظهر تحليل التصوير المقطعي المصغر المناطق المقطعية للعينين في منظر القوس والمحورية(الشكل 2 والشكل 3)التي تم تنفيذها القياسات الخطية. وكانت RPE وطبقة المشيمية بشكل ملحوظ أو الاتجاه أقل في مجموعة الرحلات الفضائية بالمقارنة مع مجموعة GC(الشكل 3).

الشكل 1: إجراء التصوير المقطعي الدقيق للأنسجة الرخوة. (A) عينة الأنسجة الرخوة (عين الماوس). (B) تم إصلاح عينات في الفورمالديهايد 4٪ في محلول الفوسفات العازل (PBS). بعد التثبيت، كانت عيون الفئران المجففة في الإيثانول. لمنع المزيد من الانكماش المفاجئ للعينة الثابتة، تم استخدام سلسلة متدرجة من الحلول الإيثانول، بدءا من الإيثانول 50٪ ل 1 ساعة وحلول الإيثانول التالية في التركيزات المذكورة، لمدة 1 ساعة لكل من: 70، 80، 90، 96 و 100٪. (C) كانت عيون الفئران ملطخة في حمض فوسفومووليبيديك (PMA) لمدة 6 أيام ، وغسلها في الإيثانول المطلق ثم وضعت في حاويات بلاستيكية فردية 2 مل مليئة بالإيثانول المطلق. (D)تم استخدام جهاز فحص نظام التصوير المقطعي المحوسب (X-ray) المكتبي لتقييم إصابة الشبكية في عيون الفئران. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: منظر القوس ماوس التحكم الأرضي. يتم تعليق طبقات العين على الجانب الأيمن من الصورة، من أعلى إلى أسفل، شبكية العين (0.077 ملم)، طبقة صبغ الشبكية (RPE، 0.038 مم)، المشيمية (0.041 مم)، sclera (0.059 mm). وقد أخذ هذا الرقم من Overbey^{وآخرون. 15}. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: منظر محوري لماوس التحكم الأرضي. يتم تعليق طبقات العين على الجانب الأيمن من الصورة، من أعلى إلى أسفل، شبكية العين (0.144 مم)، طبقة صبغ الشبكية (RPE، 0.051 مم)، المشيمية (0.041 مم)، sclera (0.073 mm). وقد أخذ هذا الرقم من Overbey^{وآخرون. 15}. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: متوسط سمك طبقة الشبكية، وطبقة RPE، وطبقة المشيمية التي تقاس بالأشعة المقطعية الدقيقة في مجموعات الرحلات الفضائية والتحكم. تم احتساب عدد مرات الـ 5 في كل مجموعة تم تمثيل القيم على أنها متوسط سمك ± خطأ قياسي (SEM). تم وضع علامة SEM من الوسط مع أشرطة الخطأ. أما نسبة سمك المقطع المقطعي في مجموعة الرحلات الفضائية (FLT) مقارنة بمجموعة التحكم الأرضي (GC) فيُسمَّى '*' (p < 0.05). وقد أخذ هذا الرقم من Overbey^{وآخرون. 15}. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وأظهرت نتائج هذه الدراسة أن هناك تغييرات هيكلية في العين الماوس الرحلات الفضائية باستخدام تقنية التصوير المقطعي المجهري بالمقارنة مع مجموعات GC، وخاصة من شبكية العين، وRPE، والطبقات المشيمية للعين، كما يتضح من انخفاض سماكتها. يوفر التصوير المقطعي الدقيق تقنية فعالة وغير مدمرة لتوصيف التغييرات دون الحاجة إلى التلاعب. وقد عزز استخدام تلطيخ PMA جودة صور التصوير المقطعي المجهري للحصول بنجاح على صور ملونة ثلاثية الأبعاد بعد إعادة البناء، مما تخلى عن أي حاجة إلى تغيير بنية العينة فعليًا. ومن المزايا الإضافية لهذه الصور أنها تعرض المنطقة محل الاهتمام الرقمي بأكملها، مما يزيد من إمكانية الوصول إلى النتائج وإمكانية استنساخها. من خلال الصور المقطعية الدقيقة التي تم إنتاجها خلال هذه الدراسة ، أظهرت العينة المستهدفة تمايزًا بين الهياكل المتعددة مثل شبكية العين ، وRPE ، وR choroid ، و layersclera لتحديد سمك كل طبقة.

خطوة حاسمة ضمن البروتوكول هو التلاعب من العينات بسبب حجمها والملمس. التعامل مع العينة يجب أن يتم بعناية دون الضغط على العينة أثناء إعداد. وللصورة الدقيقة لل CT بعض القيود: الدقة وعدم وجود قيم موحدة للبارامترات. أثناء المسح الضوئي، قد يكون لدى الماسحات الضوئية المقطعية الدقيقة المختلفة خوارزميات متنوعة لمعالجة الصور؛ ومع ذلك قد يتم متابعة معايرة للتدرج الرمادي للتغلب على أي مشكلة. بعد المسح، ينبغي أن يكون بناء الصور على أساس الأنسجة والتحليل الذي سيتم القيام به. يمكن أن يكون حاسما منذ جودة الصورة يعتمد على نظام الوروموغرافية، والإعدادات، وحجم العينة، فضلا عن أساليب إعداد^16،17.

نظراً لتطبيقها الناجح في دراسة عدة أنواع من الأنسجة الطبيعية وعلم الأمراض، وينبغي استخدام قدرات التصوير التصوير المقطعي الصغرى في البحوث المستقبلية لتجميع البيانات الحجمية لتحليلات أخرى. وهكذا، واستنادا إلى الغرض من هذه الدراسة، كان من المقبول استخدام قياسات ثنائية الأبعاد، ولكن تقسيم الهيكل الثلاثي الأبعاد الإجمالي يمكن أن يكون مفيدا أيضا لتوفير مخطط دقيق للعينة بأكملها. حتى مع كل مزايا تقنية غير مدمرة، فإن التصوير المقطعي المجهري لن يحل محل طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية، ولكنه سيكمل ويسمح بتحليلات الأنسجة اللاحقة إذا رغبت في ذلك.

وتُنتج حالة الرحلات الفضائية المطولة سلسلة من التغييرات العينية الهيكلية والوظيفية في رواد الفضاء أثناء وبعد البعثة الفضائية التي تعرف بأنها "سانس". وتشمل النتائج التحولات هيتوبيك، وتسطيح الكرة الأرضية، وطيات المشيمية / شبكية العين، والبقع القطنية^{الصوف 19}. على النقيض من التصوير المقطعي للترابط البصري لرواد الفضاء (أكتوبر) تم توثيق اكتشاف طبقة الألياف العصبية الشبكية سماكة ، ترقق الشبكية وطبقة المشيمية في هذه الدراسة الدقيقة المقطعية الحيوانية. وكانت هذه النتائج غير متوقعة. وقد يكون هذا التباين راجعاً إلى عوامل مربكة. الفئران لديها تحول سائل سيفلادود محدودة بالمقارنة مع الإنسان. وقد يكون هذا النقص في تحول السوائل قد أثار استجابات مختلفة لتغيرات الجاذبية. ثانيا، تم تشريح الفئران في غضون 38 ساعة بعد سبلاش، واستجابة حادة لإعادة التكيف قد تسهم أيضا في التغيرات المورفولوجية في شبكية العين والمشيمية. ويتطلب تأكيد هذه الإمكانية إجراء مزيد من القياسات أثناء الرحلات الفضائية وبعد انتهاء المهمة.

وتشير نتائج هذه الدراسة إلى أن ظروف الرحلات الفضائية، ولا سيما التغيرات الجاذبية، قد تُحدث استجابة حادة وقصيرة الأجل في العين. ويلزم إجراء مزيد من التحريات لتحديد عواقب التغيرات الحادة على العين على وظيفة الشبكية وآلية التغيرات في الهيكل المستحث بالتحليق الفضائي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 wt. % phosphomolybdic	Sigma	12026-57-2
Ethanol absolute by Baker Analyzed	VWR	80252500
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	L1825
X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner	Bruker