تقييم آثار الإجهاد على المرونة المعرفية باستخدام نموذج التحول الاستراتيجي الأوبراتي

Summary

أحداث الحياة المجهدة تضعف الوظيفة المعرفية، مما يزيد من خطر الاضطرابات النفسية. يوضح هذا البروتوكول كيف يؤثر الإجهاد على المرونة المعرفية باستخدام نموذج تحويل استراتيجية أوبرالي آلية في فئران سبراغ دولي الذكور والإناث. تتم مناقشة مناطق محددة في الدماغ تقوم عليها سلوكيات معينة، ويتم استكشاف الصلة الترجمية للنتائج.

Abstract

الإجهاد يؤثر على الوظيفة المعرفية. ما إذا كان الإجهاد يعزز أو يضعف الوظيفة المعرفية يعتمد على عدة عوامل، بما في ذلك 1) نوع وكثافة ومدة الإجهاد؛ 2) نوع الوظيفة المعرفية قيد الدراسة؛ و 3) توقيت الإجهاد فيما يتعلق التعلم أو تنفيذ المهمة المعرفية. وعلاوة على ذلك، تم توثيق الاختلافات بين الجنسين بين آثار الإجهاد على الوظائف المعرفية على نطاق واسع. وصف هنا هو التكيف مع نموذج التحول استراتيجية التشغيل الآلي لتقييم كيفية الاختلافات في الإجهاد تؤثر على المرونة المعرفية في الفئران داولي سبراغ الذكور والإناث. على وجه التحديد، يتم استخدام الإجهاد ضبط النفس قبل أو بعد التدريب في هذه المهمة القائمة على الأوبرال لفحص كيفية تأثير الإجهاد على الأداء المعرفي في كلا الجنسين. وقد تم تحديد مناطق معينة من الدماغ المرتبطة بكل مهمة في هذا النموذج الآلي (أي قشرة ما قبل الجبهية الوسطى والقشرة الجبهية المدارية). وهذا يسمح بالتلاعب المستهدف أثناء التجربة أو تقييم جينات وبروتينات معينة في هذه المناطق عند الانتهاء من النموذج. يسمح هذا النموذج أيضا بالكشف عن أنواع مختلفة من أخطاء الأداء التي تحدث بعد الإجهاد ، والتي حدد كل منها الركائز العصبية. كما تم تحديد اختلافات جنسية متميزة في الأخطاء المثابرية بعد نموذج الإجهاد المتكرر لضبط النفس. قد يكشف استخدام هذه التقنيات في نموذج ما قبل السريرية كيف يؤثر الإجهاد على الدماغ ويضعف الإدراك في الاضطرابات النفسية ، مثل اضطراب ما بعد الصدمة (PTSD) واضطراب الاكتئاب الكبير (MDD) ، والتي تظهر اختلافات جنسية ملحوظة في الانتشار.

Introduction

في البشر، يمكن أن تؤدي أحداث الحياة المجهدة إلى إضعاف الوظيفة الإدراكية (أي المرونة المعرفية^1)،مما يدل على القدرة على تكييف استراتيجيات المعالجة المعرفية لمواجهة ظروف جديدة في البيئة². ضعف في الإدراك يعجل ويفاقم العديد من الاضطرابات النفسية, مثل اضطراب ما بعد الصدمة (PTSD) واضطراب الاكتئاب الكبرى (MDD)^3,4. هذه الاضطرابات هي ضعف انتشارها في الإناث^5،6،7،8، ومع ذلك فإن الأساس البيولوجي لهذا التفاوت لا يزال غير معروف. ويمكن تقييم جوانب الأداء التنفيذي في البشر باستخدام بطاقة ويسكونسن فرز المهمة، وهو دليل على المرونة المعرفية². ضعف الأداء في هذه المهمة في المرضى الذين يعانون من اضطراب ما بعد الصدمة⁹ و MDD¹⁰، ولكن الأساس العصبي لهذا التغيير لا يمكن فحصه إلا عن طريق تصوير الدماغ¹¹.

وقد أحرز تقدم في فهم كيفية تأثير الإجهاد على الدماغ من خلال استخدام النماذج الحيوانية، ولا سيما القوارض. كما تتأثر المرونة المعرفية في الأمراض المرتبطة بالإجهاد، بل هو النمط الظاهري ذات الصلة بشكل استثنائي لفحص في القوارض. حتى الآن، استخدمت معظم الأدب العصبي الإجهاد نموذج المرونة المعرفية البديلة (يشار إليها أحيانا باسم مهمة الحفر)^{12،13،14،15}. في حين تم فحص هذه المهمة على نطاق واسع ، إلا أنها تتطلب المزيد من الوقت والجهد من قبل المجرب لتدريب القوارض. تكييفها ووصفها هنا هو راسخ الآلي مجموعة التحول بروتوكول¹⁶ لتقييم المرونة المعرفية في الفئران الذكور والإناث سبراغ دولي باستخدام نماذج الإجهاد المختلفة^17,18. يتطلب الإجراء الحد الأدنى من الرقابة من قبل المجرب ويسمح باختبار فئران متعددة في وقت واحد. وبالإضافة إلى ذلك، وخلافا للإصدارات الأخرى من هذه المهمة^{الآلية 19،}والتكيف مع هذا النموذج يتطلب فقط 3 أيام من التدريب ويتضمن تحليل البيانات المبرمجة كفاءة.

ما إذا كان الإجهاد يعزز أو يضعف الوظيفة المعرفية يعتمد على نوع وكثافة ومدة الإجهاد ، وكذلك توقيت الإجهاد فيما يتعلق بالتعلم أو تنفيذ مهمة معرفية^20،21. وهكذا، يتضمن البروتوكول إجراءات الإجهاد قبل وبعد التدريب الأوبراني. كما أنه يدرس النتائج التمثيلية لدراسات الإجهاد. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مناطق الدماغ الكامنة وراء جوانب معينة من مجموعة التحول كانت راسخة^2،16،22؛ وبالتالي، يصف التقرير أيضا كيفية استهداف وتقييم مناطق معينة من الدماغ أثناء أو بعد إجراءات تحويل الإجهاد والاستراتيجية.

كانت هناك بحوث محدودة على دراسة مباشرة الاختلافات بين الجنسين في المرونة المعرفية^18،23.  يصف البروتوكول كيفية 1) دمج كل من الفئران الذكور والإناث في النموذج التجريبي ، ثم 2) مسارات دورات استروس قبل وأثناء الإجراءات في ركوب الدراجات بحرية الإناث. وقد أشارت الدراسات السابقة إلى أن الإجهاد قبل التدريب الأوبراني يمكن أن يؤدي إلى عجز خاص بالجنس في المرونة المعرفية لدى^{الفئران 17.} على وجه الخصوص ، تظهر الفئران الإناث اضطرابات في المرونة المعرفية بعد الإجهاد ، في حين تتحسن المرونة المعرفية في الفئران الذكور بعد الإجهاد^17. ومن المثير للاهتمام أن السمة الرئيسية للاضطرابات النفسية المرتبطة بالإجهاد، والتي لها معدل إصابة متحيز جنسيا لدى البشر، هي عدم المرونة المعرفية. وتشير هذه النتائج إلى أن الإناث قد يكون أكثر عرضة لهذا النوع من الضعف الإدراكي من الذكور. استخدام هذه التقنيات في النماذج الحيوانية سوف يلقي الضوء على آثار الإجهاد على الدماغ وكيف يضعف الإدراك في الاضطرابات النفسية في البشر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في كلية برين ماور. الحصول على موافقة IACUC أو أي موافقة تنظيمية قابلة للتطبيق قبل طلب المختبر وبدء التجارب.

1. إعداد الحيوان

1. الحصول على الفئران الذكور والإناث الكبار سبراغ داولي.
   ملاحظة: يمكن تسليم الفئران قبل 65 يوما من العمر، ولكن لا تبدأ الإجراءات إلا بعد هذه النقطة لضمان أن كلا من الذكور والإناث ناضجة تماما.
2. زوج منزل الفئران من نفس الجنس لأطول فترة ممكنة، والعزلة على المدى الطويل هو الإجهاد²⁴. للقيود الغذائية، والجرذان منزل النهم فقط قبل بروتوكول التحول استراتيجية الأوبرالي.
3. بعد أسبوع واحد من التأقلم ، ابدأ بلطف في التعامل مع الفئران لمدة 3-5 دقائق يوميا. جمع وزن الجسم من كل الفئران. بالإضافة إلى ذلك، إذا كنت مهتما بتقييم كيفية تأثير هرمونات الغدد التناسلية على النتائج، فاجمع المرحاض المهبلي للفئران الإناث (الموضح في القسم 2).
4. تقييد (من الغذاء) الحيوانات التي سيتم تشغيلها في نموذج التحول استراتيجية الأوبرالي على الأقل 3 أيام قبل بدء التدريب بحيث تعلم بنجاح المهمة. تأكد من أن المياه متوفرة دائما مجانا. وينبغي الاحتفاظ بسجلات مكتوبة لكل لتوثيق الاستهلاك اليومي للغذاء والسوائل، وحالة الترطيب، وأي تغييرات سلوكية وسرية تستخدم كمعايير لإزالة مؤقتا أو دائما من بروتوكول (مورتون 2000؛ NRC 2003b).
   1. إذا كان استخدام إجراء الإجهاد لأكثر من 3 أيام قبل التدريب، وضبط تقييد الغذاء لتتناسب مع عدد أيام الإجهاد (على سبيل المثال، 5 أيام من ضبط النفس بالإضافة إلى تقييد الغذاء²⁵).
   2. كل يوم، وتقديم 80٪ من المداومة الغذائية اليومية العادية (أي، 4 غرام من المواد الغذائية لكل 100 غرام من وزن الجسم)²⁶. استخدام جمع الوزن اليومي للفئران لحساب مقدار الطعام لإعطاء كل يوم.
   3. مواصلة تقييد الغذاء خلال أيام التدريب والاختبار. ومع ذلك، لا تضع الطعام في القفص المنزلي إلا بعد أن يكمل الجرذ التدريب أو الاختبار لهذا اليوم، وإلا فلن يكون لديهم الدافع لأداء المهام للحصول على مكافأة بيليه الطعام. تأكد من أن توقيت تسليم الطعام إلى الفئران عند الانتهاء من المهمة لا يمكن التنبؤ بها إلى حد ما لأن هذا يساعد على تجنب انخفاض الدافع لأداء في غرفة الأوبرا (لصالح مجرد انتظار الطعام في القفص المنزلي بعد ذلك).
      ملاحظة: الحيوانات التي تمر نموذج الإجهاد ضبط النفس لا تظهر فقدان الوزن أكبر بكثير من السيطرة، والمواضيع غير المجهدة. ومع ذلك، قد تؤدي إجراءات الإجهاد المختلفة نفسها إلى فقدان الوزن، مما يؤدي إلى تلقي الفئران طعاما أقل من نظيراتها غير المجهدة أثناء تقييد الطعام القائم على وزن الجسم. قد يقدم هذا الإجهاد إضافية، محيرة. إذا كان هذا هو الحال، بدلا من ذلك استخدام كمية ثابتة من الطعام تعطى لكل موضوع، بغض النظر عن الوزن²⁷.

2. المرحاض المهبلي

ملاحظة: هرمونات غدد (أي الإستروجين والبروجستيرون) معروفة بالتأثير على استجابة الإجهاد^{والإدراك 28،29،30}. تتقلب هذه الهرمونات على مدى دورة استروس من الفئران الإناث³¹. إذا كنت مهتما بتتبع دورة استروس من القوارض الأنثوية التي تدور بحرية للارتباط ببيانات الإجهاد أو المرونة المعرفية ، فجمع المرحاض المهبلي كما هو موضح أدناه. لا يتم توفير البيانات التمثيلية التي تنظر في مرحلة دورة estrous.

1. للحصول على عينات من المراحيض المهبلية من الإناث ، اجمع الماء الدافئ في كوب نظيف ، ومنظار زجاجي ، وشريحة "lavage" (شريحة المجهر مع دوائر طلاء الأكريليك لعقد عينة المرحاض) ، وكأس واحد فارغ.
2. ملء eyedropper مع كمية صغيرة من الماء الدافئ (~ 0.5 مل) ، ثم إدراج طرف في المهبل من الفئران الإناث (عن طريق رفع ذيله). طرد الماء العقيم 2x-3x وطرد السائل التي تم جمعها على الشريحة المجهرية. لا تجاوز دائرة الشريحة lavage.
3. طرد أي سائل الزائدة في الكأس فارغة. تسمية الشريحة lavage مع أعداد الفئران ووضع العينات من كل الفئران في هذا الترتيب لذلك فمن الواضح أي عينة ينتمي إلى كل الفئران.
4. شطف دقيق eyedropper عن طريق الأنابيب المياه الدافئة النظيفة والاستغناء عنها في الكأس "الزائدة" عدة مرات قبل ملء قطرة العين لعينة الجرذ المقبل.
5. حمل بعناية الشريحة lavage إلى مجهر برايتفيلد لتصوير عينة lavage وتصنيف اليوم داخل دورة استروس كما هو موضح في بيكر وآخرون³¹.
   ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي أن يتم lavaging لبضعة أسابيع لتتبع دورة الإناث بشكل صحيح، وينبغي أن يتم في وقت مشابه جدا كل يوم للسيطرة على إيقاعات circadian. ويفضل أن يتم هذا الإجراء قبل الإجهاد وإجراءات تحويل الاستراتيجية العملية. ويمكن أيضا استخدام مسحات القطن والمحلول الملحي المعقم كبديل لهذه التقنية العين القطارة. يمكن تحليل البيانات الخاصة بالجرذان الإناث بعد الاختاث وفقا ليوم دورة estrous (فكر في أيام الدورة عندما يتم إجراء الإجهاد و / أو يوم الدورة عند إجراء الاختبار).

3. المعدات والبرامج

1. استخدام غرف الأوبرال للتدريب السلوكي والاختبار.
   1. تأكد من أن الغرف تحتوي على اثنين على الأقل من العتلات القابلة للسحب مع اثنين من أضواء التحفيز أعلاه، وضوء المنزل، وموزع لتعزيز لهذه المهام.
   2. تأكد من أن العتلات على جانبي منطقة تسليم التعزيز المركزية مع ضوء تحفيز واحد فوق كل رافعة.
   3. استخدام ضوء المنزل لإلقاء الضوء على الغرفة دون التدخل في الكشف عن التحفيز الخفيف (فمن الأفضل إذا كان ضوء المنزل على الجدار الخلفي للغرفة، مقابل العتلات وأضواء التحفيز).
2. استخدام الكريات الغذائية الغبار (هنا، وتستخدم 45 الكريات ملغ: 18.7٪ البروتين، 5.6٪ من الدهون، و 4.7٪ من الألياف) لتعزيز في الفئران المقيدة بالطعام. لا تستخدم الكريات عالية في السكروز أو الدهون (إلا إذا كان هناك اهتمام في كيفية تأثير الإجهاد على تناول الطعام المستساغ).
3. التحكم في عرض المحفزات، وتشغيل رافعة، وجمع البيانات من جهاز كمبيوتر مع برامج قادرة على تشغيل الغرفة (جدول المواد).
   ملاحظة: للحصول على معلومات تتعلق ترميز البرامج باستخدام هذا البرنامج، اتصل الكتاب. يتم تضمين البرامج النصية MED-PC كملفات تكميلية. يجمع هذا البرنامج معلومات حول استجابات الحيوان لكل تجربة (أي رافعة يتم الضغط عليها ، وما إذا كانت استجابة صحيحة / غير صحيحة / لا ، والتأخر في الاختيار). من هذه المعلومات، يمكن للمستخدمين حساب مقاييس مختلفة في النموذج السلوكي، كما هو موضح في قسم التحليل السلوكي.
4. إجراء التدريب / الاختبار في نفس الوقت كل يوم للسيطرة على إيقاعات circadian في هرمونات الإجهاد³² (وغيرها من التدابير ذات الصلة).
5. ملء الدرج السفلي من كل مربع أوبرالي مع الفراش الطازجة لجمع البراز / النفايات. بعد كل جلسة، قم بإلقاء كل صينية وصيايات نظيفة وداخلية للغرفة مع مناديل كحولية أو مطهر معتمد من IACUC، واستبدلها بفراش طازج قبل وضع جديد في الغرفة.

4. إجراءات الإجهاد

1. تقرر ما إذا كان ينبغي إجراء الإجهاد قبل وأثناء و / أو بعد التدريب على نموذج التحول استراتيجية الأوبرالية (على سبيل المثال، 5 أيام من الإجهاد ضبط النفس قبل 3 أيام من التدريب الأوبرالية مقابل 3 أيام من التدريب الأوبرالية تليها ضبط النفس واحد والاختبار).
2. تنفيذ إجراءات الإجهاد في نفس الوقت يوميا فيما يتعلق بالتدريب الأوبرالي. (على سبيل المثال، 30 دقيقة من الإجهاد ضبط النفس ابتداء من الساعة 9 A.M، تليها التنسيب في غرفة الأوبرا).
3. تنفيذ إجراءات الإجهاد في غرفة منفصلة عن كل من غرفة مستعمرة واستراتيجية تغيير غرف النموذج (لضمان عدم وجود عوامل محيرة المرتبطة الإجهاد الشاهد)³³. لفترة وجيزة، ضع الجرذ في أنبوب ضبط النفس شفافة على غرار بروم وختم الافتتاح، مع الحرص على عدم قرصة الأطراف أو الذيل. بين كل موضوع، استخدم مطهرا معتمدا من IACUC لتنظيف الأنبوب على غرار Broome. يمكن أن يترك التصحين غير السليم الفيرومونات وراء ذلك يمكن أن يؤثر سلبا على بروتوكول الاختبار.
   ملاحظة: تقدير المدة التي ستقضيها المجموعة الأولى من الفئران في الغرف الأوبرالة. وهذا يختلف تبعا للتدريب مقابل يوم الاختبار; ومع ذلك، بعد تشغيل عدة مجموعات، يمكن حساب متوسط الوقت لإكمال كل مهمة لتقدير المهام المستقبلية.
4. اعتمادا على عدد الغرف الأوبرالة المتاحة، ترنح إجراءات الإجهاد للمواضيع. على سبيل المثال، أربعة فئران تخضع لضغوط ضبط النفس ويتم وضعها في أربع غرف أوبراتية. وبعد ساعة واحدة، تخضع أربعة أخرى لإجراءات إجهاد تتبعها الغرفة الأوبراليه.

5. التدريب

ملاحظة: يتم تعديل هذا النموذج من الإجراء التشغيلي لتحويل مجموعة التي وضعتها فلوريسكو وآخرون بحيث يمكن أن تكتمل في 3 أيام¹⁹.  تتطلب إجراءات التدريب للفئران 3 أيام (يوم واحد لتعلم كل مهمة على النحو المبين أدناه). من النادر أن لا يتعلم الجرذ هذه المهام. إذا فشل الجرذ في تعلم كل مهمة، فيجب استبعاده من الدراسة النهائية. انظر الشكل 1A للحصول على تصوير مرئي لنموذج التدريب الموضح أدناه.

1. قبل وضع الجرذ في الغرفة، تأكد من وجود ما يكفي من الكريات الغذائية في موزع وأن صناديق الأوبرا تعمل بشكل صحيح. لتحقيق ذلك، تحميل وبدء برنامج يوم التدريب أو اختبار في غرفة فارغة، واختبار يدويا أن رافعة الصحيح يسلم بشكل مناسب مكافأة واحدة لكل الصحافة رافعة.
2. تدريب الجرذ للضغط على كل رافعة
   1. قبل وضع الجرذ في المربع لليوم الأول من التدريب ، قم بتعيين مكافأة واحدة يدويا على الرافعة الصحيحة ، كما هو محدد عند تحميل إجراء التدريب داخل كل غرفة.
   2. تدريب الفئران باستخدام نسبة ثابتة (FR-1) الجدول الزمني، بحيث يكافأ كل الصحافة رافعة الصحيح مع تعزيز واحد. موازنة رافعة الصحيح يوميا عبر المواضيع و / أو الشروط التجريبية (تشكيل رافعة واحدة فقط في وقت واحد) عن طريق تعيين رافعة الصحيح عند تحميل إجراءات التدريب على الكمبيوتر تشغيل الغرف.
   3. السماح للجرذ للضغط على رافعة حتى تصل إلى المعيار عن طريق الضغط على رافعة الصحيح 50x، وعادة ما يكمل المهمة بين 30-45 دقيقة.
   4. في اليوم التالي يجبر الجرذ على أداء هذه المهمة على رافعة المعاكس باستخدام نفس البرنامج في اليوم الأول من التدريب، ولكن تعيين رافعة المعاكس باعتبارها واحدة الصحيح. ليست هناك حاجة إلى "تشكيل" رافعة مع بيليه الغذاء في هذا اليوم من التدريب. عادة، يتم الحصول على هذا المعيار بسرعة بعد الفئران تعلمت للضغط على رافعة الأولى.
3. تدريب الجرذ على الاستجابة للإشارة الضوئية
   1. في اليوم الثالث من التدريب، تضيء الضوء فوق كل من العتلات للتجارب 15 ق، خلالها الجرذ قد اضغط على واحدة من رافعة لتلقي مكافأة بيليه الغذاء المحتملة. خلال مهمة التمييز الخفيف، سيختار هذا البرنامج عشوائيا الرافعة الصحيحة على أساس كل تجربة على حدة.
   2. إذا ضغط الفأر على الرافعة الصحيحة، فتأكد من أن تظل الأضواء مضاءة لمدة 3 ق ويتم تسليم المكافأة، تليها فترة 5 ق، يتم خلالها إيقاف تشغيل الأضواء قبل التجربة التالية. إذا ضغط الفأر على الرافعة غير الصحيحة، فتأكد من عدم تسليم أي مكافأة وإغلاق الأضواء لمدة 10 ق قبل التجربة التالية.
   3. بعد هذا اليوم الأخير من التدريب، احسب "التحيز الجانبي" لتحديد ما إذا كان الجرذ يفضل الرافعة اليسرى أو اليمنى عن طريق قسمة عدد المطابع من رافعة واحدة مقسومة على العدد الإجمالي لمكابس الرافعة. في يوم الاختبار، سيبدأ الجرذ في الجانب الأقل تفضيلا لضمان تعلمه للطوارئ المحددة للاستجابة والمكافأة، بدلا من الاستجابة لرافعة مفضلة.

6. اختبار

ملاحظة: راجع الشكل 1B للحصول على تصوير مرئي لنموذج الاختبار الموضح أدناه.

1. في اليوم 4 (يوم الاختبار) ، ضع الجرذ في غرفة العمليات بعد إجراءات الإجهاد واختبرها في التمييز الجانبي ، والتراجع الجانبي ، ومهام التمييز الخفيف بشكل متسلسل. تأكد من أن مهمة التمييز الخفيف تضيء الضوء فوق الرافعة "الصحيحة". وفي كل مهمة، يجب على الفئران أن تحقق على التوالي ثماني تجارب صحيحة لإكمال كل تمييز دون الضغط على الرافعة غير المتحققة وغير الصحيحة. صحافة رافعة غير صحيحة سوف إعادة تعيين هذه السلسلة من المحاكمات.
   1. اختبار الفئران باستخدام مهمة التمييز الجانبي. باستخدام برنامج التمييز الجانبي ، قم بمكافأة الجرذ للضغط على الرافعة على الجانب الأقل تفضيلا كما هو محدد من اليوم الثالث للتدريب ، بغض النظر عن الإشارة الخفيفة. تنتهي المهمة عند الضغط على ذراع الصحيح 8x على التوالي (باستثناء الإغفالات).
   2. إجراء اختبار عكس الجانب عن طريق تشغيل الفئران باستخدام برنامج التمييز الجانب مرة أخرى، ولكن هذه المرة تعيين رافعة عكس الصحيح واحد من مهمة التمييز الجانب كما الصحيح. تأكد من مكافأة الجرذ على الضغط على هذه الرافعة، بغض النظر عن الإشارة الضوئية. تنتهي المهمة عند الضغط على ذراع الصحيح 8x على التوالي (باستثناء الإغفالات).
   3. أداء مهمة التمييز الخفيفة، والتي تكافئ الجرذ للضغط على رافعة مع ضوء مضيئة أعلاه. كل اختبار أوبرالي يكتمل عند الضغط على الرافعة الصحيحة 8x على التوالي (باستثناء الإغفالات).
      ملاحظة: استنادا إلى الدراسات السابقة، هذه المهام ترميز ما لا يقل عن 30 التجارب، بغض النظر عن المطابع المتتالية، لضمان أن الفئران لديها الوقت الكافي لتعلم قواعد كل مهمة¹⁸. وهكذا، إذا حقق الجرذ على التوالي ثماني تجارب صحيحة قبل إجراء 30 تجربة، فإن المهمة ستظل منوطة حتى يتم الانتهاء من 30 تجربة.

7. التحليل السلوكي

ملاحظة: يتم تسجيل البيانات التي تم الحصول عليها لكل في يوم الاختبار وحفظها بواسطة الكمبيوتر تلقائيا، طالما تم بدء تشغيل برنامج نصي MED-PC لكل مهمة والسماح له بإكمال (راجع المواد التكميلية لنصوص MED-PC).

1. افتح البيانات لكل مهمة يوم اختبار (تمييز جانبي، وانعكاس جانبي، وتمييز خفيف) باستخدام برنامج الكمبيوتر. والتدابير الرئيسية التي يسجلها البرنامج هي التجارب على المعيار، والأخطاء في المعيار، والوقت اللازم للمعيار. ويرد أدناه وصف تفصيلي لهذه التدابير.
   ملاحظة: قام المؤلفون بإنشاء برنامج نصي MATLAB يسمح بأتمتة عملية التحليل بالإضافة إلى تحليل الأخطاء المثابرة مقابل الأخطاء التراجعية (مؤلفو جهات الاتصال للحصول على معلومات التعليمات البرمجية لتبسيط تحليل البيانات).
   1. استخدم التجارب للمعيار (الذي يشير إلى العدد الإجمالي للتجارب [دون تضمين الإغفالات] اللازمة للجرذ لإكمال ثماني تجارب صحيحة على التوالي، بما في ذلك تلك التجارب الثماني) كمؤشر رئيسي للدقة. توجد هذه البيانات في العمود الأول في الصفيف B في ملف بيانات تم إنشاؤه بواسطة البرنامج النصي MED-PC لأي من المهام في يوم الاختبار.
   2. فحص إجمالي الأخطاء التي تم إجراؤها أثناء كل مهمة. توجد هذه البيانات في العمود الثالث من الصفيف B في ملف بيانات تم إنشاؤه بواسطة البرنامج النصي MED-PC لأي من المهام في يوم الاختبار. يتم تصنيف هذه الأخطاء أيضا إلى أخطاء متكررة أو تنازلية. يتم ارتكاب أخطاء المثابرة عندما يستمر الجرذ في اتباع القاعدة السابقة من المهمة السابقة. يتم ارتكاب أخطاء تنازلية بعد فك الارتباط من القاعدة السابقة ولكن يستمر في محاولة الحصول على قاعدة جديدة (لمزيد من التفاصيل حول كيفية حساب هذه الأنواع من الأخطاء، راجع الأسلوب المنشور¹⁸).
   3. إذا لم يستجب الجرذ لإشارة ضوئية في غضون 15 s ، يتم تصنيف التجربة على أنها إغفال ، ولن تحسب في العدد الإجمالي للمحاكمات وفقا للمعيار. حساب هذا أولا بإضافة معا عدد الاستجابات الصحيحة (الموجود في العمود الثاني من الصفيف B في ملف البيانات) وعدد الأخطاء (الموجودة في العمود الثالث من الصفيف B في ملف البيانات). بعد ذلك، طرح هذا الرقم من العدد الإجمالي للتجارب إلى المعيار (هذا هو الرقم الأخير في العمود الأول من الصفيف B في ملف بيانات، مختلفة من التجارب إلى المعيار).
   4. استخدم أوقات البدء والانتهاء المسجلة من قبل البرنامج (الموجود في أعلى ملف بيانات تم إنشاؤه بواسطة البرنامج النصي MED-PC لأي من المهام في يوم الاختبار) لحساب الوقت إلى المعيار. يمكن أيضا حساب زمن الوصول إلى ضغط الرافعة الأول من ملف البيانات عن طريق طرح المتغير K (الوقت المنقضي بالثواني من ضغط الرافعة الأولى) من الوقت إلى المعيار.
   5. متوسط البيانات لكل مقياس سلوكي للفئران داخل نفس مجموعة العلاج. إجراء التحليلات الإحصائية المناسبة (اعتمادا على عدد المتغيرات التي يتم فحصها).

8. ركائز الدماغ

1. تحديد منطقة الدماغ المهتمة و / أو جانب من جوانب المرونة المعرفية. على سبيل المثال، إذا زاد الإجهاد من الأخطاء المثابرية في مهمة الانعكاس الجانبي، فقد تكون القشرة الجبهية المدارية (OFC) ذات أهمية خاصة، حيث أشارت دراسات الآفات السابقة إلى أن منطقة الدماغ هذه تلعب دورا في العديد من أشكال التعلم العكسي (أي الانعكاس المكاني الذي تم اختباره في مهمة الانعكاس الجانبي)^34و35و36. في هذا المثال، التضحية الفئران بعد اكتمال نموذج التحول الاستراتيجية ودراسة ج-fos (قياس التنشيط العصبي³⁷) في OFC باستخدام أساليب المناعة الكيميائية الموصوفة²⁵ ووصفها لفترة وجيزة هنا.
   1. أولا، استخراج العقول من الحيوانات وقطع إلى شرائح 40 ميكرومتر.
   2. غسل الأنسجة في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) 4x لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم احتضان في بيروكسيد الهيدروجين 0.3٪ لمدة 10 دقائق لإرواء البيروكسيدات الذاتية.
   3. غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 2x لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم احتضان في الماوس المضادة للج- fos الأجسام المضادة الأولية (1:500)، 3٪ مصل الحمير العادي (NDS)، و 0.3٪ تريتون X بين عشية وضحاها.
   4. في اليوم التالي، وغسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم احتضان في البيوتين-SP-اقتران حمار المضادة للفأرة الأجسام المضادة للفأرة (1:500) لمدة 2 ساعة.
   5. غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم احتضان في مجمع AVIDIN-streptavidin AB لمدة 1 ساعة.
   6. غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم احتضان في حل DAB لمدة تصل إلى 10 دقيقة كما يخضع الأنسجة رد فعل الأكسدة الكروموجينيك.
   7. غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم جبل شرائح الدماغ على الشرائح المجهر الزجاجي.
   8. Coverslip الأنسجة باستخدام الطولوين القائم على تركيب المتوسطة والصورة باستخدام المجهر brightfield.
      ملاحظة: هنا، كما هو مبين في النتائج التمثيلية، يتم التضحية الفئران 30 دقيقة بعد انتهاء نموذج التحول الاستراتيجية، ما يقرب من 60-90 دقيقة بعد الانتهاء من مهمة عكس (اعتمادا على أداء كل الفئران في مهمة الضوء). يجب أن يمثل هذا التوقيت الأمثل للتعبير c-fos³⁸، مما يعكس الأداء في مهمة الانعكاس.
2. بدلا من ذلك، cannulate منطقة الدماغ محددة لحقن المخدرات أو الحقن الفيروسي قبل تنفيذ الإجهاد أو نموذج التحول استراتيجية أوبرالي.
   ملاحظة: قد يرغب الباحثون في فحص كيفية تغيير التلاعب بالركائز العصبية لآثار الإجهاد على المرونة المعرفية. على سبيل المثال، يمكن للباحثين منع مستقبلات ناقل عصبي معين في قشرة الجبهي قبل الاختبار.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم استخدام نموذج التحول في الاستراتيجية الآلية المكيفة المبينة أعلاه لتحديد ما إذا كان الإجهاد المتكرر لضبط النفس يؤثر على الإدراك لدى الفئران الذكور والإناث في سبراغ دولي. يتم وصف البيانات السلوكية التمثيلية في الشكل 2 أدناه. باختصار، أدت الفئران التي تسيطر عليها وتقيده...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يوضح البروتوكول كيفية قياس آثار الإجهاد على الوظائف المعرفية. على وجه التحديد ، يتم استخدام نموذج تحويل استراتيجية أوبرالي معدل في القوارض ، والذي يقيس المرونة المعرفية (على سبيل المثال لمهمة فرز بطاقة ويسكونسن في البشر)¹. المرونة المعرفية تدل على القدرة على التكيف مع استرات?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 inch glass pipette eye droppers	Amazon	4306-30-012LC	For vaginal lavage
Alcohol Wipes	VWR	15648-990	To clean trays in set shifting boxes between rats
Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse lgG (H+L), minimal cross reaction to bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, sheep serum proteins	Jackson ImmunoResearch	715-065-150	All other DAB protocol staining materials are standard buffers/DAB and are not specified here, as this is not the main focus of the methods paper
C-fos mouse monoclonal primary antibody	AbCam	ab208942	To stain neural activation in brain areas after set shifting
Dustless Food Pellets	Bio Serv	F0021	For set shifting boxes (dispenser for reward)
GraphPad Prism			Used for data analysis
Leica DM4 B Microscope and associated imaging software	Leica		Lots of different parts for the microscope and work station, for imaging lavage and/or cfos
MatLab			Software; code to help analyze set shifting data, available upon request.
Med-PC Software Suite	Med Associates	SOF-736	Software; uses codes to operate operant chambers
Operant Chambers	Med PC	MED-008-B2	Many different parts for the chamber set up and software to work with it; we also wrote a separate code for set shifting, available upon request.
Rat Bedding	Envigo	T.7097
Rat Chow	Envigo	T.2014.15
Restraint Devices	Bryn Mawr College	Made by our shop	For stress exposure; specifications available upon request.
Scribbles 3d fabric paint	Amazon	54139	For vaginal lavage
Sprague Dawley Rats	Envigo		At least D65 Males and Females
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR	48311-703	For vaginal lavage and/or brain slices/staining for c-fos