إعداد الأنسجة القلبية المهندسة على شكل شبكة مشتقة من خلايا iPS البشرية لإصلاح عضلة القلب في فيفو

Summary

يولد هذا البروتوكول أنسجة قلبية هندسية على شكل شبكة تحتوي على خلايا القلب والأوعية الدموية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان للسماح بالتحري عن علاج زرع الخلايا لأمراض القلب.

Abstract

يصف البروتوكول الحالي طرقًا لتوليد أنسجة قلبية هندسية قابلة للتطوير على شكل شبكة (ECTs) تتكون من خلايا القلب والأوعية الدموية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريًا (hiPSCs) ، والتي يتم تطويرها لتحقيق هدف الاستخدام السريري. يتم خلط خلايا القلب ذات المشتقات القلبية المستمدة من HiPSC وخلايا البطانية وخلايا جدارية الأوعية الدموية مع مصفوفة هلام ثم تصب في قالب أنسجة متعدد الإثيل (PDMS) مع وظائف داخلية مستطيلة متداخلة. حسب الثقافة اليوم 14 ECTs تنضج في 1.5 سم × 1.5 سم هيكل شبكة مع 0.5 ملم قطر حزم myofiber. تتوافق الخلايا القلبية القلبية مع المحور الطويل لكل حزمة وتضرب بشكل متزامن. ويمكن توسيع نطاق هذا النهج إلى أكبر (3.0 سم × 3.0 سم) شبكة ECT مع الحفاظ على بناء النضج وظيفة. وهكذا، قد تكون ECTs على شكل شبكة ولدت من خلايا القلب المشتقة من hiPSC قابلة للتطبيق لنماذج تجديد القلب.

Introduction

وقد أكدت العديد من الدراسات قبل السريرية والتجارب السريرية كفاءة العلاجات تجديد القلب القائم على الخلايا لفشل قلوب^1,2,3. من بين أنواع الخلايا المختلفة ، والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) هي مصادر الخلايا الواعدة بحكم قدرتها على التكاثر ، وإمكانية توليد مختلف الأنساب القلبية الوعائية⁴،^5،و التلوي. وبالإضافة إلى ذلك، جعلت تكنولوجيات هندسة الأنسجة من الممكن نقل الملايين من الخلايا إلى قلب^{التالفة 5،6،7،8.}

سابقا، أبلغنا عن توليد ثلاثي الأبعاد (3D) أنسجة القلب هندسة خطية (ECTs) من أنساب القلب والأوعية الدموية المستمدة من هيبسك باستخدام نظام الثقافة المتاحة تجاريا للأنسجة 3D الارتفتيفial^5،7. وجدنا أن التعايش بين الخلايا البطانية الوعائية والخلايا الجدارية مع خلايا القلب داخل العلاج بالصدمات الكهربائية سهل نضج الأنسجة الهيكلية والكهروائية. وعلاوة على ذلك، قمنا بالتحقق من صحة الإمكانات العلاجية للهبسة-ECTs مزروعة في نموذج احتشاء فئران عضلة القلب المتسامحة من أجل تحسين وظيفة القلب، وتجديد عضلة القلب، وتعزيز تولد الأوعية⁵. ومع ذلك، كانت ECTs الخطية التي شيدت من خلال هذه الطريقة 1 مم من 10 ملم اسطوانات وبالتالي ليست مناسبة لزرع في الدراسات قبل السريرية مع الحيوانات الكبيرة أو الاستخدام السريري.

استنادا إلى الاستخدام الناجح لقوالب الأنسجة لتوليد تشكيل الأنسجة هندسية المسامية باستخدام الفئران الهيكل العظمي myoblasts وdyoblasttes cardiomyocytes⁹, الإنسان ESC المشتقة cardiomyocytes¹⁰ والفأر iPSCs¹¹, وضعنا بروتوكول لتوليد القابلات التوسعية hiPSC المشتقة من الأنسجة الكبيرة المزروعة باستخدام قوالب polydimethylsiloxane (PDMS). قمنا بتقييم مجموعة من هندسات العفن لتحديد خصائص العفن الأكثر فعالية. أظهرت ECTs على شكل شبكة مع حزم وتقاطعات متعددة خصائص ممتازة في جدوى الخلية ، وظيفة الأنسجة وقابلية التوسع مقارنة مع الورق العادي أو الأشكال الخطية التي تفتقر إلى المسام أو الوصلات. قمنا بزرع العلاج بالصدمات الكهربائية على شكل شبكة في نموذج احتشاء عضلة القلب الفئران وأكد آثاره العلاجية مماثلة لECTs أسطواني مزروع¹². هنا نحن وصف البروتوكول لتوليد ECT على شكل شبكة hiPSC المستمدة.

Protocol

1. الحفاظ على الهيبات والتمايز القلب والأوعية الدموية

1. توسيع والحفاظ على hiPSCs على طبقة رقيقة مصفوفة غشاء الطابق السفلي (عامل النمو خفضت، 1:60 تخفيف) في المتوسطة مكيفة المستخرجة من الليفية الجنينية الماوس (MEF-CM) مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية البشرية (hbFGF)⁴.
   ملاحظة: استخدمنا خط hiPSCs (4-factor (Oct3/4 و Sox2 و Klf4 و c-Myc): 201B6). إضافة hbFGF في التركيز المناسب لكل خط الخلية. يمكن أيضا أن تستخدم لامينين-511 جزء لطلاء طبق الثقافة بدلا من مصفوفة غشاء الطابق السفلي. ويمكن استخدام المتوسطة المتاحة تجارياً والمصممة لثقافة الأعلاف الخالية من الهفوات المكلّف بـ MEF-CM.
2. استخدم رابطة الأمهات (0.48 mM Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) محلول) لفصل وتفكك الخلايا عندما يصل التقاء الخلايا إلى 90\u2012100%.
   ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام منتجات أخرى متاحة تجارياً للتفكك الخلوي.
3. خلايا لوحة بكثافة 10،000 الخلايا / ملم² على لوحات ثقافة الخلية المغلفة بالمصفوفة في MEF-CM مع hbFGF والثقافة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.
4. عندما تصبح الثقافة التقاء كامل، تغطية الخلايا مع مصفوفة (1:60 تخفيف مع MEF-CM) ليوم واحد.
5. استبدل المتوسط المتوسط MEF-CM مع 1640 1640 + B27 المتوسطة. إضافة 100 نانوغرام / مل من أكتيفين A و 100 نانوغرام / مل من Wnt3A إلى المتوسطة ليوم واحد.
   ملاحظة: هذا هو اليوم 0 من التمايز. ل upregulate الإشارات WNT الكنسي، يمكن أيضا أن تستخدم مثبطات GSK3β بدلا من Wnt3A.
6. في اليوم 1 من التمايز، وتغيير متوسطة إلى جديدة 1640 + B27 مع 10 نانوغرام / مل من BMP4 و 10 نانوغرام / مل من hbFGF. خلايا الثقافة لاثنين (بروتوكول MC) أو أربعة أيام (CM + EC بروتوكول) دون تغيير متوسط⁵.
   ملاحظة: تم تحسين CM + EC بروتوكول في وقت واحد لحث cardiomyocytes (CMs) والخلايا البطانية الوعائية (ECs). تم تحسين بروتوكول MC للحث بشكل تفضيلي على الخلايا الجدارية الوعائية (MCs).
7. CM + EC بروتوكول لحث CMs وECs (الشكل 1A).
   1. استبدال المتوسطة في اليوم 5 من التمايز مع 1640 + B27 1640 27 غم / مل من VEGF₁₆₅.
   2. تغيير الثقافة المتوسطة كل 48 ح حتى يوم 13\u201215 من التمايز.
8. بروتوكول MC لاستقرار الخلايا الجدارية الأوعية الدموية (الشكل 1B)
   1. استبدال المتوسطة مع RPMI1640 + 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) في اليوم 3 من التمايز.
   2. تغيير الثقافة المتوسطة كل 48 ح حتى يوم 13\u201215 من التمايز.

2. الخلية الحصاد وتحليل النسب في يوم التمايز 13\u201215

1. اغسل الخلايا بـ Ca²⁺ و Mg²⁺ محلول ملحي خالي من الفوسفات (PBS).
2. إضافة حل تفكك الخلية (التي تحتوي على البروتياز، الكولاجين وDNAses) في طبق ثقافة الخلية لتغطية لوحة. احتضان لوحة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
3. جمع وفصل الخلايا مع المتوسطة الثقافة باستخدام ماصة بعد الحضانة.
4. تخصيص 1 × 10⁶ خلايا لتحليل النسب مع عملية استئصال الخلايا التدفق. للقضاء على الخلايا الميتة، وصمة عار الخلايا مع صبغة قابلة للإصلاح قابلة للحياة.
5. وصمة عار الخلايا مع علامات سطح الغشاء في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS. استخدام التخفيفات التالية من الأجسام المضادة في الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا (FACS) تلطيخ العازلة: المضادة PDGFRβ (1:100)، المضادة لـ VE cadherin (1:100)، مكافحة TRA-1-60 (1:20).
6. بالنسبة للبروتينات داخل الخلايا، قم بإعادة تثبيت الخلايا وإصلاحها بنسبة 4% شبه شكلي (PFA) في PBS.
7. وصمة عار الخلايا مع isoform المضادة للقلب من تي تروبونين (cTnT) في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS و 0.75٪ سابونين، ثم تسمية الأجسام المضادة cTnT مع IgG1 ماوس 488 (تخفيف 1:50).
8. resuspend الخلايا الملطخة في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS ووضعها في أنابيب FACS مع مصفاة الخلية.
9. تحليل تكوين الخلية من الخلايا الملطخة من كل بروتوكول التمايز مع تدفق عملية استئصال الخلايا لتسهيل توليد تعليق الخلية مع توزيعات النسب المحددة.
   ملاحظة: أثناء تنفيذ هذا الإجراء، يتم الاحتفاظ بتعليق الخلية المتبقية لـ ECTs في ثلاجة 4 درجة مئوية.

3. تصنيع قالب أنسجة PDMS

1. يلقي 0.5 مم سميكة وأكثر من 30 مم × 30 مم طبقة من بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) عن طريق خلط حل prepolymer وربط عبر بنسبة 10:1 ثم علاج في 80 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
2. قطع ورقة PDMS والسندات مع لاصق سيليكون لتصنيع 21 مم × 20.5 مم علبة مستطيلة مع 7 مم طويلة، 0.5 مم واسعة، و 2.5 مم وظائف مستطيلة عالية في وضع متداخل. الأفقي تباعد ما بعد بين سطرين من الوظائف هو 2.5 ملم(الشكل 2B).
3. اُنسج الصلب على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
4. معطف صينية مع 1٪ poloxamer 407 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة. شطف poloxamer 407 وشطف القالب مع برنامج تلفزيوني بما فيه الكفاية قبل الاستخدام.

4. ECT البناء

1. بعد تحليل نسب الخلية، والجمع بين الخلايا من CM + EC والبروتوكولات MC بحيث التركيز النهائي من MCs هو 10 إلى 20٪ في عدد الخلايا الإجمالية من ستة ملايين خلية لكل بناء⁵.
2. تعليق مختلطة ستة ملايين خلية في ECT ثقافة المتوسطة (ألفا الحد الأدنى المتوسطة الأساسية تكملها 10٪ FBS، 50 μM 2-mercaptoethanol و 100 U/mL البنسلين-ستريبتوميسين).
3. إعداد حل المصفوفة
   1. مزيج 133 ميكرولتر من حمض للذوبان في ذيل الفئران نوع الحل الأول (2 ملغ / مل، درجة الحموضة 3) مع 17 ميكرولتر من 10x الحد الأدنى المتوسطة الأساسية (MEM). ثم اخلطي الحل مع 17 ميكرولتر من العازلة القلوية (0.2 M NaHCO₃و 0.2 M HEPES و 0.1 M NaOH).
      ملاحظة: يجب أن يوضع الكولاجين على الجليد (4 درجات مئوية). تحقق من لون المخزن المؤقت وإذا لم تصبح الوسيطة وردية اللون عندما تكون جميع الحلول مختلطة، أضف عازلة قلوية إضافية إلى الوسط. يجب أن تكون خطوات الخلط مزيج الكولاجين أنا + 10x MEM، ثم إضافة العازلة القلوية. لا تقم بتغيير هذا الترتيب. لا تولد فقاعات في هذا المزيج.
   2. إضافة 67 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى حل الكولاجين تحييد.
      ملاحظة: يجب أن تبقى على الجليد حل مختلط (4 درجة مئوية).
4. الطرد المركزي تعليق الخلية المعدة التي تحتوي على ستة ملايين خلية في 1100 دورة في الدقيقة (240 × ز)لمدة 5 دقائق و resuspend الخلايا مع 167 ميكرولتر من DMEM عالية الجلوكوز + 20٪ FBS + 1٪ بنسلين-ستريبتوميسين (100x).
5. مزيج من تعليق الخلية والحل مصفوفة. الحجم الإجمالي للخلية / خليط مصفوفة لبنية واحدة هو 400 ميكرولتر.
   ملاحظة: يجب أن يكون خليط الخلية/المصفوفة غير لزج ولون وردي في هذه الخطوة. يبقيه على الجليد كما هلام سوف تتوطد في درجة حرارة الغرفة. التركيز النهائي من نوع الكولاجين الأول هو 0.67 ملغ / مل.
6. صب الخلية / خليط مصفوفة بالتساوي على 407 poloxamer المغلفة PDMS العفن الأنسجة، والتي وضعت في ستة بئر لوحة ثقافة^12.
   ملاحظة: صب الخليط بعناية لتجنب توليد فقاعات من أجل منع ملء العيوب في هلام سكب.
7. احتضان الخلية / خليط مصفوفة في حاضنة CO₂ القياسية (37C، 5 ٪ CO₂) لمدة 60 دقيقة.
8. بعد تشكيل الأنسجة، نقع العفن الأنسجة مع 4 مل من ECT ثقافة المتوسطة.
   ملاحظة: على الرغم من أن الخلية/المصفوفة يتم crosslinked في 60 دقيقة، بناء لا يزال هشا جدا. إضافة متوسطة بلطف لتجنب إتلافه.
9. زراعة الأنسجة لمدة 14 يوما مع تغيير متوسطة كل يوم.
10. قبل زرع العلاج بالصدمات الكهربائية، قم بإزالة العلاج بالصدمات الكهربائية من وظائف التحميل بلطف باستخدام ملقط دقيقة معقمة.
    ملاحظة: أبعاد العلاج بالصدمات الكهربائية النهائية بعد الإزالة من القالب هي أقل من القالب الأصلي. يولد قالب 2.1 سم × 2.05 سم جهاز ECT صدر من حوالي 1.5 سم × 1.5 سم. أكبر 3.9 سم × 4.05 سم العفن يولد العلاج بالصدمات الكهربائية من حوالي 3 سم × 3 سم. يُظهر ECT المفرغ الضرب العفوي الجوهري في وسط الثقافة الدافئة. على الرغم من أنه يحتفظ في البداية هيكل شبكة، يتقلص العلاج بالصدمات الكهربائية التفريغ ويتكثف مع مرور الوقت. فمن الممكن لعقد الأنسجة بهدوء مع ملقط غرامة ومن ثم استخدام خياطة الحرير 7-0 لإرفاق العلاج بالصدمات الكهربائية إلى epicardium.

النتائج

ويبين الشكل 1ألف وباء مخططات بروتوكول CM +EC وMC. بعد تحريض CMs وECs من بروتوكول CM + EC و MCs من بروتوكول MC ، يتم خلط الخلايا تعديل تركيزات MC النهائية لتمثل 10 إلى 20٪ من إجمالي الخلايا. يتم تصنيعها 2 قالب نسيج واسعة سم وفقا لرسم تصميم من 0.5 مم ورقة PDMS سميكة (الشكل 2...

Discussion

بعد الانتهاء من التحقيق لدينا من شكل خطي، hiPSC اشتق ECT⁵، نحن تكييف بروتوكول لخلط هيبسك المستمدة من CMs، ECs، وMCs لتسهيل التوسع في المختبر من الخلايا الوعائية داخل ECTs ولاحقا في اقتران الأوعية الدموية الحية بين ECTs وميريكارديوم المتلقي.

لتسهيل توليد أكبر، هندسة ECT شبكة ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761036
Reagents
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinant (10µg)	R&D	RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail	Sigma	C3867
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356231
Human VEGF (165) IS, premium grade	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Molecular Probes	P-6866
Recombinant human bFGF	WAKO	060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)	R&D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)	R&D	5036-WN
Versene solution	Gibco	15040066
Culture medium and supplements
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Ethanol	SIGMA	M6250
B27 supplement minus insulin	Gibco	A1895601
DMEM, high glucose	Gibco	11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
L-Glutamine	Gibco	25030081
NaHCO3	Any
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medium	Gibco	21870092
αMEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solution	BD	340345
BD FACSFlow Sheath Fluid	BD	342003
BD FACSRinse Solution	BD	340346
EDTA	Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)	Corning	352235
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Molecular Probes	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponin	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit	Molecular Probes	Z25002