نمذجة الانبثاث الدماغ من خلال الحقن داخل الجمجمة والتصوير بالرنين المغناطيسي

Jennifer  A. Geisler; Jonathan  M. Spehar; Sarah  A. Steck; Anna Bratasz; Reena Shakya; Kimerly Powell; Gina  M. Sizemore

doi:10.3791/61272

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

تعقيد نمذجة الانبثاث الدماغ داخل الجمجمة بسبب عدم القدرة على رصد حجم الورم والاستجابة للعلاج مع أساليب دقيقة وفي الوقت المناسب. المنهجية المقدمة الأزواج حقن الورم داخل الجمجمة مع تحليل التصوير بالرنين المغناطيسي, الذي عند الجمع, يزرع الحقن دقيقة ومتسقة, تعزيز رصد الحيوانات, وقياسات حجم الورم دقيقة.

Abstract

الانتشار النقيلي للسرطان هو نتيجة مؤسفة لتطور المرض، وأنواع السرطان الفرعية العدوانية، و / أو التشخيص المتأخر. الانبثاث الدماغية مدمرة بشكل خاص ، يصعب علاجها ، وتمنح تشخيصًا ضعيفًا. في حين أن الإصابة الدقيقة من الانبثاث الدماغ في الولايات المتحدة لا يزال من الصعب تقدير, فمن المرجح أن تزيد مع استمرار العلاجات خارج تصبح أكثر فعالية في علاج السرطان. وبالتالي ، من الضروري تحديد وتطوير أساليب علاجية جديدة لعلاج الانبثاث في هذا الموقع. وتحقيقا لهذه الغاية، أصبح الحقن داخل الجمجمة من الخلايا السرطانية وسيلة راسخة في نموذج الانبثاث الدماغ. في السابق، كان عدم القدرة على قياس نمو الورم بشكل مباشر عائقاً تقنياً لهذا النموذج؛ ومع ذلك، فإن زيادة توافر وجودة طرائق التصوير الحيواني الصغيرة، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، تحسن بشكل كبير القدرة على رصد نمو الورم مع مرور الوقت واستنتاج التغيرات داخل الدماغ خلال الفترة التجريبية. هنا ، ثبت الحقن داخل الجمجمة من خلايا الورم الثدي مورين في الفئران المناعية تليها التصوير بالرنين المغناطيسي. أسلوب الحقن المقدم يستخدم التخدير isoflurane والإعداد stereotactic مع التحكم رقميا، وثقب الآلي وحقن إبرة لتعزيز الدقة، والحد من الخطأ التقني. يتم قياس التصوير بالرنين المغناطيسي مع مرور الوقت باستخدام أداة تسلا 9.4 في جامعة ولاية أوهايو جيمس الشامل مركز السرطان الصغيرة تصوير الحيوانات الموارد المشتركة. يتم عرض قياسات حجم الورم في كل نقطة زمنية من خلال استخدام ImageJ. عموما، هذا النهج الحقن داخل الجمجمة يسمح لحقن دقيق، الرصد اليومي، وقياسات حجم الورم دقيقة، والتي جمعت تعزيز كبير من فائدة هذا النظام النموذجي لاختبار الفرضيات رواية على محركات الانبثاث الدماغ.

Introduction

الانبثاث الدماغ هي 10 مرات أكثر شيوعا من البالغين الأولية أورام الجهاز العصبي المركزي¹, وقد تم الإبلاغ في تقريبا كل نوع الورم الصلبة مع سرطان الرئة, سرطان الثدي, وسرطان الجلد تظهر أعلى معدل². بغض النظر عن موقع الورم الأساسي ، فإن تطور الانبثاث الدماغي يؤدي إلى سوء التكهن غالباً ما يرتبط بالتدهور المعرفي ، والصداع المستمر ، والنوبات ، والتغيرات السلوكية و / أو الشخصية¹^،³^،⁴^،⁵. وفيما يتعلق بسرطان الثدي، فقد كان هناك العديد من التطورات في الوقاية من المرض وعلاجه. ومع ذلك، فإن 30٪ من النساء تشخيص سرطان الثدي على المضي في تطوير الانبثاث، وأولئك الذين يعانون من مرض المرحلة الرابعة، ما يقرب من 7٪ (SEER 2010-2013) لديهم الانبثاث الدماغ⁶^،⁷. وتشمل خيارات العلاج الحالية للأشعة على الانبثاث الدماغ استئصال جراحي, stereotac stereosurgery و / أو العلاج الإشعاعي الدماغ كله. ومع ذلك ، حتى مع هذا العلاج العدواني ، فإن متوسط البقاء على قيد الحياة لهؤلاء المرضى هو قصيرة 8-11 شهرا⁷^،⁸^،^9. وتدعم هذه الإحصاءات القاتمة بقوة الحاجة إلى تحديد وتنفيذ استراتيجيات علاجية جديدة وفعالة. وهكذا، كما هو الحال مع جميع أنواع السرطان التي تنتقل إلى الدماغ، فمن الضروري أن نموذج سرطان الثدي المرتبطة بشكل صحيح الانبثاث الدماغ (BCBM) في المختبر لضمان تقدم كبير في هذا المجال.

حتى الآن، استخدم الباحثون مجموعة متنوعة من المنهجيات لدراسة آليات الانبثاث إلى الدماغ، ولكل منها مزايا وقيود متميزة¹⁰^،¹¹. طرق الانبثاث التجريبية مثل الوريد الذيل والحقن داخل القلب نشر الخلايا السرطانية في جميع أنحاء الجسم ويمكن أن يؤدي إلى عبء الورم الهائل في المواقع النقيلي الأخرى اعتمادا على الخلايا المحقونة. ثم تربك هذه النتائج إذا كانت تدرس على وجه التحديد الانبثاث إلى الدماغ. طريقة حقن الشريان داخل الكاروتية مفيد لأنه يستهدف على وجه التحديد بذر الدماغ من الخلايا السرطانية ولكن محدودة لأنها يمكن أن تكون صعبة من الناحية الفنية لأداء. وغالبا ما يعتبر استئصال الورم الأولي التقويمي النموذج الأكثر صلة سريريا من الانبثاث كما أنه يلخص سلسلة كاملة النقيلي. ومع ذلك، ينطوي هذا النهج على فترات انتظار طويلة لحدوث الانبثاث التلقائي بمعدلات أقل بشكل كبير من الانبثاث الدماغي مقارنة بالمواقع النقيلي الأخرى مثل العقدة الليمفاوية والرئة والكبد. في كثير من الأحيان، يجب إزالة الحيوانات من الدراسات بسبب عبء الورم في هذه المواقع النقيلي الأخرى قبل تطوير الانبثاث الدماغي. طرق أخرى تشمل خطوط الخلايا المدارية في الدماغ فعالة في الانبثاث إلى الدماغ; ومع ذلك، هذه النماذج محدودة من حيث أنها تأخذ وقتاً لتطوير وغالباً ما تفقد tropism مع الانتشار. ونظرا لهذه القيود، فقد استخدم الباحثون بشكل روتيني طريقة الحقن داخل الجمجمة لنموذج الانبثاث السرطانية إلى الدماغ¹¹^،¹²^،¹³^،¹⁴ مع منهجيات متفاوتة¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸^،¹⁹. ومن المسلم به أن هذا النهج له قيود مماثلة، والأهم من ذلك أنه لا يسمح للتحقيق في الخطوات النقيلي في وقت مبكر بما في ذلك داخل الأوعية الدموية من الورم الأساسي، والبينترانس من خلال حاجز الدم في الدماغ، وإنشاء داخل الدماغ. ومع ذلك، فإنه يسمح للباحثين لاختبار (1) ما هي العوامل المشتقة من الورم التوسط النمو داخل الدماغ (على سبيل المثال، التلاعب الجيني لعامل أونكوجيني في الخلايا السرطانية)، (2) كيف التغييرات في البيئة المجهرية النقيلي تغيير نمو السرطان في هذا الموقع (على سبيل المثال، مقارنة بين الفئران المعدلة وراثيا مع مكونات السترمال المعدلة) و (3) فعالية استراتيجيات علاجية جديدة على نمو الآفات المنشأة.

نظراً للفائدة المحتملة لنموذج الحقن داخل الجمجمة, فمن الضروري للغاية للحد من الخطأ التقني أثناء الحقن ومراقبة نمو الورم بدقة مع مرور الوقت. الطريقة المذكورة هنا ينطوي على التسفير المستمر للتخدير الغاز استنشاق، وزرع مباشرة من الخلايا السرطانية في الدماغ parenchyma باستخدام الحفر المجسم وحقن الموقف. يسمح التخدير الغازي بضبط عمق وطول التخدير بالإضافة إلى ضمان الشفاء السريع والسلس. يعزز نظام الحفر الآلي وحقن الإبرة التي يتم التحكم فيها رقميًا دقة موقع الحقن ويقلل من الأخطاء التقنية التي غالباً ما يتم تكبدها عن طريق الحفر وطرق الحقن اليدوي. استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) يزيد من الدقة في رصد نمو الورم وحجم الورم واستجابة الأنسجة ونخر الورم والاستجابة للعلاج. التصوير بالرنين المغناطيسي هو طريقة التصوير من اختيار الأنسجة الرخوة²⁰^،²¹. لا تستخدم تقنية التصوير هذه الإشعاع المؤين، وتفضل على التصوير المقطعي المحوسب (CT)، خاصة بالنسبة لجلسات التصوير المتعددة أثناء الدراسة. التصوير بالرنين المغناطيسي لديه مجموعة أكبر بكثير من تباين الأنسجة الرخوة المتاحة ثم التصوير المقطعي أو الموجات فوق الصوتية (USG) ويعرض التشريح في مزيد من التفاصيل. وهو أكثر حساسية وتحديدا للتشوهات داخل الدماغ نفسه. يمكن إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في أي طائرة التصوير دون الحاجة إلى تحريك هذا الموضوع جسديا كما هو الحال في 2D USG أو التصوير البصري 2D. ومن المهم أن نذكر أن الجمجمة لا تُقيّن إشارة التصوير بالرنين المغناطيسي كما هو الحال في طرائق التصوير الأخرى. التصوير بالرنين المغناطيسي يسمح بتقييم الهياكل التي قد تكون غامضة من قبل القطع الأثرية من العظام في CT أو USG. ميزة إضافية هي أن هناك العديد من العوامل التباين المتاحة للتصوير بالرنين المغناطيسي، مما يعزز الحد الكشف عن الآفة، مع سمية منخفضة نسبيا أو الآثار الجانبية. الأهم من ذلك، يسمح التصوير بالرنين المغناطيسي للرصد في الوقت الحقيقي على عكس التقييم النسيجي في وقت النخر، والذي يقتصر على فك شفرة حجم الورم. طرائق التصوير الأخرى، مثل التصوير بالإنارة الحيوية، هي فعالة بالفعل للكشف المبكر عن الورم ورصده بمرور الوقت؛ ومع ذلك، تتطلب هذه الطريقة التلاعب الجيني (على سبيل المثال، لوسيفراز/GFP) من خطوط الخلايا ولا تسمح بقياسات الحجم. التصوير بالرنين المغناطيسي هو مزيد من المفيد لأنه يعكس رصد المريض والتحليل الحجمي المصب من الصور MR ومن المعروف أن تكون مرتبطة بقوة لحجم الورم الهستوولوجي في necropsy²². كما يزيد الرصد التسلسلي مع فحص التصوير بالرنين المغناطيسي من المراقبة السريرية للإعاقات العصبية، إذا نشأت.

عموما، الطريقة المعروضة لحقن الورم داخل الجمجمة المجسمة تليها التصوير بالرنين المغناطيسي المسلسل تمكننا من إنتاج نتائج موثوقة وقابلة للتنبؤ وقابلة للقياس لدراسة آليات الانبثاث الدماغ في السرطان.

Protocol

وقد وافقت على جميع الطرق المذكورة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها المؤسسية (IACUC) في جامعة ولاية أوهايو (P.I. جينا Sizemore; البروتوكول #2007A0120). يتم اتباع جميع سياسات جراحة بقاء القوارض IACUC ، بما في ذلك استخدام التقنيات العقيمة والإمدادات والأدوات ، وكذلك إزالة الفراء والإعداد المعقم لموقع الشق.

1. الحقن داخل الجمجمة من خلايا سرطان الثدي

ملاحظة: الطريقة المذكورة هنا تستخدم DB7 مورين ماماريي خط الورم الورم المستمدة من ورم MMTV-PyMT الأولية²³. وقد أنشأت الدراسات السابقة الحقن داخل الجمجمة من خلايا DB7 كنموذج لBCBM مع الأنسجة التي تحاكي أن من المرض البشري¹². الأهم من ذلك، يتم استخدام فئران FVB/N المختصة مناعية لهذا النموذج كما تم اشتقاق خلايا DB7 من سلالة الماوس هذه. وبما أن هذا نموذج لسرطان الثدي، يتم استخدام الفئران الإناث البالغ في هذه الدراسات.

إعداد الخلايا.
1. في غطاء معقمة، تُشعّر الوسائط من لوحات استزراع الخلايا باستخدام التقنيات القياسية.
2. غسل الخلايا مع 1x DPBS و trypsinize باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
3. أضف حجمًا مناسبًا من الوسائط المحتوية على FBS لإيقاف تفاعل التربسين وتحديد تركيز الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت أو الطريقة المفضلة.
4. خلايا بيليه في 300 × ز لمدة 4 دقائق في 4 درجة مئوية.
5. وسائط التعرق، وغسل مع 1X DPBS، إعادة تدور في 300 × ز لمدة 4 دقائق في 4 درجة مئوية.
6. خلايا إعادة التجمّع في 1x DPBS إلى تركيز مناسب، حوالي 50,000 خلية لكل حجم قابل للحقن يبلغ 2 ميكرولتر.
  ملاحظة: رقم الخلية يعتمد على العدوانية من الخط ويجب أن يتم تحديدها من قبل المحقق. نحن نستخدم بشكل روتيني 2 ميكرولتر، ولكن استخدام وحدات التخزين < 6μL يتم الإبلاغ عن¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸^،^19. إن الكميات المنخفضة ضرورية للحفاظ على الدقة.
7. ضع الخلايا التي يتم تعليقها على الجليد حتى يتم حقنها للحفاظ على الجدوى.
إعداد الفئران لعملية جراحية.
1. بالنسبة للفئران ذات الفراء: قم بإزالة الفراء من الجمجمة، إما عن طريق كريم إزالة الشعر/ محلول أو عن طريق الحلاقة. القيام بذلك في غضون 24-48 ح قبل الجراحة كما تنفيذ هذه الخطوة قريبة جدا من الجراحة يمكن أن تتداخل مع جودة الجلد وقوة خياطة.
  ملاحظة: تم استخدام فئران FVB/N الأنثوية التي تزن حوالي 25 غرامًا بسبب دراسة سرطان الثدي النقيلي، وهو مرض أنثوي في الغالب.
2. إدارة المسكنات كما يحددها IACUC وحضور الطبيب البيطري: حقن تحت الجلد من Buprenorphine SR-LAB (0.05-0.1 ملغ / كغ جرعة، مخزون البوبرينورفين: 0.5 ملغ/مل لجرعة من 0.0025-0.088 مل) على الأقل 24 ساعة قبل الجراحة لتوفير ما يصل إلى 72 h مسكن، والتي قد تتكرر 48-72 ساعة بعد الجرعة الأولى، إذا لزم الأمر. أيضاً إدارة مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية (20٪ ايبوبروفين في مياه الشرب على سبيل المثال، 1 ملغم/5 مل) على الأقل 24-48 ساعة قبل الجراحة وتستمر لمدة 2-7 أيام بعد الجراحة لتوفير الحد الأدنى 72 ساعة مسكن بعد الجراحة.
  ملاحظة: في جامعة ولاية أوهايو، يتم إدارة Buprenorphine SR-LAB من قبل الموظفين البيطريين في مختبر الجامعة للموارد الحيوانية لأنها مادة خاضعة للرقابة.
إعداد وحدات مجسمة للجراحة.
1. تشغيل جميع آلات التخدير، ومقاييس Vernier الرقمية، والحقن الرقمية.
  ملاحظة: يجب تنظيف جميع الأدوات الجراحية بشكل كاف وتعقيمها قبل الجراحة.
2. استخدام آلات التخدير مع مرفق غرفة التعريفي في مجلس الوزراء سلامة البيولوجية (الشكل 1A).
3. ضمان توصيل جميع الأنابيب من آلات التخدير إلى إطارات stereotactic(الشكل 1B، inset 1C) والمشابك على الأنابيب مفتوحة لجميع الوحدات المستخدمة. إغلاق أي المشابك على أنابيب الذهاب إلى إطارات stereotactic التي لن تستخدم لعملية جراحية.
4. تعيين آلات التخدير إلى الشركة المصنعة أوصت الأنف مخروط معدل التدفق على أساس وزن الماوس (على سبيل المثال، 25 غرام وزن الحيوان: الأنف مخروط معدل تدفق 34 مل / دقيقة).
  ملاحظة: يُنصح حامل الرأس المضمّن في هذه المجموعة المجسّم فقط للفئران البالغة. تأكد من متابعة توصيات الشركة المصنعة المضمنة في مجموعة stereotactic.
5. تأكد من أن التخدير المناسب (على سبيل المثال، isoflurane) المعبأة مسبقا في حقنة تعلق على آلة التخدير (الشكل 1B).
  ملاحظة: الإفراط في فتيلة الحقنة يمكن أن يسبب الكثير من التخدير ليتم تسليمها إلى الفئران أثناء الجراحة ويؤدي إلى جرعة زائدة من التخدير.
6. إعداد التدريبات عن طريق التواء قفل المرحلة، وإدراج محول بت الحفر وتدخال 1 ملم بت في كل الحفر وقفل الحفر عن طريق تشديد يدويا بت قفل.
7. إرفاق التدريبات على إطارات stereotactic (الشكل 1C).
8. تنظيف الحقن هاملتون مع 5 يغسل بالتناوب من 1x DPBS، ثم 70٪ الإيثانول، ثم مرة أخرى في 1X DPBS. ضع جانبا حتى يتم تستعد الحيوان للحقن.
9. تعيين حاقن الرقمية لتسليم بمعدل 0.4 ميكرولتر / دقيقة وهدف 2 ميكرولتر. هذا المعدل والحجم تسمح لإدخال بطيء من الخلايا السرطانية في الدماغ, مما يقلل من الضغط والأضرار المرتبطة بها.
ضع الفئران على إطارات مجسمة.
1. تخدير الفئران (مثل isoflurane) باستخدام غرفة الحث المذكورة أعلاه.
2. الحفاظ على الفئران طوال العملية في طائرة مخدر عميق. التخدير % الذي تديره الآلة يعتمد على عدد من العوامل بما في ذلك: معدل التدفق ودرجة التحفيز ودرجة حرارة الجسم. مراقبة الفئران في كثير من الأحيان في جميع أنحاء عملية لعمق التخدير عن طريق تقييم التنفس الإيقاعي (الحيوان لا يلهث); عدم وجود منعكس palpebral (ترفرف من الجفون عندما حفزت مع قضيب طرف القطن)؛ وعدم وجود قرصة إصبع (انسحاب أطرافه على حافز ضار من معسر أصابع).
  ملاحظة: سوف يكون سلالات مختلفة من الفئران استجابة مختلفة للتخدير.
3. بعد الفئران هي في مناسبة، طائرة مخدر عميق، ونقل الفئران إلى وحدة stereotactic. استخدام وسادة التدفئة في حين أن الماوس على آلة stereotactic للحفاظ على درجة حرارة الجسم وطائرة مخدر المناسبة.
  ملاحظة: لتحقيق الأضواء المنخفضة نستخدم تدفئة اليد المنشطة للهواء الموضوعة داخل صندوق تلميح مقلوب (مربع رفع الماوس في الشكل 1D).
4. فتح الفم والفأر الأسنان مكان في الحوض الصغير من شريط الفم الموجود على قطعة الأنف على إطار stereotactic (الشكل 2A). حرك مخروط الأنف فوق أنف/فم الفأر (الشكل 2B).
  1. ضع الفئران مع مستوى رؤوسهم إلى شريط الفم. فتح الفم بلطف مع نهاية حادة من قضيب طرف القطن والانزلاق في مكانه. تأكد من أن مخروط الأنف هو تماما على أنف الماوس أو التخدير لن يتم تسليمها بشكل صحيح. سوف المخروط الأنف لا تشارك مع الأنف إذا لم يتم الجلوس الأسنان داخل هذا الأخدود (Inset الشكل 2A).
5. باستخدام مسحة القطن العقيمة، ضع زيوت التشحيم العين على كل من عيون الماوس. تطبيق زيوت التشحيم العين يخفف من جفاف القرنية ويقلل من فرصة تلف القرنية والمضاعفات بعد العملية الجراحية المتعلقة صدمة القرنية.
6. تحقيق الاستقرار في جمجمة الفأر عن طريق الاكتئاب شريط الأذن اليسرى حتى ضد كانثوس من الأذن اليسرى، وتأمينه في مكان باستخدام المسمار على إطار stereotactic. ثم حرك شريط الأذن اليمنى ضد كانثوس من الأذن اليمنى والمسمار ضيق على إطار stereotactic (الشكل 2B).
  ملاحظة: تأكد من أن رأس الماوس هو مستوى ومستقيم عند وضع أشرطة الأذن. إذا كان الرأس ملتوية أو الزاوية، وسوف يكون الحقن في مكان غير صحيح في الدماغ. يجب أن تكون قضبان الأذن تشديد فقط حتى يتم شل الجمجمة على التحفيز مع التحقيق اليدوي المعتدل.
جعل نافذة العجلية.
1. إعداد وتنظيف فروة الرأس مع 3x بالتناوب يمر كل من حل بيتادين و 70٪ الإيثانول. نظرا لقرب موقع الجراحة من العينين، استخدم حل البيتادين على فرك الجراحية.
2. باستخدام مشرط معقم، وجعل شق 3 مم من خلال الجلد على طول الجانب المتوسط المركزي من الجمجمة (بعد خط خياطة القوس). وينبغي أن يكون النزيف عند الشق الحد الأدنى. وينبغي أن يحدث، وتطبيق ثابت، والضغط الثابت في موقع النزيف مع قضيب طرف القطن العقيمة ل>30 ثانية.
3. تحديد وتوجيه الحفر عمودي على bregma (الشكل 2C)، مع التأكد من إعادة تعيين مقياس Vernier الرقمية إلى الصفر.
4. نقل الحفر 2 مم الجانبي إلى خياطة القوس و 1 ملم الأمامي إلى خياطة التاجية(الشكل 2C). لقابلية التكاثر، تأكد من أن الموقع إلى اليسار أو اليمين من خط خياطة القوس يبقى متسقة لجميع الحيوانات.
5. بدوره الحفر على أعلى سرعة. ضمان نقل الجلد بعيدا عن الحفر لتجنب تلف الأنسجة الناجمة عن بت الدورية والشروع بعناية في الحفر على الجمجمة. حفر حفرة ما يقرب من 0.5 ملم عميقة من خلال الكالفاريا، مما أدى إلى نافذة العجلية. يجب الحرص على عدم خفض الحفر بعيدا جدا أو أنها سوف حفر في الدماغ. يمكن إسقاط المالحة العقيمة في موقع الحفر أثناء الحفر في الحركة تعويض أي حرارة تولدها الآلة التي قد تسبب تلفًا حراريًا للأنسجة المحيطة.
6. بمجرد إجراء نافذة العجلية ، ارفعي المثقاب بعناية وأزله من الإطار المجسم.
7. تنظيف بت الحفر باستخدام 70٪ الإيثانول وتوضع جانبا إذا كان يجري استخدامها مرة أخرى. إذا لم يكن كذلك، إزالة بت الحفر وغمر في الإيثانول 70٪.
حقن الخلايا السرطانية في الدماغ
1. إرفاق وحدة حاقن التلقائي إلى جهاز stereotactic (الشكل 1D).
2. سحب ما يصل > 2 μL من الخلايا resuspended جيدا في 1X DPBS في حقنة هاميلتون نظيفة. تأكد من إعادة تعليق الخلايا مباشرة قبل ملء الحقنة للحد من تشكيل كتلة وضمان الطين الخلية متجانسة. ومن المثالي لسحب ما يصل 6-8μL من حجم الخلية لضمان عدم وجود جيوب الهواء / فقاعات.
3. ضع حقنة هاملتون على جهاز الحقن ، وابر الإبرة للحقن عن طريق الاستغناء عن كمية صغيرة من الحجم على ستائر معقم يمكن التخلص منها لضمان عمل الحقن بشكل صحيح. امسح الحقنة مع الإيثانول بنسبة 70٪ مع قضيب طرف القطن(الشكل 1D، inset). هذا يزيل الخلايا السرطانية من برميل الخارجي من رمح إبرة الحد من خطر بذر الخلايا الورم على طول مسار الحقن.
4. محاذاة طرف إبرة إلى وسط النافذة العجلية، لمس تقريبا المخ المكشوف.
5. إعادة تعيين مقياس Vernier الرقمية إلى الصفر.
6. أدخل الإبرة ببطء إلى عمق 3 مم في الدماغ، وتسمح للإبرة بالبقاء في الدماغ لمدة 60 ثانية على الأقل قبل المتابعة. يسمح هذا الإطار الزمني للدماغ بالتوافق حول الإبرة ، مما يقلل من ضغط الظهر والطرد المحتمل للخلايا السرطانية على طول الجهاز الإبري.
7. حدد تشغيل على شاشة حاقن لبدء تسليم الخلايا إلى موقع الحقن. وسوف يستغرق ما يقرب من 5 دقائق لحقن هذا الحجم. الوقت الطويل لهذه الخطوة هو للحد من الأضرار الثانوية الناجمة عن قوة الحقن على parenchyma الدماغ.
8. بمجرد الانتهاء من بروتوكول الحقن ، اسمح للإبرة بالراحة في الدماغ لمدة 3 دقائق على الأقل ، مما يسمح مرة أخرى للدماغ بالتأقلم مع الحقن.
9. بعد 3 دقائق على الأقل، رفع الإبرة من الدماغ بمعدل 0.75 مم / دقيقة. القيام بذلك بطريقة بطيئة للغاية ومتسقة للحد من الضغط مرة أخرى والورم تتبع حتى الجهاز إبرة.
10. بمجرد أن تخرج الإبرة من الدماغ، قم بإزالة حقنة هاملتون بعناية من الحقن ونظيفة كما هو موضح في الخطوة 1.2.8.
11. تطبيق شمع العظام الدافئة على نافذة الكالفاري باستخدام مسحة القطن العقيمة. يعمل شمع العظام كحاجز مادي للحفاظ على الورم داخل الجمجمة.
12. إغلاق شق (على سبيل المثال، 5-0 خياطة PDS قابلة للذوبان في نمط انقطاع بسيط أو مقاطع خياطة، أيهما هو الأكثر راحة للجراح).
13. وقف إدارة التخدير وإزالة الماوس من الجهاز عن طريق فتح وانزلاق خارج أشرطة الأذن، انزلاق مخروط الأنف قبالة الماوس، وفك الارتباط الأسنان من شريط الفم.
14. ضع الماوس في قفص نظيف على مجموعة أكثر دفئا إلى 37 درجة مئوية للتعافي. مراقبة الفئران أثناء الانتعاش، والذي يحدث عادة 10-15 دقيقة بعد توقف التخدير.
15. بعد استعادة الماوس، مراقبة لمعايير الإزالة المبكرة كما يحددها IACUC المؤسسة المضيفة.

2. التصوير بالرنين المغناطيسي

إدارة Gadolinium القائم على عامل التباين (100 ميكرولتر / 20 غرام ماوس وزن الجسم من 0.1 م MultiHance) إلى الفئران عن طريق الحقن داخل الصفتون القياسية²⁴ 10-20 دقيقة قبل التصوير. ثم التخدير باستخدام غرفة التعريفي مع مخدر مستنشق (على سبيل المثال، ايزوفلوران) مختلطة مع 95٪ O₂ و 5٪ CO₂ (أي، إمداداتها غرفة غاز الهواء).
ضع الماوس على حامل ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. تأمين الرأس مع شوكات الأذن وشريط لدغة، وحامل مكان في 9.4 T المغناطيس مجهزة لفائف سطح الدماغ الماوس. الحفاظ على التخدير أثناء وقت التصوير، تستغرق الدراسة عادة حوالي 20 دقيقة لكل فأرة. مراقبة معدل التنفس ومعدل ضربات القلب (~ 70 bpm) طوال العملية باستخدام وسادة هوائية ونظام رصد الحيوانات الصغيرة.
الحصول على صورة محلية، ثم صورة الدماغ الماوس باستخدام تسلسل RARE المرجح T2 (TR = 3500-4228 مللي ثانية، TE = 12 مللي ثانية، نادرة عامل = 8، FOV = 2.0 × 2.0 سم، حجم المصفوفة = 256 × 256، 1 ملم أو 0.5 ملم سمك شريحة، NA = 2-4، 15-30 شرائح متجاورة) و ما بعد Gadolinium القائمة على النقيض T1-المرجحة تسلسل نادر (TR = 1200 مللي ثانية، TE = 7.5 ms Factor = 4 ، FOV = 2.0 × 2.0 سم ، حجم المصفوفة = 256 × 256 أو 1 مم أو 0.5 مم سمك شريحة ، NA = 2-4 ، 15-30 شرائح متجاورة).
بعد التصوير، ضع الفأر في قفص على مجموعة أكثر دفئا إلى 37 درجة مئوية للتعافي.

3. قياسات الورم الحجمي

الحصول على إجمالي حجم الورم
1. فتح MRI ديكوم ملف البيانات في ImageJ، برنامج معالجة الصور المتاحة كتنزيل مجاني من خلال المعاهد الوطنية للصحة (https://imagej.nih.gov/ij/)²⁵.
  ملاحظة: ImageJ يسمح بعرض ملفات DICOM، وهو مطلوب للاستفادة من أبعاد البكسل المضمنة لحسابات حجم الورم (انظر الصورة، خصائص حيث يمكن تعيين "وحدة الطول" كما هو مطلوب (على سبيل المثال، مم)).
2. استخدم أداة التحديدات الحرّة لرسم مخطط حول الورم. قم بإجراء هذه التحديدات في غرفة مظلمة لتعزيز الرؤية. لا تقم بضبط السطوع/التباين للحفاظ على التناسق بين الجلسات.
3. ضمن علامة التبويب تحليل، حدد قياس للحصول على مساحة المنطقة المحددة. إذا تم اختيار وحدة من ملليمتر في الخطوة 3.1.1.، سيتم إعطاء مساحة في ملليمتر مكعب. إذا رغبت في ذلك، قم بتضمين التحديد اليدوي عن طريق تحديد ctrl+D. تغيير لون الإخراج عن طريق الانتقال إلى تحرير | خيارات | اللون. تحويل الصورة إلى صورة RGB (صورة | نوع | RGB اللون) قبل الحفظ كملف .tif.
4. المضي قدما في قياس جميع الشرائح التي تحتوي على الورم للماوس الفردية ونسخ القيم في برنامج تحليل البيانات المناسبة (على سبيل المثال، مايكروسوفت إكسل أو جرافباد بريزم).
5. جمع المناطق من كل شريحة للحصول على حجم الورم الكلي. تأكد من تصحيح المنطقة بناءً على سمك الشريحة (المنطقة/ السمك).
6. الخطوات الكاملة 3.1.1.-3.1.5. حتى يكون لجميع الفئران حجم الورم الكلي. ونظرا للطبيعة الذاتية إلى حد ما من الخطوط العريضة للأورام، فمن المثالي إذا تكررت نفس المنهجية عدة مرات ومتوسط للحد من الخطأ التقني.
7. لتعيين أشرطة المقياس، افتح ملف بيانات DICOM ثم انتقل إلى Analyze | أدوات | شريط المقياس. منذ الأبعاد المضمنة بالفعل في ملف DICOM، فقط اختيار الطول / العرض المطلوب. سرية لصورة RGB (صورة | نوع | RGB اللون) قبل الحفظ كملف .tif.

النتائج

الشكل 3 نظرة عامة على حجم الورم كمي للماوس واحد في نقطتين زمنيتين (اليوم 7 واليوم 10) بعد حقن خلايا الورم mammary مورين. لهذه التجربة، تم حقن 50،000 خلايا DB7، وتم تقييم دماغ الحيوان بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي. لكل مسح، تم التقاط 30 شريحة (سمك 0.5 ملم). وكشف تقييم 30 شرائح لكل مسح أن...

Discussion

استخدام الحقن داخل الجمجمة تليها رصد تسلسلي مع التصوير بالرنين المغناطيسي يوفر قدرة فريدة من نوعها لتصور نمو الورم مع دقة حجم الورم مع مرور الوقت. تطبيق تحليل التصوير الرقمي يسمح لتفسير آفات الدماغ لحجم الورم، والنخر، والاستجابة للعلاج.

كما هو الحال مع أي إجراء، هناك خطوات...

Disclosures

ولا يملك أصحاب البلاغ أي إفصاحات.

Acknowledgements

تم تمويل البيانات التمثيلية من خلال المعهد الوطني للسرطان (K22CA218472 إلى G.M.S.). يتم تنفيذ الحقن داخل الجمجمة في جامعة ولاية أوهايو مركز السرطان الشامل التحقق من صحة الموارد المشتركة (مدير – الدكتور رينا شاكيا) ويتم الانتهاء من التصوير بالرنين المغناطيسي في جامعة ولاية أوهايو مركز السرطان الشامل صغير تصوير الحيوانات الموارد المشتركة (مدير – الدكتور كيمرلي باول). يتم تمويل كلا الموارد المشتركة من خلال OSUCCC ، ومنحة دعم مركز السرطان OSUCCC من المعهد الوطني للسرطان (P30 CA016058) ، والشراكات مع كليات جامعة ولاية أوهايو والإدارات ، وأنظمة استرداد الرسوم المعمول بها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Materials
Betadine	Purdue Products	19-027132	Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax	Surgical Specialities	903	Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators	Puritan	25-806 10WC	Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment	Puralube	17033-211-38	Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers	Hothands	HH2	Air-activated heat packs
Ibuprofen	Up & Up	094-01-0245	100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane	Henry Schein INC	1182097	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels	Integra Miltex	4-410	#10 disposable scalpel blade
Skin Glue	Vetbond	1469SB	Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing	TIDI Products	25-517	Individually packed sterile drapes
Suture	Covidien	SP5686G	45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture

Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)	Kopf	Model 1474	Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B	Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 922	Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 940	Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor

Injector
Injector Needle and syringe	Hamilton	80366	26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump	KD Scientific	P/N: 788130	Programmable touch screen base with automated injector

Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific	SS-01	Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters

References

Lin, X., DeAngelis, L. M. Treatment of Brain Metastases. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3475-3484 (2015).
Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S. Brain metastases: epidemiology. Handbook of Clinical Neurology. 149, 27-42 (2018).
Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 8 (6), 344-356 (2011).
Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
Valiente, M., et al. The Evolving Landscape of Brain Metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
Wang, H., et al. The prognosis analysis of different metastasis pattern in patients with different breast cancer subtypes: a SEER based study. Oncotarget. 8 (16), 26368-26379 (2017).
Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
Gong, Y., Liu, Y. R., Ji, P., Hu, X., Shao, Z. M. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Scientific Reports. 7, 45411 (2017).
Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in SEER database. Journal of Cancer Researchearch and Clinical Oncology. 144 (9), 1803-1816 (2018).
Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
Meisen, W. H., et al. Changes in BAI1 and nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in breast cancer and provide opportunities for dual targeted therapies. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (1), 307-314 (2015).
Russell, L., et al. PTEN expression by an oncolytic herpesvirus directs T-cell mediated tumor clearance. Nature Communications. 9 (1), 5006 (2018).
Thies, K. A., et al. Stromal platelet-derived growth factor receptor-beta signaling promotes breast cancer metastasis in the brain. Cancer Research. , (2020).
Kramp, T. R., Camphausen, K. Combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3397 (2012).
Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. (91), e52017 (2014).
Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
Donoghue, J. F., Bogler, O., Johns, T. G. A simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
Fink, J. R., Muzi, M., Peck, M., Krohn, K. A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (10), 1554-1561 (2015).
Borges, A. R., Lopez-Larrubia, P., Marques, J. B., Cerdan, S. G. MR imaging features of high-grade gliomas in murine models: how they compare with human disease, reflect tumor biology, and play a role in preclinical trials. American Journal of Neuroradiology. 33 (1), 24-36 (2012).
Prabhu, S. S., Broaddus, W. C., Oveissi, C., Berr, S. S., Gillies, G. T. Determination of intracranial tumor volumes in a rodent brain using magnetic resonance imaging, Evans blue, and histology: a comparative study. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 47 (2), 259-265 (2000).
Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
Journal of Visualized Experiments. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2020).
Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures. Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).
Shah, N., et al. Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases. Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160 stereotactic

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: