خط أنابيب باستخدام ثنائي في القطب الرحمي لاستجواب التأثيرات الوراثية على سلوك القوارض

Summary

لا يزال دور الجينات المرتبطة بالمرض المكتشفة مؤخرًا في التسبب في الاضطرابات العصبية والنفسية غامضًا. تعديل ثنائي في تقنية الكهربائي الرحم يسمح لنقل الجينات في مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية وفحص الآثار المسببة لتغيرات التعبير الجيني على السلوك الاجتماعي.

Abstract

ومع إلقاء دراسات الرابطة على نطاق الجينوم الضوء على الأسس الوراثية غير المتجانسة للعديد من الأمراض العصبية، تزداد الحاجة إلى دراسة مساهمة جينات محددة في نمو الدماغ ووظائفه. والاعتماد على نماذج الماوس لدراسة دور التلاعبات الجينية المحددة ليس ممكنا دائما لأن خطوط الماوس المعدلة وراثيا مكلفة جدا والعديد من الجينات الجديدة المرتبطة بالأمراض ليس لديها حتى الآن خطوط وراثية متاحة تجاريا. بالإضافة إلى ذلك، قد يستغرق سنوات من التطوير والتحقق من صحة لإنشاء خط الماوس. في كهربائي الرحم يوفر طريقة سريعة وسهلة نسبيا لمعالجة التعبير الجيني بطريقة محددة الخلية في الجسم الحي الذي يتطلب فقط تطوير plasmid الحمض النووي لتحقيق التلاعب الجينية معينة. يمكن استخدام ثنائي في كهربائي الرحم لاستهداف مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية الهرمية القشرية الأمامية. الجمع بين هذه الطريقة نقل الجينات مع النهج السلوكية يسمح للمرء لدراسة آثار التلاعب الجيني على وظيفة شبكات قشرة الفص الجبهي والسلوك الاجتماعي للفئران الأحداث والكبار.

Introduction

وقد دفعت دراسات الرابطة على نطاق الجينوم (GWAS) اكتشاف الجينات مرشح رواية التي ترتبط بأمراض الدماغ^1,2,3,4. وقد كانت هذه الدراسات مفيدة بشكل خاص في فهم الاضطرابات العصبية والنفسية المدمرة مثل الفصام (SCZ)، حيث كان التحقيق في الجينات الجديدة بمثابة نقطة انطلاق لخطوط جديدة من البحث والتدخل العلاجي^5،6. الجينات الإيواء خطر لSCZ تظهر التعبير المتحيزة في قشرة الجبهية (PFC) خلال التنمية قبل الولادة و ما بعد الولادة في وقت مبكر، وهي منطقة متورطة في أمراض العديد من الاضطرابات العصبية والنفسية⁷. بالإضافة إلى ذلك، نماذج الماوس من الاضطرابات النفسية المعرض نشاط غير طبيعي في شبكات PFC^6،8،9. وتشير هذه النتائج إلى أن الجينات المرتبطة بـ SZC قد تلعب دورًا في الأسلاك التنموية لهذه المنطقة. ويلزم إجراء مزيد من التحرّيات باستخدام نماذج حيوانية لفهم مساهمة هذه الجينات المرشحة في إنشاء وصلات في مركبات الكربون الكلورية فلورية وتحديد ما إذا كانت هذه الجينات لها دور مسبب في التسبب في الاضطرابات النفسية العصبية. تقنيات التلاعب الجيني في الفئران التي تسمح لدراسة التغيرات في التعبير الجيني على دوائر عصبية محددة خلال مرحلة ما قبل الولادة والتنمية في وقت مبكر بعد الولادة هي طريقة واعدة لفهم الآليات الجزيئية التي تربط التغيرات التعبير الجيني إلى الخلل PFC.

توفر خطوط الماوس الجينية طريقة لدراسة تأثير جينات معينة على نمو الدماغ ووظيفته. ومع ذلك، يمكن أن يكون الاعتماد على الفئران المعدلة وراثيا الحد من حيث لا توجد دائما خطوط متاحة تجاريا لدراسة آثار جينات محددة على تطوير الدوائر العصبية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون مكلفة للغاية وتستغرق وقتا طويلا لتطوير خطوط الماوس المخصصة. وقد أحدث استخدام استراتيجيات التلاعب الجينية المتعددة التي تجمع بين الفئران المعدلة وراثيا مع النهج الفيروسية ثورة في فهم الدماغ^10،11،12. على الرغم من التقدم الكبير، تأتي الاستراتيجيات الفيروسية مع بعض القيود اعتمادا على نوع ناقلات الفيروسية، بما في ذلك حدود في قدرة التعبئة والتغليف التي يمكن أن تحد من التعبير الفيروسي¹³ وسمية الخلية المرتبطة التعبير الفيروسي¹⁴. وعلاوة على ذلك، في معظم الظروف التجريبية، والتعبير الجيني القوي باستخدام الفيروس المرتبط بـ adeno (AAVs) يتطلب ما يقرب من 2 إلى 4 أسابيع¹⁵، مما يجعل الاستراتيجيات الفيروسية الروتينية غير قابلة للاستخدام للتلاعب بالجينات أثناء التنمية المبكرة بعد الولادة.

في الكهربائي الرحم (IUE) هو نهج بديل يسمح لنقل الجينات السريعة وغير مكلفة^16,17 أنه عندما يقترن مع وضع العلامات الفلورية و الطرق الدوائية أو optogenetic, يوفر منصة قوية لتشريح وظيفة الدوائر العصبية. بالإضافة إلى ذلك، مع تطوير CRISPR-Cas9 جينوم تحرير الجينات يمكن أن يكون أكثر من إفراط أو تغيير بدقة من خلال خلية نوع محددة بالضربة القاضية إلى أسفل أو خروج من جينات محددة أو من خلال تعديل المروجين^18،19. نهج التلاعب الجيني باستخدام IUE مفيدة بشكل خاص عندما يكون تأثير الجينات على الدوائر العصبية بحاجة إلى اختبارها خلال النوافذ التنموية الضيقة²⁰. IUE هو تقنية متعددة الاستخدامات ويمكن إنجاز فرط التعبير بسهولة عن طريق إدخال جين في متجه تعبير تحت مروج معين. ويمكن تحقيق سيطرة إضافية على التعبير الجيني عن طريق قيادة التعبير باستخدام المروجين من نقاط القوة المختلفة أو باستخدام المروجين غير قابل للضبط قادرة على السيطرة على التعبير الجيني^21،22. بالإضافة إلى ذلك، يسمح IUE باستهداف الخلايا داخل طبقات القشرية وأنواع الخلايا ومناطق الدماغ المحددة، وهو أمر غير ممكن دائمًا باستخدام طرق أخرى^5و17. وقد وسعت التطورات الأخيرة في تكوين IUE على أساس استخدام ثلاثة أقطاب كهربائية ، والتي تولد توزيع حقل كهربائي أكثر كفاءة ، ذخيرة وظيفية من هذه الطريقة ، وسمحت للعلماء لاستهداف أنواع الخلايا الجديدة وزيادة الكفاءة والدقة وعدد الخلايا التي يمكن^{استهدافها 23،24}. وقد استخدمت هذه التقنية مؤخرا لتحديد الدور المسبب للمكون المكمل 4A (C4A)، وهو جين مرتبط ب SCZ، في وظيفة PFC والإدراك المبكر⁵.

يُعرض هنا خط أنابيب تجريبي يجمع بين نُهج نقل الجينات لاستهداف مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية الإثارة في القشرة الأمامية، بما في ذلك PFC، مع النماذج السلوكية التي لا تمكن فقط من دراسة التغيرات على مستوى الخلايا والدوائر، ولكنها تسمح أيضًا بمراقبة السلوك طوال مرحلة التطور المبكر بعد الولادة والبلوغ. وصفت أولا هو وسيلة لتنمبير ثنائيا مجموعات كبيرة من طبقة (L) 2/3 الخلايا العصبية الهرمية في المناطق القشرية الأمامية. بعد ذلك ، يتم تحديد المهام التي يتم بها فحص السلوك الاجتماعي في الفئران الأحداث والبالغين. يمكن الحصول على عدد الخلايا عند الانتهاء من المهام السلوكية لتحديد مدى وموقع نقل الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن ربط عدد الخلايا التي تُعدّ بالعدوى بالبيانات السلوكية لتحديد ما إذا كان عدد أكبر من الخلايا المُعدّة يؤدي إلى اضطرابات أكبر في السلوك.

Protocol

وقد أجريت جميع البروتوكولات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) للبحوث الحيوانية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية جامعة بوسطن (IACUC).

1. إعداد حل الحمض النووي

1. شراء بلازميد التجارية أو subclone جين من الفائدة في plasmid مع المروج المطلوب. هنا، تم استخدام plasmid تحتوي على EGFP تحت المروج CAG (pCAG-EGFP).
   ملاحظة: تحديد المروج المطلوب استناداً إلى مستوى التعبير المطلوب. بشكل عام، يمكن استخدام البلازميدات تحت المروج CAG لتحقيق مستويات عالية من transgene في حين أن المروجين من نوع الخلية (على سبيل المثال، المشبك العصبي للخلايا العصبية) تميل إلى أن تكون أقل نشاطا. يجب على المجرّب أن يحدد تجريبيًا مستويات التعبير المناسبة لكل بلازميد.
2. تحويل البكتيريا وتنمو المخزونات في وسائل الإعلام البكتيرية مع المضادات الحيوية المناسبة.
   1. إزالة الخلايا المختصة (خلايا DH5α) من -80 درجة مئوية وذوبان الجليد لمدة 20 دقيقة.
   2. مزيج 100 pg -100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد مع 30 ميكرولتر من الخلايا المختصة. احتضان الخليط على الجليد لمدة 20 دقيقة.
   3. أداء صدمة الحرارة عن طريق احتضان في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 45 ث ثم العودة إلى أنبوب الجليد لمدة 2 دقيقة.
   4. إضافة 200 - 1000 ميكرولتر من وسائط LB إلى الخلايا المختصة المحولة وتنمو لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية على حاضنة اهتزاز.
   5. لوحة 200 μL من الخلايا المحولة إلى لوحة LB agar تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة وتحتضن اللوحة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
   6. في اليوم التالي، احتضان مستعمرة بكتيرية واحدة في 200 مل من مرق LB مع المضاد الحيوي المناسب في 37 درجة مئوية على حاضنة تهتز بين عشية وضحاها.
3. تنقية الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة maxiprep.
   1. اتبع الإرشادات المتوفرة في مجموعة maxiprep التي تم الحصول عليها. لخطوة elution، لا elute الحمض النووي في العازلة elution. بدلا من ذلك، الحمض النووي المائل باستخدام إما 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم 1x أو المياه الصف الجزيئية.
   2. تأكد من أن التركيز النهائي للحمض النووي أكبر من 1 ميكروغرام/ميكرولتر. إذا كان البلازميد الذي يحتوي على جين الاهتمام لا يحتوي على جين مراسل ، ثم أيضا إعداد البلازميد للمشاركة في نقل مع جزيء مراسل ، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، للسماح لتصور الخلايا المصابة عبر.
4. إعداد حل الحمض النووي لعملية جراحية عن طريق تخفيف الحمض النووي البلازميد إلى 1X PBS إلى 1 μg/μL التركيز النهائي لكل بلازميد. إضافة صبغة خضراء سريعة إلى حل الحمض النووي إلى تركيز نهائي من 0.1٪. للحقن الثنائية، إعداد 60 ميكرولتر من محلول لكل سد (لحوالي 10 الجراء).
   ملاحظة: إذا لم يحتوي plasmid على جين مراسل، شارك في كهربية مع GFP. عادة ما تكون معدلات الكهربة المشتركة 95٪ أو أعلى. في أيدينا، لم تتأثر كفاءة النقل بالانكثر. يجب تخفيف جميع البلازميدات الكهربائية إلى 1 ميكروغرام /ميكرولتر.

2. يأمر أو تربية الفئران الحامل توقيت

1. إذا طلب الفئران الحامل في الوقت المناسب، اطلب الفئران للوصول في يوم جنيني (E) 13 أو في وقت سابق للسماح للسدود بالوقت الكافي للتأقلم مع السكن الحيواني.  في هذا البروتوكول، يتم استخدام ماوس القرص المضغوط-1 من أجل كافة التجارب.
   ملاحظة: الطلب قبل بضعة أيام سوف يقلل من الإجهاد الحيواني ويؤدي إلى ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة من الجراء.
2. إذا تكاثر الفئران الحامل في الوقت المناسب، إقران الفئران الأنثوية مع الذكور بين عشية وضحاها، مرة واحدة في الأسبوع. تحقق من وجود القابس مهبلي في صباح اليوم التالي (E0.5). تحديد الحمل عن طريق مراقبة وزن الفئران الإناث.
   ملاحظة: سلالات الماوس المختلفة لها زيادات مختلفة في الوزن خلال الحمل، لذلك تحديد زيادة الوزن نموذجية لسلالة الماوس المستخدمة.
3. سواء كان الأمر أو تربية الفئران ، للحد من الإجهاد من السدود ، ووضع لوحة التعشش ومنزل الماوس في القفص. يمكن أن يساعد الحد من الإجهاد في زيادة معدل البقاء على قيد الحياة للجراء.

3. تصميم وتجميع القطب ثلاثة محاور

1. استخدام الصف 2 أوراق التيتانيوم بسمك 0.063 في كمادة المخزون للاتصالات القطب.
2. باستخدام تقنيات الآلات القياسية أو الأدوات اليدوية الدقيقة، قم بعمل أقطاب كهربائية ذات الأبعاد التالية: 20 مم × 5 مم مع طرف مستدير ومُندد للخلف. إزالة أي حواف خشنة أو نتوءات باستخدام ورق الصنفرة حصى غرامة.
3. سلك الاتصالات القطب، التفاف 22 G تقطعت بهم السبل الأسلاك النحاسية حول الأخارج من القطب وآمنة عن طريق لحام. حماية هذا المشترك باستخدام الحرارة تقلص الأنابيب.
4. ثم، إرفاق القطب متصلا إلى autoclavable، غير موصلة ملقط باستخدام أنابيب تقلص الحرارة إضافية لجعل القطبين السالبين. قم بتوصيل القطب الموجب الواحد بمادة غير موصلة قابلة للتحمل (مثل مقبض فرشاة الأسنان برأس منقوش). تناسب الطرف المفتوح من السلك مع قابس الموز القياسية.

4- التحضير للجراحة

1. جلب السدود الحوامل إلى منطقة الجراحة على الأقل 30 دقيقة قبل الجراحة للسماح للحد من مستويات التوتر بعد النقل من منشأة الحيوان.
2. تعقيم موقع الجراحة بأكمله باستخدام مناديل التعقيم مناديل الجراثيم ومن ثم 70٪ الإيثانول. تغيير القفازات قبل بدء الجراحة.
3. تعقيم أدوات autoclaved في معقمة حبة الزجاج.
4. نقل معقم 1X PBS (حوالي 50 مل لكل سد) إلى 50 مل أنابيب مخروطية ووضعها في رف أنبوب في حمام الماء تسخينها إلى 38-40 درجة مئوية. تحقق من درجة الحرارة المالحة المعقمة مع ميزان الحرارة.
5. تشغيل مضخة توزيع المياه تسخين بحيث يتم تسخينها إلى 37 درجة مئوية قبل بدء الجراحة. هذا سوف يحافظ على درجة حرارة جسم الماوس طوال مدة الجراحة.
6. بدوره على الضغط حاقن والكهرباء وضمان وظيفة مناسبة قبل الجراحة.
7. تدور لفترة وجيزة حل DNA plasmid (التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.4) على جهاز طرد مركزي الطاولة ووضعها على الجليد.
8. سحب الماصات الزجاج على سحب ماصة بحيث غيض من الماصات الزجاج سحبت حوالي 50 ميكرومتر في القطر.
9. تعبئة ماصة مع 20-40 ميكرولتر من حل الحمض النووي (التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.4).
10. إعداد جميع العناصر اللازمة لعملية جراحية بما في ذلك إزالة الشعر غسول، اليود، 70٪ الإيثانول، مبادلة القطن، مرهم العين، الغرز، الشاش، الخ.
11. إعداد ورقة جراحة وملء المعلومات اللازمة، مثل هوية الماوس والوزن، وتاريخ الجراحة، واسم الجراح، الخ.

5. في جراحة الإلكتروبور

1. وزن الماوس قبل الجراحة وملاحظة هذا على ورقة الجراحة.
2. تخدير فأرة حامل (E16) عن طريق الاستنشاق في غرفة التعريفي مع 4٪ (v/v) خليط الأكسجين isoflurane. مرة واحدة وقد تم حث الماوس، والانتقال إلى استنشاق قناع والحفاظ على isoflurane في 1-1.5٪ (الخامس / الخامس) ورصد التنفس طوال الجراحة. تأكد من أن الماوس هو تخدير تماما، وينبغي أن يكون معدل التنفس ~ 55-65 نفسا في الدقيقة.
3. إدارة الظفر قبل الجراحة: البوبرينورفين (3.25 ملغ / كغ; SC) وميلوكسيكام (1-5 ملغم / كجم; SC) بحجم أقصى من 10-30 مل / كغ.
4. استخدم كريم إزالة الشعر أو استخدم شفرة حلاقة بعناية لإزالة الفراء من البطن. تعقيم البطن عن طريق swabbing مع بودينيوني اليود و 70٪ الإيثانول وتكرار هذا على الأقل 3 مرات. إنشاء حقل معقمة حول البطن باستخدام الشاش العقيمة، ويمكن أيضا أن تستخدم اللف العقيمة.
5. إجراء شق خط الوسط (3-4 سم) في جلد البطن، ويجري التأكد من رفع الجلد مع ملقط لتجنب قطع من خلال العضلات. ثم قطع من خلال العضلات، مع الحرص مرة أخرى على رفع العضلات حتى لتجنب قطع الأعضاء الحيوية.
6. سحب بعناية قرون الرحم من السد باستخدام ملقط حلقة ووضعها بلطف على الحقل العقيمة، والتأكد من أن يتم دعم القرن الرحم مع الحشو وليس التجاذبات بعيدا جدا عن السد. من هذه النقطة فصاعدا، والحفاظ على قرن الرحم مبلل طوال بقية الجراحة مع برنامج تلفزيوني معقم قبل الدافئة 1x.
7. ضع جنينًا باستخدام ملقط أو أصابع. أدخل بعناية الماصات الزجاجية المسحوبة بزاوية 45 درجة فيما يتعلق بالطائرة الأفقية للرأس، ثم أدخلها في البطين الجانبي، والتي يمكن تحديدها بصرياً بين خط الوسط في الدماغ والعين. حقن حوالي 2-3 μL في كل بطين جانبي إما عن طريق إدراج الماصات في واحد ثم البطين الآخر (الموصى به) أو عن طريق حقن محلول الحمض النووي في بطين واحد حتى يمر في البطينينين الجانبيين. وقد تم بنجاح استهداف البطين إذا شكل الهلال هو الحاضر بعد الحقن.
   ملاحظة: يمكن أن يُكسر طرف الماصات الزجاجية أثناء الجراحة. إذا حدث ذلك، استبدلي الماصات الزجاجية، مع ضمان أن قرون الرحم يتم رطها في حين يتم إعداد ماصة جديدة وملئها بمحلول الحمض النووي.
8. لtransfect الخلايا ثنائيا في القشرة الأمامية، وضع اثنين من الأقطاب السلبية على جانبي الأجنة رئيس فقط الجانبية والcaudal قليلا إلى البطينين الجانبي ووضع القطب الموجب بين العينين، فقط أمام خطم النامية.
9. تأكد من ترطيب الجنين بسخاء. تطبيق 4 نبضات مربعة (مدة النبض = 50 مللي ثانية، سعة النبض = 36 فولت، فاصل فاصلة = 500 مللي ثانية).
10. حقن وكهرباء جميع الأجنة، والذهاب واحدا تلو الآخر بحيث يتم كهربية كل جنين مباشرة بعد حقن محلول الحمض النووي. مرة واحدة وقد تم الكهربائي جميع الأجنة، أدخل بعناية قرون الرحم مرة أخرى في تجويف البطن. خلال هذه الخطوة، معطف تجويف البطن في برنامج تلفزيوني عقيم (1x) للمساعدة في وضع القرن الرحم.
11. ملء تجويف البطن مع برنامج تلفزيوني عقيم 1X بحيث لا تبقى جيوب الهواء بعد خياطة كاملة. خياطة العضلات مع الغرز امتصاص والجلد مع خياطة الحرير غير امتصاص.
12. السماح للسد لاسترداد كامل في غرفة ساخنة لمدة 1 ساعة على الأقل. في 48 ساعة المقبل، تحقق على السدود بانتظام. كما يتعافى السد من التخدير ويستعيد وعيه، وسوف تبدأ تتحرك والخفقان.
13. إدارة المسكنات بعد العملية الجراحية إذا كانت السدود تظهر علامات الألم، مثل رفع أجسامهم والتنفس بسرعة. فقط إذا كان هناك علامات الألم منذ حقن SC يمكن التأكيد على السدود, ولكن إذا تدار إلى المجموعة التجريبية أيضا تدار إلى مجموعة التحكم, أو العكس بالعكس.

6. إجراء فحص السلوك الاجتماعي المبكر في مهمة تفاعل الأمهات

ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من المنشورات السابقة^5,25. قم بأداء هذه المهمة بعد ولادة الفئران من يوم ما بعد الولادة (P) 18-21.

1. سلوك توجيه الأمهات في مهمة التفاعل بين الأمهات I (MI1).
   1. تأكد من عدم تغيير الفراش في القفص في الأسبوع الذي يسبق تنفيذ المهمة.
   2. الحصول على أو بناء حقل مفتوح (من) الساحة التي يمكن تنظيفها بسهولة (ينصح الاكريليك) مع الأبعاد التالية: 50 × 50 × 30 سم (الطول العرض الارتفاع). ظروف الإضاءة أثناء أداء السلوكيات يمكن أن تختلف تبعاً لمسألة تجريبية ويمكن أن تؤثر على مستويات الإثارة والقلق مثل السلوك. سجل التجارب السلوكية تحت ضوء خافت (ما يقرب من 20 لوكس) المتمركزة على وسط الساحة.
   3. لمدة يومين قبل اختبار السلوك، وتأقلم السد إلى الساحة عن طريق وضعه تحت كأس سلك شبكة (مثل كأس قلم رصاص) في زاوية من الساحة لمدة خمس دقائق يوميا.
   4. في يوم الاختبار ، والتي يمكن أن تكون من P18-21 ، قبل أن يتم ففط الفئران ، قم بتنظيف الساحة تمامًا مع مناديل التعقيم والإيثانول بنسبة 70٪.
   5. إعداد الساحة مع اثنين من زوايا المتعارضة على حد سواء تحتوي على الفراش نظيفة وزاوية واحدة تحتوي على الفراش عش المتسخة من قفص المنزل الجرو.
   6. السماح لكل الجرو لاستكشاف الساحة لمدة 3 دقائق، ووضع كل الجرو في الزاوية المحايدة، فارغة في البداية.
      ملاحظة: تسجيل السلوك باستخدام كاميرا فيديو في 30 إطاراً في الثانية. تنظيف الساحة بدقة بين كل الجرو واستبدال الفراش الطازج. البديل الذي الزاوية هو الطازجة مقابل عش الفراش كتحكم لتجنب تفضيل الزاوية لأسباب أخرى (أي، الضوضاء المحيطة أو الضوء). إذا كان تشغيل القمامة متعددة عبر نافذة النمو P18-21، تشغيل التجارب السلوكية في نفس الوقت بين أيام. كما تضمن أن يتم تشغيل مجموعات التحكم والتجريبي في أثناء يوم معين بالتوازي.
2. التفاعل الاجتماعي للأمهات في مهمة التفاعل بين الأمهات الثانية (MI2)
   1. تنفيذ هذه المهمة مباشرة بعد المهمة MI1.
   2. إعداد الساحة بحيث تحتوي على أحد الزوايا فارغة كأس شبكة سلكية والزاوية معارضة يحتوي على السد تحت كأس سلك شبكة. إذا كانت الفئران قادرة على تحريك الكأس ، وزن الكأس مع الوزن الذي يمكن تسجيلها في الجزء العلوي من الكأس لمنع الحركة. وضع الفراش عش متسخة من قفص المنزل في زاوية أخرى.
   3. تشغيل المهمة MI2. ضع الجرو في الزاوية الفارغة وسجل السلوك لمدة خمس دقائق في 30 إطارًا في الثانية ، مما يسمح للجرو بالاستكشاف. تشغيل كل الجرو على حدة وتنظيف شامل الساحة بأكملها والأسلاك الكؤوس شبكة بين كل جرو.

7. فحص مهمة السلوك الاجتماعي للبالغين

1. تشغيل السلوك الاجتماعي للبالغين في نفس الفئران التي تم تشغيلها في مهمة MI1 و MI2 بمجرد أن يكونوا بالغين (P60-P70 أو أكثر). تم جمع البيانات هنا في مجموعة منفصلة.
2. التعامل مع الفئران الكبار لمدة 3 أيام متتالية للسماح بالتعود على المجرب. تأكد من أن المجربين فقط الذين تم التعرف على الفئران تشغيل تجارب السلوك، من الناحية المثالية يكون نفس الشخص تشغيل كافة المهام.
3. اعتاد الفئران إلى الساحة OF لمدة 3 أيام لمدة 5 دقائق كل يوم.
4. سلوك المعايرة في مهمة جديدة للتعرف على الكائن لقياس الحركة العامة والاهتمام في كائن جديد. وهذا سيسمح بتفسير أكثر جدوى للسلوك الاجتماعي إذا كانت الفئران لديها عجز محدد في التفاعلات الاجتماعية.
   1. ضع الفئران في الساحة لمدة 5 دقائق مع كائن جديد (لعبة بلاستيكية صغيرة مع أسطح ناعمة وقابلة للتنظيف) في زاوية واحدة من الساحة. تنظيف الساحة تماما بين الفئران مع 70٪ الإيثانول.
   2. للتعرف على الكائن الرواية، ضع "الكائن الروائي" المكشوف سابقًا، وهو مألوف الآن، في زاوية واحدة ووضع كائن جديد جديد في الزاوية المتعارضة. لجميع المهام، قم بتبديل الزوايا بين الإصدارات كتحكم.
   3. للتفاعل الاجتماعي الجديد ، تأكد من أن الفئران الجديدة هي العمر والإجهاد ومطابقة الجنس ويتم تأقلمها مع كأس الأسلاك الشبكية لمدة 2 أيام متتالية لمدة 5 دقائق كل يوم. لكل محاكمة، ضع ماوس رواية تحت كأس سلك شبكة وفي مكان الزاوية المتعارضة كأس سلك شبكة فارغة. السماح للفئران استكشاف الساحة لمدة 5 دقائق أثناء تسجيل السلوك. تنظيف الساحة والأسلاك شبكة أكواب تماما بين كل محاكمة.

8. تحليل البيانات السلوكية

1. استخدام DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) لتنفيذ الجزء الأساسي من تتبع الجسم). يمكن العثور على ملاحظات مفصلة حول كيفية تثبيت واستخدام DeepLabCut على صفحة GitHub. كما تتوفر مكتبة مخصصة تعتمد على الثعبان "dlc_utils" (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) لمزيد من التحليل للبيانات بعد الانتهاء من تتبع أجزاء الجسم الأساسية. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول كيفية استخدام هذه المكتبة في صفحة GitHub.
   1. تثبيت DeepLabCut باستخدام عملية التثبيت اناكوندا. تثبيت واجهة المستخدم الرسومية قادرة على وحدة المعالجة المركزية فقط نسخة من DeepLabCut وكذلك إصدار GPU تمكين لتدريب الشبكة.
   2. اتبع التعليمات المتوفرة في الرابط أدناه لإنشاء مشروع لتتبع أجزاء الجسم. Breifly ، واختيار عينة من الإطارات من مجموعة البيانات الخاصة بك ، ووضع علامة يدويا على أجزاء الجسم ذات الصلة في هذه الإطارات العينات. تدريب شبكة DeepLabCut للتنبؤ أجزاء الجسم والتحقق من أن الشبكة المدربة يؤدي بشكل كاف.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
   3. لأغراض تتبع موضع الجسم وتحديد التفاعلات البسيطة في حقل مفتوح، وتحديد مركز الحيوان، والرأس (المحددة التشغيلية كنقطة الوسط بين الأذنين)، والأذنين الأيسر والأيمين، فضلا عن خطم وقاعدة الذيل. بعد أن أجزاء متعددة من الجسم تتبع يسمح لاستبدال المناسبة عندما تكون بعض أجزاء الجسم مفقودة في الإطار بسبب انسداد.
   4. وبصرف النظر عن أجزاء جسم الحيوان، تتبع مجموعة متنوعة من النقاط المتعلقة بالبيئة: مثل حواف صناديق السلوك. هذه تسمح لتقدير تكرار هذه النقاط عبر جلسات متعددة -- حتى لو كان موقف الإعداد السلوكي يتغير قليلا بالنسبة للكاميرا بين الدورات.
   5. بعد تتبع أجزاء الجسم من بيانات السلوك، يجب الحرص على تصفية مواقع أجزاء الجسم المتوقعة استنادًا إلى الثقة المرتبطة بالتنبؤ في كل إطار من الفيديو. وعادة ما ترتبط التنبؤات منخفضة الثقة مع أجزاء الجسم المُكدَّس. وفيما يتعلق بهذه التنبؤات، يستعاض عن جزء من الجسم بجسد آخر (إذا كان هذا الاستبدال مناسباً) أو يستخدم مواقع أجزاء أخرى من الجسم للتنبؤ بالمكان الذي يحتمل أن يكون فيه جزء الجسم المعني. بالنسبة لمعظم التطبيقات الميدانية المفتوحة ، نادراً ما يتم انسداد مركز جسم القوارض ويمكن التنبؤ به بدقة ودقة عالية.
   6. استخدام الموقع المتوقع للرويد وكذلك موقع النقاط المتعقبة في البيئة لتقدير عدد من ميزات سلوك الحيوان. على سبيل المثال، في بيانات الحقل المفتوح، يمكن استخدام مشتقة الوقت للموقف لحساب سرعة الحيوان.
2. لتجنب التحيز ، وإجراء جميع التجارب "أعمى" فيما يتعلق المجموعة التجريبية عندما يكون ذلك ممكنا ، وخصوصا عندما يكون هناك أي عنصر ذاتي في تقييم النتائج. اختبار أثر الاختلافات بين الجنسين على النتائج التجريبية الرئيسية عن طريق تجميع البيانات في مجموعات الذكور والإناث. تم تصميم جميع الاختبارات الإحصائية لاختبار عدد متساو من الحيوانات بين المجموعات.

9. بعد عد الخلايا المخصصة لتوصيف مدى الخلية transfection

1. تحديد عدد الخلايا التي تُعد لكل فأرة حيث لن يكون لدى جميع الفئران عدوى ناجحة وسيكون هناك تباين في عدد الخلايا المصابة. طريقة واحدة لتحقيق ذلك ينطوي على عد عدد الخلايا العصبية المُصابة بالعدوى في أقسام الإكللية المتناوبة متبوعة بالاستيفاء لتقدير العدد الإجمالي للخلايا المُصابة بالعدوى. لهذا، صورة وفرز كل قسم آخر التاجية (50 μm).
   1. استخدام الانفعالات عبر القلب مع 4٪ PFA لإصلاح الأنسجة ومن ثم تشريح الدماغ. بعد cryoprotection، قسم الدماغ في أقسام الإكلال في 50 ميكرومتر.
   2. بالنسبة للقشرة الأمامية، عد الخلايا داخل +2.75 و + 1.35 مم من بريغما. تحتوي هذه الإحداثيات على مناطق القشرية الأمامية وتشمل جزءًا من قشرة التنسن (S1).  باستخدام هذه الطريقة، لم تكن هناك خلايا مُلاحظة مُصابة بالعدوى في مناطق القشرية الكَدَية أو المناطق تحت القشرية.
   3. تأكد من الإشارة إلى اليسار من نصف الكرة الأيمن، مثل وضع علامة على نصف الكرة الأرضية واحد بثقب إبرة أثناء القطاعات، وعدد الخلايا ثنائياً. استخدم برنامج جرد الخلايا التلقائي أو عد الخلايا يدوياً، مما يؤكد وجود جسم خلية باستخدام DAPI.
2. بمجرد الحصول على عدد الخلايا، قم بتعيين حد للتضمين. على سبيل المثال، تشمل فقط الفئران التي يتم كهربها ثنائيا في التحليل. لمزيد من التحليل، ربط عدد الخلايا التي تُعدّ مع الاستجابات السلوكية لمعرفة ما إذا كان هناك اقتران. هذه التقنية سوف تستهدف مناطق متعددة في الدماغ، لذلك فمن الضروري توفير معلومات عن مناطق الدماغ التي تم التلاعب بها وراثيا.
   ملاحظة: من الممكن أن التلاعب بجينات معينة يمكن أن يغير هجرة الخلايا العصبية، والمواصفات و / أو الموت. تأكد أثناء عد الخلايا أن تشريح الدماغ يتم فحصه وكل خلية عصبية مُصابة بالعدوى داخل الطبقة التي كان من المفترض أن تكون مُصابة بالعدوى (أي L2/3). يمكن أيضًا قياس القياسات التشريحية الإجمالية مثل سمك القشرية عن طريق قياس المسافة من البيا إلى L6 القشرية.

النتائج

تطوير وتنفيذ بنجاح من العرف-- بنيت الكهربائي وثلاثة شوكة القطب.
بالنسبة للـ IUEs ، تم بناء جهاز كهربائي غير مكلف مبني خصيصًا استنادًا إلى تصميم تم وصفه سابقًا²⁷ (الشكل 1A والشكل 2). وأدلى القطب ثلاثة^{شوكة 23،24}

Discussion

هنا، يتم وصف خط أنابيب يجمع بين التلاعب الجينات الجديدة من الاهتمام في مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية القشرية الأمامية مع المقايسات السلوكية في الفئران. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا الأنبوب للدراسة الطولية للسلوك في نفس الفئران أثناء مرحلة ما بعد الولادة المبكرة وفي مرحلة البلوغ. هذه التق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
13mm Silk Black Braided Suture	Havel's	SB77D	Suture skin
Adson Forceps	F.S.T.	11006-12	IUE
C270 Webcam	Logitech	N/A	Record behavior
Electroporator	Custom-built	N/A	See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps	Bio Basic Inc.	BS466	Pladmid preparation
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G	Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp	F.S.T.	14060-09	IUE
Fisherbrand Gauze Sponges	Fisher Scientific	1376152	IUE
Gaymar Heating/Cooling	Braintree	TP-700	Heating Pad
Glass pipette puller	Sutter Instrument,	P-97	IUE
Glass pipettes	Sutter Instrument,	BF150-117-10	IUE
Hair Removal Lotion	Nair	N/A	Hair removal
Hartman Hemostats	F.S.T.	13002-10	IUE
Open field maze- homemade acrylic arena	Custom-built	N/A	50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP	Addgene	11150	Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III	Parker Hannifin	N/A	pressure injector
Retractor - 2 Pronged Blunt	F.S.T.	17023-13	IUE
Ring forceps	F.S.T.	11103-09	IUE
Sterilizer, dry bead	Sigma	Z378569	sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY	Havel's	HJ398	Suture muscle
Water bath	Cole-Parmer	EW-12105-84	warming sterile saline