JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توفر هذه المقالة بروتوكولات لتصميم وتجميع الهياكل النانوية من oligomers حمض الببتيد النوى المعدل بأشعة غاما في مخاليط المذيبات العضوية.

Abstract

الاستراتيجيات الحالية في الحمض النووي والRNA nanotechnology تمكين التجميع الذاتي لمجموعة متنوعة من الهياكل النانوية حمض النووي في وسائل الإعلام المائية أو رطبة بشكل كبير. في هذه المقالة، ونحن وصف البروتوكولات التفصيلية التي تمكن من بناء بنيات الألياف النانوية في مخاليط المذيبات العضوية من خلال التجميع الذاتي من فريد من نوعه، واحدة تقطعت بهم السبل، وحامض نوبيتيد غاما المعدلة (γPNA) البلاط. كل البلاط واحد الذين تقطعت بهم السبل (SST) هو 12 قاعدة oligomer γPNA تتألف من اثنين من المجالات وحدات متسلسلة من 6 قواعد لكل منهما. يمكن ربط كل مجال إلى مجال تكميلي متبادل موجود على فروع مجاورة باستخدام التكامل المبرمج لتشكيل ألياف النانو التي يمكن أن تنمو إلى ميكرون في الطول. يتكون عزر SST من 9 أزروميات إجمالية لتمكين تشكيل ألياف نانوية 3 فليكس. وعلى النقيض من الهياكل النانوية المماثلة للحمض النووي، والتي تشكل هياكل أحادية القطر، تشكل أنظمة γPNA هذه ألياف نانوية تجمع على طول عرضها أثناء التجميع الذاتي في مخاليط المذيبات العضوية. ولذلك، تشمل بروتوكولات التجميع الذاتي الموصوفة هنا أيضاً مادة سطحية تقليدية، هي دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، للحد من تأثيرات التجميع.

Introduction

البناء الناجح للعديد من الهياكل النانوية المعقدة1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12 في وسائل الإعلام المائية أو رطب بشكل كبير باستخدام الأحماض النووية التي تحدث بشكل طبيعي مثل الحمض النووي1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 و RNA11،وقد تم عرض12 في الأعمال السابقة. ومع ذلك، الأحماض النووية التي تحدث بشكل طبيعي تخضع للتغيرات التكونية الزللية المزدوجة أو قد خفضت الاستقرارات الحرارية في مخاليط المذيبات العضوية13،14.

في السابق، وقد أبلغ مختبرنا طريقة نحو بناء ألياف نانوية 3-فليكس باستخدام غاما موقف حمض نووي اصطناعية معدلة يحاكي يسمى الأحماض النووية غاما الببتيد (γPNA)15 (الشكل 1A). وقد نوقشت الحاجة لمثل هذا التطور والتطبيقات المحتملة من الحمض النووي الاصطناعية محاكاة السلطة الوطنية الفلسطينية داخل مجال16,17. لقد أظهرنا، من خلال التكيف من البلاط واحد الذين تقطعت بهم السبل (SST) استراتيجية المقدمة لل DNA nanostructures18،19،20، أن 9 متميزة بالتسلسل γPNA oligomers يمكن تصميمها لتشكيل 3-ألياف نانوية الحلزونية في مختارة من خليط المذيبات العضوية القطبية aprotic مثل DMSO وDMF. وقد تم طلب أوليجومر γPNA تجاريا مع تعديلات من (R)-دي إيثيلين جلايكول (ميني-PEG) في ثلاثة مواقع γ (1, 4 و 8 مراكز قاعدة) على طول كل 12 قاعدة oligomer استنادا إلى الأساليب التي نشرتها Sahu وآخرون. 21 تسبب هذه التعديلات غاما قبل المنظمة الهليلية التي ترتبط مع تقارب الربط العالي والاستقرار الحراري من γPNA نسبة إلى السلطة الوطنية الفلسطينية غير المعدلة.

هذه المادة هو التكيف من عملنا المبلغ عنها التي نقوم بالتحقيق في آثار حل المذيبات واستبدالها مع الحمض النووي على تشكيل نانو15أساسها γPNA . والهدف من هذه المادة هو تقديم أوصاف مفصلة للتصميم وكذلك بروتوكولات مفصلة لأساليب المذيبات التي تم تكييفها التي تم تطويرها للتجميع الذاتي وتوصيف γPNA nanofiber. وهكذا، فإننا نقدم أولا استراتيجية SST وحدات، منصة عامة لتصميم نانوتكني باستخدام الحمض النووي الاصطناعية تقليد السلطة الوطنية الفلسطينية.

وقد تم الإبلاغ عن الملعب الهليلة لدوبلوجات السلطة الوطنية الفلسطينية لتكون 18 قواعد في بدوره بالمقارنة مع دوبليكس الحمض النووي، والتي تخضع لدور واحد لكل 10.5 قواعد(الشكل 1B). لذلك، تم تعيين نطاق طول SSTs γPNA المُظهر في 6 قواعد لاستيعاب ثلث دورة كاملة أو 120 درجة من الدوران لتمكين التفاعل بين ثلاث هثيات ثلاثية. أيضا ، على عكس الزخارف SST السابقة ، كل SST يحتوي على مجالات فقط 2 ، وخلق فعال 1 الأبعاد الشريط مثل هيكل يلتف لتشكيل حزمة ثلاثية الحلزون(الشكل 1C). كل 12 قاعدة γPNA oligomer هي غاما معدلة في 1، 4 و 8 مواقف لضمان توزيع متباعدة بشكل موحد من مجموعات صغيرة PEG عبر عزر SST الشاملة. بالإضافة إلى ذلك، داخل عزر، وهناك نوعان من oligomers: "متجاورة" فروع التي توجد على حلزون واحد والهلولب تمتد "كروس" فروع(الشكل 1D). وبالإضافة إلى ذلك، يتم وضع علامة على oligomers P8 و P6 مع Cy3 الفلورسنت (النجم الأخضر) و biotin (بيضاوي أصفر)، على التوالي (الشكل 1D)، لتمكين الكشف عن تشكيل الهيكل باستخدام المجهر الفلوري. بالإجمال، يتكون عزر SST من 9 oligomers مجموع لتمكين تشكيل 3-الحلزون الألياف النانوية من خلال التكامل المبرمج لكل مجال على حدة إلى المجال المقابلة على oligomer المجاورة (الشكل 1E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تصميم تسلسل γPNA

  1. تحميل أداة تصميم الحمض النووي22 التي وضعتها مختبر Winfree في Caltech23 في المجلد الذي يحتوي على البرامج النصية لبرمجة تصميم تسلسلات.
  2. ضمن مجلد تصميم التسلسل هذا، افتح لغة برمجة من الجيل الرابع متوافقة مع ملحق الملف ".m"، ثم أضف المجلد "DNAdesign" الذي تم تنزيله مسبقًا إلى المسار باستخدام الأمر التالي:
    >> ادب DNAdesign
  3. تشغيل البرنامج النصي التالي باسم "PNA3nanofiber.m" (راجع الشكل التكميلي 1)باستخدام الأمر التالي:
    >> PNA3nanofiber
  4. تشغيل هذا البرنامج النصي لإنشاء متغيرات تسمى "thisSeqs" و "thisScore"." المتغير "thisSeqs" يحتوي على تسلسل oligomers المصممة، و "thisScore" هو درجة عقوبة.
  5. تشغيل البرنامج النصي عدة مرات للحصول على نقاط الحد الأدنى. وتوجد عينة من 20 جولة من هذا القبيل في الجدول 1.
  6. تأكد يدوياً من التكامل المطلوب Watson-Crick لكل مجال من التسلسلات التي تم إنشاؤها لزخارف الهيكلية SST المحددة. مواصفات التسلسل لبنية الألياف النانوية 3-فليكس مبينة في الجدول 2.
  7. تحقق مما يلي من أجل التسلسلات التي تم إنشاؤها.
    1. تجنب استخدام أربع قواعد متتالية C و G.
    2. حدد تسلسلات محددة يدويًا لوظيفية N-Terminal مع صبغة الفلورسنت وجزيئات البيوتين لتمكين دراسات المجهر الفلورسنت.
    3. وتشمل ما لا يقل عن 3 ميني PEG غاما التعديلات على العمود الفقري لتمكين التشكل قبل تنظيمها الهليلية في oligomers التي تقطعت بها السبل واحد كما وصفها Sahu وآخرون. 21

2. إعداد فروع الأسهم γPNA

  1. الحصول على خيوط المكون γPNA من تسلسل محدد في 50 نمول على نطاق التوليف مع الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) تنقية من الشركة المصنعة التجارية.
  2. resuspend كل حبلا في المياه ديوند إلى تركيزات 300 μM. تخزين خيوط resuspended في -20 درجة مئوية الفريزر تصل إلى عدة أشهر حتى الحاجة إلى التجريب.

3. دراسات منحنى ذوبان من المجموعات الفرعية oligomer γPNA

  1. الحصول على ذوبان درجات الحرارة نطاقات لمجموعات مختلفة من تكميلية 2-oligomer و 3-oligomer مجموعات فرعية عن طريق تشغيل دراسة منحنى ذوبان في المخازن المؤقتة مائي مثل 1x الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) أو المذيبات العضوية القطبية المفضلة مثل ديميثيلفورماميد (DMF) أو ثنائي الفينيل سلفوكسيد (DMSO) (انظر الشكل 2).
    ملاحظة: تبدأ منحنيات الذوبان الحراري في >50٪ من DMF في فقدان خط الأساس العلوي وتظهر اضطرابات شديدة جزئياً بسبب ارتفاع امتصاص DMF عند الطول الموجي اللازم للتجارب. هذه ظاهرة لوحظت في الأدب24. ومع ذلك فمن الممكن الحصول على منحنيات ذوبان في 5 μM تركيزات في هذه الظروف المذيبات.
    1. Aliquot 16.7 μL من 300 ميكرومتر من كل μM مخزون كل oligomer وجعل الحجم النهائي إلى 1000 ميكرولتر إما في 1X PBS أو 100٪ (v/ الخامس) DMSO أو 100٪ (v/v) DMF الحصول على نحو فعال 5 μM التركيز النهائي لكل oligomer. نقل هذا الخليط الفرعي oligomer إلى مسار بصري 1 سم، كفت الكوارتز.
    2. إجراء تجارب UV-Vis متغيرة الحرارة في مقياس طيفي مجهز بقطعة درجة حرارة قابلة للبرمجة.
    3. جمع نقاط البيانات عن منحنيات انصهار على مدى درجة حرارة 15\u201290 درجة مئوية لكل من التبريد (الوَرَد) والتدفئة (ذوبان) دورات بمعدل 0.5\u20121 ° C / min. الاحتفاظ بالعينات لمدة 10 دقيقة في 90 درجة مئوية قبل التبريد وعلى 15 درجة مئوية قبل التدفئة. تحديد درجة حرارة الذوبان (Tm)من ذروة المشتقة الأولى من منحنى التدفئة.
    4. تحقق من أن ذوبان نطاقات درجة الحرارة للمجموعات الفرعية 2-oligomer هي فوق 35 درجة مئوية في جميع الحالات المذيبات. بالإضافة إلى ذلك، تحقق من أن المجموعات الفرعية 3-oligomer المقابلة التي تحتوي على حبل إضافية إلى المجموعة الفرعية 2-oligomer مكافئة يظهر زيادة كبيرة في Tm بسبب زيادة في التشغيل المشترك.
      ملاحظة: هذا من شأنه أن يتحقق من أن وعاء واحد التجميع الذاتي من oligomers متعددة يمكن أن أضعاف تعاونية في بنية النانو المطلوب مع الاستقرار الحراري معقول.

4. بروتوكول التجميع الذاتي لعدة γPNA oligomers متميزة

ملاحظة: لوضع بروتوكول منحدر حراري ذاتي التجميع للهياكل النانوية γPNA، من المرغوب فيه أن يكون الهابط البطيء المنحنى.

  1. في حالة تسلسل oligomer ولدت، حُل العينات ل 22.5 ساعة في تبريد دورة حرارية من 90 إلى 20 درجة مئوية. عادة، درجة حرارة ذوبان الحصول على 2-oligomer و 3-oligomer γPNA المجموعات الفرعية تكمن في نطاقات من 40\u201270 درجة مئوية لظروف المذيبات المختلفة.
  2. برنامج دورة الحرارية على النحو التالي : عقد في 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، منحدر من 90 إلى 70 درجة مئوية بمعدل ثابت من 0.1 درجة مئوية / دقيقة، منحدر من 70 إلى 40 درجة مئوية بمعدل 0.1 درجة مئوية/ 3 دقيقة، منحدر من 40 إلى 20 درجة مئوية بمعدل 0.1 درجة مئوية / دقيقة وعقد عند 4 درجة مئوية (انظر الجدول 3). يمكن تخزين العينات في 4 درجة مئوية لمدة 12\u201224 ساعة قبل التوصيف.
    ملاحظة : في حين 2 - و 3 - oligomer مجموعات فرعية من نظام الألياف النانوية لدينا يمكن أن تشكل في برنامج تلفزيوني 1X ، والألياف النانوية على نطاق الميكرن الكامل في 1X برنامج تلفزيوني. ولذلك، ينبغي تحسين ظروف المذيبات على أساس حجم وحجم الهيكل الذي يجري تشكيله، فضلا عن نوع وكثافة تعديلات غاما.
  3. لمقياس ميكرون طويلة 3-ألياف نانوية الحلزونية، وإعداد عينات دفعة مناديل في 75٪ DMSO: H2O (v/v)، 75٪ DMF: H2O (v/v)، 40٪ 1،4-Dioxane: H2O (v/v) استناداً إلى دراسات التحسين المذيبات15.
  4. إعداد دفعات الحنية على النحو التالي (انظر الجدول 4). أولاً، إعداد 10 ميكرولتر دون رصيد بتركيزات 20 ميكرومتر من الأسهم الرئيسية 300 ميكرومتر لكل oligomer عن طريق الاقتباس 0.67 ميكرولتر من المخزون الرئيسي وجعل الحجم إلى 10 ميكرولتر باستخدام المياه الأيونية.
  5. Aliquot 1μL من 20 ميكرومتر من الأسهم الفرعية لكل oligomer وإضافته إلى أنبوب PCR 200 ميكرولتر. وهذا يمثل حجم إجمالي قدره 9 ميكرولتر ل9 أوريغومرات.
  6. إضافة إما 30 ميكرولتر من DMSO/DMF اللامائية اللامائية لـ 75٪ DMSO و 75٪ DMF مع 1 ميكرولتر إضافية من المياه غير المؤينة لجعل حجم نهائي من 40 ميكرولتر مع كل أوليغومر بتركيزات نهائية 500 nM. إضافة 16 μL من 1،4-ديوكسيان وجعل حجم مع المياه ديونيد إلى 40 μL لحالة المذيبات 40٪ ديكوكسيان.
  7. تحميل دفعات على الدراجات الحرارية و الحنّي باستخدام البروتوكول المذكور في الخطوة 4.2.

5. مجموع الانعكاس الداخلي (TIRF) التصوير المجهري

  1. إعداد غرفة الرطوبة من مربع نصائح ماصة فارغة. ملء مربع مع ما يقرب من 5 مل من الماء لمنع تجفيف قنوات تدفق العينة وصفها على النحو التالي (انظر الشكل 3).
  2. إعداد غرفة تدفق مع شريحة المجهر، 2 الشريط على الوجهين، وأغطية النيتروسليلوز المغلفة. لمعطف الأغطية مع النيتروسليلوز، تراجع الغطاء في منبر يحتوي على 0.1٪ collodion في خلات اميل والهواء الجاف.
    1. إعداد حل نيتروسيلولوزي عن طريق جعل التخفيف 20 أضعاف من 2٪ المتاحة تجاريا coll في خلات اميل مع مذيبات الأسيتات ايساميل.
  3. إعداد البيولوجينات الأبقار المصل الألبومين (البيوتين - BSA) حل عن طريق وزنها 1 ملغ من البيوتين - BSA وحلها في 1 مل من 1X PBS. تدفق 15 ميكرولتر من 1 ملغم / مل البيوتين BSA في 1x PBS العازلة عن طريق وضع قناة تدفق في زاوية. احتضان قناة التدفق لمدة 2-4 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
  4. إعداد العازلة غسل عن طريق حل 1 ملغ من BSA في 1 مل من 1X PBS. غسل الزائدة البيوتين-BSA عن طريق تدفق 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل. لتمرير السطح، احتضان قناة التدفق لمدة 2-4 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
  5. إعداد حل streptavidin عن طريق قياس 0.5 ملغ من streptavidin و 1 ملغ من BSA ثم حل باستخدام 1 مل من 1X PBS. تدفق 15 ميكرولتر من 0.5 ملغم / مل streptavidin في 1X برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ملغ / مل BSA. احتضان قناة التدفق لمدة 2-4 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة. تدفق 15 ميكرولتر من مخزن الغسيل لغسل خارج Streptavidin غير منضم.
  6. تدفق 15 ميكرولتر من دفعة من القليد سابقا من oligomers γPNA في تركيز 500 NM لكل حبلا في إما 75٪ DMSO، 75٪ DMF أو 40٪ 1،4-حالة ديوكسيان. احتضان قناة التدفق لمدة 2-4 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
  7. إعداد 1 mM Trolox في الظروف المفضلة المذيبات عن طريق تخفيف 10 أضعاف من مخزون 10 mM من Trolox في DMSO (قياس 2.5 ملغ من ترولوكسي وحل في 1 مل من DMSO). غسل الهياكل النانوية غير منضمة في قناة تدفق مع 15 ميكرولتر من 1 mM Trolox وجود نفس تكوين المذيبات مثل الهياكل النانوية.
    ملاحظة: إن محتوى DMSO في قناة التدفق >50٪ ينتج اضطرابات إشارة طفيفة بسبب مؤشر الانكسار المختلف لحالة المذيبات أثناء TIRF والذي يتم معايرته عادة لزوايا TIRF للماء المغطي. ويمكن تصحيح هذا عن طريق الغسيل مع 1 M Trolox التي أدلى بها من خلال تخفيف 10 mM Trolox 10 أضعاف باستخدام المياه الأيونية. هذه التقنية توفر صورا أكثر وضوحا ولكنها مفيدة فقط لتقييم ما إذا كان قد حدث تشكيل، ومع ذلك، لأنه ينتج فقاعات صغيرة على مرحلتين في قناة التدفق. ونتيجة لذلك، قد تكون الهياكل النانوية مرئية عند واجهة المرحلتين كما هو موضح في الشكل 4D.
  8. نقل قناة التدفق إلى حامل الشريحة والصورة باستخدام مجهر الفلوريسكين مجهزة التصوير TIRF باستخدام هدف 60x النفط الغمر ومكبر 1.5x. مسح قناة تدفق إما 60x أو 90x التكبير عن طريق رصد قناة Cy3 (انظر الشكل 4).

6. التصوير المجهري للإلكترون (TEM)

  1. تزن 0.5 غرام من خلات أورانيل في 50 مل من الماء المقطر لإعداد 1٪ aqueous أورانيل خلات حل. تصفية 1٪ aranyl خلات حل البقعة باستخدام مرشح 0.2 μm تعلق على حقنة.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن شراء 2٪ خلات أورانيل مائي من الشركة المصنعة التجارية.
  2. شراء المتاحة تجاريا طبقة دعم formvar طبقات مطلية النحاس مع حجم 300 شبكة.
    ملاحظة: من المهم ملاحظة أنه يمكن حل طبقة الدعم formvar بعيداً عن طريق المذيبات مثل DMSO بعد 2 دقيقة. لاحتضان عينة أطول، formvar المتاحة تجاريا استقرت مع أول أكسيد السيليكون على شبكات النحاس المتاحة التي تسمح الشبكة لتكون أكثر هيدروفيلي من الشبكات المغلفة بالكربون ويمكن أن تحمل ظروف العينة قوية وشعاع الإلكترون كما هو مبين في الشكل 5C.
  3. ماصة 4 ميكرولتر من العينة على الشبكة لمدة 15 s. استخدم قطعة من ورق التصفية لشطب العينة عن طريق إحضار ورق التصفية في اتصال بالشبكة من الجانب.
  4. أضف على الفور 4 ميكرولتر من محلول البقعة على الشبكة لمدة 5 s.
  5. ويك قبالة وصمة عار كما كان من قبل وعقد ورقة مرشح ضد الشبكة لمدة 1\u20122 دقيقة للتأكد من أن الشبكة جافة. وينبغي أن عينات عادة صورة داخل 1\u20122 ساعة بعد تلطيخ. بدلاً من ذلك، إذا تم ضمان أن تكون الشبكة جافة تمامًا، يمكن تخزين الشبكات في صندوق تخزين شبكة TEM لمدة تصل إلى 3 أيام قبل التصوير.
  6. نقل الشبكة إلى حامل عينة TEM وصورة باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال تعمل في 80 كيلو فولت مع التكبير تتراوح بين 10 K إلى 150K (انظر الشكل 5).

7. morphologies مختلفة ل γPNA- الحمض النووي الهجينة على أساس استبدال انتقائي مع الحمض النووي

  1. الحصول على oligomers الحمض النووي من تسلسل محدد (انظر الجدول 5) من الشركات المصنعة ل oligonucleotide التجارية التي تم تصنيعها في 25 nmol مقياس باستخدام desalting القياسية. Resuspend هذه تسلسل الحمض النووي باستخدام المياه ديونيز خالية من RNase في تركيزات 20 μM المخزون.
  2. بالنسبة لبدائل γPNA المجاورة مع الحمض النووي، يمكن أن تحل السلاسل D3 و D5 و D9 محل فروع p3 و p5 و p9. وبالمثل، بالنسبة للحلول البديلة γPNA خيطاً مع الحمض النووي، يمكن أن تحل السلاسل D1 وD4 وD7 محل فروع p1 وp4 وp7.
  3. Aliquot 1μL من 20 ميكرومتر sub-الأرصدة لكل γPNA أو oligomer الحمض النووي وإضافته إلى أنبوب PCR 200 ميكرولتر كما هو الحال في الخطوة 2.7. إضافة 30 ميكرولتر من DMSO اللامائية و1 ميكرولتر من المياه ديونز الخالية من RNase لجعل الحجم النهائي إلى 40 ميكرولتر (انظر الجدول 6).
  4. تحميل دفعات على الدراجات الحرارية و الحنّي باستخدام البروتوكول المذكور في الخطوة 4.2.
  5. 12- يميّز γPNA-DNA الهياكل النانوية الهجينة باستخدام بروتوكول TIRF باتباع خطوات في القسم 5 أو باستخدام بروتوكول التصوير TEM المذكور في القسم 6 (انظر الشكل 6).

8. المورفولوجيا مختلفة ل γPNA الألياف النانوية في تركيزات مختلفة من SDS

  1. إعداد 20٪ (wt/v) SDS المخزون الرئيسي عن طريق قياس 20 ملغ من SDS وحلها في 100 ميكرولتر من المياه غير المؤينة.
  2. إعداد 6٪ (wt/v) SDS الفرعية عن طريق الاقتباس 3 μL من مخزون SDS 20٪ وجعل حجم إلى 10 ميكرولتر باستخدام المياه الأيونية.
  3. آنال oligomers γPNA في تركيزات نهائية من 5.25 mM و 17.5 mM SDS على النحو التالي. Aliquot 1μL من 20 ميكرومتر sub-الأرصدة لكل oligomer γPNA وإضافته إلى أنبوب PCR 200 ميكرولتر كما هو الحال في الخطوة 2.7. إضافة 30 ميكرولتر من DMSO اللامائية و 1 ميكرولتر من 6٪ و 20٪ SDS لجعل الحجم النهائي إلى 40 ميكرولتر لتحقيق تركيزات نهائية SDS من 5.25 mM و 17.5 mM على التوالي (انظر الجدول 7).
  4. تحميل دفعات من تركيزات SDS مختلفة على دورة الحرارية واللحن باستخدام البروتوكول المذكور في الخطوة 4.2.
  5. 12- يميّز الهياكل النانوية γPNA في وجود SDS باستخدام بروتوكول TIRF باتباع الخطوات الواردة في القسم 5 أو باستخدام بروتوكول التصوير TEM المذكور في القسم 6 (انظر الشكل 7).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تصف البروتوكولات التي تمت مناقشتها في الأقسام أعلاه تصميم شعار SST مقتبس من ألياف نانوية للحمض النووي للجيل القوي من هياكل الألياف النانوية المجمعة ذاتيًا باستخدام oligomers متعددة ومتميزة. يصف هذا القسم تفسير البيانات التي تم الحصول عليها من الاستجمام الناجح للبروتوكولات الموصوفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تركز هذه المقالة على تكييف وتحسين بروتوكولات النانو الموجودة في مجال تكنولوجيا النانو من حمض النووي نحو مخاليط المذيبات العضوية. تركز الطرق الموضحة هنا على التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ضمن مساحة تجريبية محددة لمذيبات عضوية عضوية قطبية مختارة. هناك حتى الآن إمكانات غير مستكشفة لب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل منحة المؤسسة الوطنية للعلوم 1739308، منحة NSF CAREER 1944130 ومن قبل مكتب القوات الجوية لأبحاث العلوم رقم FA9550-18-1-0199. وكانت تسلسل γPNA هدية سخية من الدكتور Tumul Srivastava من إصلاح الجينات تروكود ، وشركة نود أن نشكر الدكتور إريك وينفري والدكتور ريزال هاريادي لمحادثاتهم المفيدة حول رمز أداة تصميم الحمض النووي MATLAB. ونود أيضا أن نشكر جوزيف سهان، مارا سوليفان ومركز التصوير البيولوجي على مساعدتهم في جمع بيانات TEM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
γPNA strands/oligomersTrucode Gene Repair Inc.Section 2.1
UV-Vis SpectrophotometerAgilentVarian Cary 300Section 3.1.2
Quartz cuvettesStarna29-Q-10Section 3.1.1
Thermal cyclerBio RadC1000 touchSection 4.1
0.2 mL PCR tubesVWR53509-304Section 4.5
Anhydrous DMFVWREM-DX1727-6Section 4.6
Anhydrous DMSOVWREM-MX1457-6Section 4.6
Anhydrous 1,4-DioxaneFisher ScientificAC615121000Section 4.6
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)VWR75800-994Section 3.1.1
Microscope slidesVWR89085-399Section 5.2
Glass cover slipsVWR48382-126Section 5.2
2% Collodion in Amyl AcetateSigma-Aldrich9817Section 5.2
Isoamyl AcetateVWR200001-180Section 5.2
Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)Sigma-AldrichA8549Section 5.3
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153Section 5.4
StreptavidinSigma-Aldrich189730Section 5.5
TroloxSigma-Aldrich238813Section 5.7
Total Internal Reflection Fluorescence microscopeNikonNikon Ti2-ESection 5.8
Transmission Electron MicroscopeJoelJEM 1011Section 6.6
TweezersDumont0203-N5AC-POSection 6.3
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400Section 6.1
Formvar, 300 mesh, Copper gridsTed Pella Inc.1701-FSection 6.2
Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper gridsTed Pella Inc.1829Section 6.2
DNA oligomers/strandsIDTSection 7.1
Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)VWR97064-860Section 8.1

References

  1. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  3. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
  4. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  5. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
  6. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  7. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
  8. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  9. Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
  10. Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures. WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518(2018).
  11. Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
  12. Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
  13. Wang, X., Lim, H. J., Son, A. Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization. Environmental health and toxicology. 29, 2014007(2014).
  14. Bonner, G., Klibanov, A. M. Structural stability of DNA in nonaqueous solvents. Biotechnology and Bioengineering. 68, 339(2000).
  15. Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures. Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).
  16. Barluenga, S., Winssinger, N. PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions. Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).
  17. Berger, O., Gazit, E. Molecular self-assembly using peptide nucleic acids. Peptide Science. 108, 22930(2017).
  18. Rothemund, P. W., et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).
  19. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
  20. Yang, Y., et al. Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles. Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).
  21. Sahu, B., et al. Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility. Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).
  22. DNA Sequence Design Tools. , Available from: http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/ (2020).
  23. Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).
  24. Sen, A., Nielsen, P. E. On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents. Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).
  25. Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).
  26. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols. 2, 3247(2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160 xeno

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved