التصور الحركي لتفاعلات البكتيريا بين الخلايا المفردة

Summary

يسمح بروتوكول تصوير الخلايا البكتيرية الحية هذا بالتصور للتفاعلات بين أنواع بكتيرية متعددة على مستوى الخلية الواحدة بمرور الوقت. يسمح التصوير الفاصل الزمني بمراقبة كل نوع بكتيري في زراعة أحادية أو تربية نقّاء لاستجواب التفاعلات بين الأنواع في المجتمعات الجرثومية متعددة الأنواع، بما في ذلك حركية الخلايا الفردية وقابلية البقاء.

Abstract

المجتمعات متعددة الميكروبات في كل مكان في الطبيعة، ولكن دراسة تفاعلاتها على مستوى الخلية الواحدة أمر صعب. وهكذا، تم تطوير طريقة تستند إلى المجهر لمراقبة التفاعلات بين الأنواع بين اثنين من مسببات الأمراض البكتيرية. استخدام هذه الطريقة لاستجواب التفاعلات بين مسببات المرض الغرام السالبة، Pseudomonas aeruginosa وغير motile الغرام إيجابية الممرض، هو موضح هنا. يتكون هذا البروتوكول من التلقيح المشترك لكل نوع بين غطاء ومنصة agarose ، والتي تحافظ على الخلايا في مستوى واحد ويسمح بالتصور من السلوكيات البكتيرية في كل من المكان والزمان.

وعلاوة على ذلك، فإن المجهر الفاصل الزمني الذي يظهر هنا مثالي لتصور التفاعلات المبكرة التي تحدث بين نوعين أو أكثر من الأنواع البكتيرية، بما في ذلك التغيرات في حركة الأنواع البكتيرية في الزراعة الأحادية وتربية الأحياء مع الأنواع الأخرى. نظرا لطبيعة مساحة العينة المحدودة في إعداد المجهر، وهذا البروتوكول هو أقل قابلية للتطبيق لدراسة التفاعلات في وقت لاحق بين الأنواع البكتيرية مرة واحدة في مجموعات الخلايا مرتفعة جدا. ومع ذلك ، هناك العديد من التطبيقات المختلفة للبروتوكول والتي تشمل استخدام تلطيخ لتصوير الخلايا البكتيرية الحية والميتة ، وتحديد كمي من الجينات أو البروتين التعبير من خلال المراسلين الفلورسنت ، وتتبع حركة الخلايا البكتيرية في كل من الأنواع الفردية وتجارب متعددة الأنواع.

Introduction

المجتمعات متعددة الميكروبات شائعة في الطبيعة، وتمتد على مجموعة متنوعة من البيئية^1و2و3 و المنافذ البشرية^4،5. بعض من التهابات بوليكروبات الأكثر شهرة في الأمراض البشرية وتشمل الأغشية الحيوية الأسنان⁶, الجروح المزمنة^7,8, والتهابات الجهاز التنفسي في الأفراد الذين يعانون من مرض الانسداد الرئوي المزمن⁹, التنفس الصناعي المرتبطة الالتهاب الرئوي¹⁰, والتليف الكيسي المرض الوراثي (CF)^11,12. وغالبا ما تتكون هذه العدوى من أنواع ميكروبية متنوعة. ومع ذلك، فقد برز تركيز حديث على التفاعلات بين البكتيريا المكورات العنقودية الأوريوسية الإيجابية للجرام وبكتيريا Pseudomonas aeruginosa السلبية للجرام. وتكشف الدراسات التي تشمل المرضى المصابين بهذه الكائنات الحية والتحليلات المختبرية عن التفاعلات التنافسية والتعاونية التي يمكن أن يكون لها تأثيرات عميقة وغير متوقعة على تطور المرض، والبقاء على قيد الحياة الميكروبي، والفوعة، والتمثيل الغذائي، وقابلية المضادات الحيوية (استعرضت بالتفصيل من قبل ثيرتبيكيكس وآخرون 2017¹³ وليمولي وهوفمان 2019³).

وقد أدى الاهتمام المتزايد في التفاعلات بين الأنواع أثناء العدوى إلى مجموعة متنوعة من الطرق لدراسة سلوكيات المجتمع متعدد الميكروبات. عادة، استخدمت هذه الدراسات الوحايس القائمة على لوحة أو مرق للتحقيق في الاختلافات الظاهري بين الزراعة الأحادية وتربية التكث. على سبيل المثال، coculturing P. aeruginosa وS. aureus على الأسطح الصلبة سمحت للتصور من تثبيط النمو أو التغيرات في النمط الظاهري مستعمرة، الصباغ، أو إنتاج السكريات^14،15،16. الأنواع الحيوية المختلطة، على الأسطح الحيوية أو اللاأحيائية، وكذلك الأنواع البكتيرية coculturing في الثقافة السائلة كما مكن قياس التغيرات في النمو، والتمثيل الغذائي، والتسامح المضادات الحيوية، والمنافسة والاستمرارية، بالإضافة إلى الجينات والبروتين التعبير^17،18. في حين كشفت هذه التجارب الثقافة السائبة نظرة ثاقبة كيف P. aeruginosa وS. aureus قد تؤثر على بعضها البعض على نطاق المجتمع, أنها غير قادرة على الإجابة على أسئلة هامة حول التفاعلات التي تحدث على مستوى خلية واحدة. الأسلوب المعروض هنا يضيف إلى نهج لدراسة التفاعلات بين الأنواع من خلال التركيز على التغيرات في الحركة، وقابلية الخلية للحياة، والتعبير الجيني للخلايا الفردية داخل مجتمع مشترك مع مرور الوقت.

يمكن أن تختلف التفاعلات أحادية الخلية بشكل كبير عن التفاعلات التي تحدث في مجتمع الخلايا السائبة. ومن خلال التحليل أحادي الخلية، يمكن قياس التغايرية داخل المجتمع المحلي كمياً لدراسة كيفية تأثير الموضع المكاني للخلايا على ديناميات المجتمع المحلي أو كيف تتغير مستويات التعبير الجيني والبروتيني داخل فرادى أعضاء المجموعة. يمكن أن توفر خلايا التتبع أيضًا نظرة ثاقبة على كيفية تحرك الخلايا الفردية وسلوكها بمرور الوقت ، من خلال أجيال متعددة. من خلال تتبع حركة الخلايا والتغيرات في التعبير الجيني في وقت واحد، يمكن إجراء الارتباطات بين تقلبات الجينات والأنماط الظاهرية المقابلة. وقد تم وصف البروتوكولات السابقة لدراسة الأنواع البكتيرية الفردية على مستوى الخلية الواحدة. هذه الدراسات الاستفادة من خلايا التصوير الحي مع مرور الوقت في مستوى واحد، وكانت مفيدة لمراقبة الأنماط الظاهرية مثل انقسام الخلايا والمضادات الحيوية التعرض^19,20. وقد استخدمت إضافية المجهر التصوير الحي لرصد النمو، والحركة، واستعممار السطح وتشكيل بيو فيلم من الأنواع البكتيرية واحدة^21،22،23. ومع ذلك ، في حين أن هذه الدراسات كانت ثاقبة لفهم فسيولوجيا البكتيريا في الزراعة الأحادية ، فإن تجارب مراقبة سلوك الخلايا الواحدة لأنواع بكتيرية متعددة مع مرور الوقت في الزراعة المشتركة محدودة.

هنا، تم تكييف البروتوكولات السابقة المستخدمة للتصوير من نوع واحد لدراسة التفاعلات بين P. aeruginosa وS. aureus. ويمكن تمييز هذه الكائنات تحت النقيض من المرحلة على أساس morphologies الخلية(P. aeruginosa هي عصيات وS. aureus هي cocci). تطوير هذا الأسلوب مؤخرا تمكين التصور من السلوكيات الحركة غير الموصوفة سابقا من P. aeruginosa في وجود S. aureus²⁴. P. aeruginosa وجد أن تكون قادرة على استشعار S. aureus من مسافة بعيدة والاستجابة مع زيادة واتجاه حركات خلية واحدة نحو مجموعات من الخلايا S. aureus. P. aeruginosa الحركة نحو S. aureus وجدت أن تتطلب نوع الرابع بيلي (TFP), الشعر مثل التوقعات التي تمديد منسقة والتراجع توليد حركة تسمى الارتعاش²⁵حركة .

وتبين هذه الدراسات فائدة هذه الطريقة لاستجواب التفاعلات السابقة بين الأنواع. ومع ذلك، فإن التصوير بكثافة الخلايا العالية عند نقاط وقت التفاعل اللاحقة أمر صعب بالنظر إلى أنه لم يعد من الممكن تحديد طبقات واحدة من الخلايا، مما يطرح في الغالب مشكلات أثناء تحليل ما بعد التصوير. وبالنظر إلى هذا القيد، فإن الطريقة هي الأنسب للتفاعلات في وقت سابق التي يمكن بعد ذلك متابعة مع المقايسات العيانية التقليدية في أعلى كثافات الخلية ممثلة للتفاعلات في وقت لاحق. وتشمل القيود الإضافية لهذه الطريقة طبيعة منخفضة الإنتاجية، حيث يمكن تصوير عينة واحدة فقط في كل مرة وتكلفة المجهر والكاميرا وغرفة البيئة. وعلاوة على ذلك، يشكل المجهر الفلوري مخاطر على الخلايا البكتيرية مثل السمية الضوئية وphotobleaching، وبالتالي الحد من التردد الذي يمكن الحصول على الصور الفلورية. وأخيراً، فإن منصات الأاغروز المستخدمة في هذه الطريقة معرضة بشدة للتغيرات في البيئة، مما يجعل من الأهمية بمكان التحكم في ظروف مثل درجة الحرارة والرطوبة، بالنظر إلى أن الوسادات يمكن أن تبدأ في الانكماش أو التوسع إذا كانت الظروف غير صحيحة. وأخيراً، في حين أن هذه الطريقة لا تحاكي البيئة المضيفة، إلا أنها توفر أدلة حول كيفية استجابة الأنواع البكتيرية المختلفة على الأسطح، والتي يمكن متابعتها في مقايسات مصممة لمحاكاة الظروف البيئية/المضيفة.

هذه الطريقة تختلف عن الدراسات السابقة تتبع حركة الخلية المفردة، في أن يتم تلقيح الخلايا بين غطاء و لوحة agarose، تقييد الخلايا إلى السطح. وهذا يتيح تتبع الخلايا عبر الوقت في مستوى واحد; ومع ذلك، يحد من دورات الاشتباك السطحي العابر لوحظ عندما يتم غمر الخلايا في السائل²⁶. فائدة إضافية من البكتيريا التصوير تحت لوحة agarose هو أنه يحاكي المجهرية لوحة على أساس اختبار تحت السطح يستخدم كلاسيكيا لفحص P. aeruginosa ارتعاش²⁵حركة . في هذا الفحص ، يتم تلقيح الخلايا البكتيرية بين الجزء السفلي من طبق بيتري والأجار ، مع الحفاظ على الخلايا في مستوى واحد أثناء تحركها عبر الجزء السفلي من الطبق إلى الخارج من نقطة التطعيم ، مثل بروتوكول المجهر هذا.

بروتوكول المجهر الفاصل الزمني لتصور التفاعلات بين الأنواع المعروضة هنا يتكون من 1) إعداد عينة بكتيرية و وسادة agarose، 2) اختيار إعدادات المجهر للحصول على التصوير و 3) بعد التصوير التحليل. ويمكن تنفيذ تصور مفصل لحركة الخلية وتتبعها عن طريق الحصول على الصور على فترات زمنية قصيرة من قبل النقيض من المرحلة. ويمكن أيضا أن تستخدم المجهر الفلوريس لتحديد صلاحية الخلية أو التعبير الجيني مع مرور الوقت. هنا، نعرض مثالاً واحداً على التكيف مع المجهر المفلور من خلال إضافة الأصباغ الصالحة للحياة إلى منصات agarose.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: يمكن العثور على وصف كامل وأرقام الكتالوج لكافة الإمدادات في هذا البروتوكول في جدول المواد.

1. إعداد وسائل الإعلام M8T الحد الأدنى

1. إعداد 1 L من M8 الحد الأدنى من قاعدة الأملاح (5x) عن طريق حل 64 غرام من_{نا 2}HPO₄·7H₂O, 15 غرام من KH₂PO_4,و 2.5 ز ناول في 800 مل من الماء فائقة الخطورة (UPW, resistivity 18 MΩ/سم) في زجاجة 2 لتر. إلى 7.6 pH. حجم كامل إلى 1 L مع UPW. أوتوكلاف لمدة 45 دقيقة.
2. إعداد 500 مل من محلول الجلوكوز (20٪ ث / الخامس) عن طريق حل 100 غرام من الجلوكوز في 400 مل من UPW في زجاجة 1 لتر. حل كامل ل500 مل مع UPW. أوتوكلاف لمدة 45 دقيقة.
3. إعداد 500 مل من محلول تريبتون (20٪ ث / الخامس) عن طريق حل 100 غرام من التربتون في 400 مل من UPW. كاملة إلى 500 مل مع UPW. أوتوكلاف لمدة 45 دقيقة.
4. إعداد 1 L من M8 + 10٪ tryptone (M8T) الحد الأدنى من وسائل الإعلام عن طريق إضافة 200 مل من أملاح 5x M8 الحد الأدنى (1x النهائي)، 10 مل من 20٪ الجلوكوز (1 0.2% نهائي)، 1 مل من 1 م مغسو₄ (1 mM النهائي)، و 50 مل من 20٪ tryptone (1٪ النهائي) إلى 600 مل من UPW. كاملة إلى 1 لتر مع UPW. تصفية من خلال مرشح معقم 0.2 ميكرومتر في زجاجة تخزين وسائط 500 مل عقيمة.

اليوم 1:

2. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها البكتيرية

1. تلقيح 5 مل من وسائل الإعلام M8T الحد الأدنى مع مستعمرة واحدة من P. aeruginosa أو S. aureus (بما في ذلك المضادات الحيوية عند الاقتضاء) واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع تهوية لمدة لا تزيد عن 16 ساعة.
   ملاحظة: تم استخدام مسببات الأمراض البكتيرية P. aeruginosa و S. aureus لهذه الطريقة، لأنها عادة coisolated من الالتهابات المزمنة، ودراسة تفاعلاتها مهم لفهم كيفية مساهمتها في نتائج المرضى خلال التهابات بوليكروكال. ويمكن استخدام أنواع بكتيرية أخرى اعتمادا على تركيز الدراسة.

اليوم الثاني:

3. ثقافة فرعية من السلالات البكتيرية

1. ثقافة فرعية P. aeruginosa 1:500 و S. aureus 1:1000 في 5 مل من M8T الطازجة (وتشمل المضادات الحيوية عند الاقتضاء). احتضان مع تهيّم في 37 درجة مئوية حتى الثقافات تصل إلى منتصف مرحلة السجل (OD₆₀₀ = ~ 0.3 - 0.5).

4. إعداد المواد لقوالب وسادة

1. إعداد ملاعق معدنية عن طريق تسخين نهاية شقة، ملعقة مختبر مدورة مع ناسخ بونسن حتى نصف نهاية مسطحة يمكن أن تكون عازمة على زاوية 90 درجة. سخني نهاية ملعقة معملية مسطحة مستديرة أخرى وثني قليلاً لآخر 10 ملم إلى زاوية 45 درجة مئوية.
2. قطع الزوايا الأربع لقوالب السيليكون بحيث تناسب القوالب داخل طبق 35 ملم.
3. تعقيم ملعقة وزوج من ملاقط بإضافة 70٪ الإيثانول وتمريرها من خلال شعلة الشعلة Bunsen.
4. تنظيف القوالب طبق والسيليكون مع 70٪ الإيثانول وتجفيفها مع مناديل خالية من الوبر.

5. إعداد منصات agarose

ملاحظة: يتم إعداد الوسادات مع الوسائط الدنيا M8T كمصدر للمغذيات للبكتيريا المستخدمة في هذا البروتوكول. ومع ذلك، يمكن تعديل المواد الغذائية المستخدمة في منصات لمختلف الكائنات الحية.

1. تذوب 2٪ أغاروز منخفضة الذوبان في 10 مل من M8T في قارورة 50 مل Erlenmeyer نظيفة. الميكروويف في فترات قصيرة (2-5 s) حتى agarose هو في حل من أجل منع محتويات القارورة من الغليان. بمجرد ذوبانها، والسماح تبرد في حمام مائي 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
2. إعداد قوالب من خلال مواءمة انقطاع السيليكون مع فتحة في طبق 35 مم والاستفادة بخفة مع ملعقة لتأمين السيليكون إلى الطبق، وإزالة جميع فقاعات الهواء بين القالب والطبق.
3. مرة واحدة باردة، ماصة 915 ميكرولتر من agarose المنصهر في القالب. اترك الغطاء مفتوحاً ودع الوسادة تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
4. يُغطّى الطبق بالغطاء ويُترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة إضافية.
5. إعداد مناديل الرطوبة عن طريق المتداول بإحكام حتى مسح خالية من الوبر. ضع المسح المدلفن داخل طبق بيتري معقمة وأضف بالتساوي 500 ميكرولتر من الماء المعقم عبر المسح. دافئة إلى 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
6. سخني الوسادة وطبق معقمة 35 ملم إلى 37 درجة مئوية لمدة ساعة.

6. إعداد الخلايا البكتيرية ومنصات التلقيح

1. قياس₆₀₀ OD من كل ثقافة فرعية وتمييع P. aeruginosa إلى OD₆₀₀ = 0.03 و S. aureus إلى OD₆₀₀ = 0.10 في M8T مسبقا إلى 37 درجة مئوية. مزيج P. aeruginosa وS. aureus في نسبة 1:1 ودوامة.
   ملاحظة: إذا كانت السلالات تتطلب المضادات الحيوية، يمكن إضافة المضادات الحيوية إلى الاستزراع الليلي والزواحي، ولكن لا ينبغي إضافتها عند خلط الأنواع للتصوير إذا كان يؤثر على الأنواع الأخرى في زراعة الأجناس. وسوف تحتاج إلى تحديد الاستقرار plasmid وآثار المضادات الحيوية على جميع الأنواع في تربية الأحياء في كل كائن حي / plasmid المستخدمة.
2. ماصة 1 μL من تربية الأزهار بالتساوي عبر الجزء السفلي من قبل الدافئة، المعقمة 35 ملم الزجاج الأغطية الطبق.
3. إزالة انقطاع السيليكون من القالب باستخدام ملاقط عقيمة.
4. إزالة لوحة من الطبق باستخدام ملاعق العقيمة.
   1. زلة ملعقة عازمة قليلا تحت حافة لوحة، في حين عقد القالب رأسا على عقب، لإسقاطه على غطاء لوحة بيتري العقيمة.
      ملاحظة: الحرص على عدم فرض الوسادة أو سوف مزق. تتبع أي جانب من لوحة هو الجزء السفلي.
5. نقل لوحة إلى الطبق مع الخلايا البكتيرية، أسفل الجانب إلى أسفل، عن طريق تحريك ملعقة زاوية 90 درجة تحت لوحة ووضعها على رأس الغطاء ملقح. استخدام ملعقة زاوية 90 درجة لجعل وسادة تدفق ضد غطاء والضغط بلطف من أي فقاعات الهواء.
6. إزالة الرطوبة الزائدة من مناديل رطبة ثم وضع حول حافة الطبق، والتأكد من أنه لا تلمس لوحة. العينة جاهزة الآن للتصوير.

7. إعداد المجهر للتصوير الحي

1. غرفة دافئة البيئية إلى 37 درجة مئوية على الأقل 2 ساعة قبل إعداد التجريبية.
2. قم بتشغيل جميع المكونات بما في ذلك المجهر والكمبيوتر ومصادر الضوء للتصوير في البراق والفلوريس.
3. افتح برنامج التصوير وتأكد من أن مصادر الضوء متصلة وتعمل.
4. أداء Köhler الإضاءة²⁷ لمحاذاة جميع الطائرات صورة.
   1. أولاً، جلب غطاء ملحوظ في التركيز مع هدف 20x باستخدام طبق "وهمية". تأكد من أن برج المكثف هو تعيين إلى "فتح" الموقف.
      ملاحظة: ينبغي إجراء إضاءة كوهلر لكل هدف/عينة فريدة من نوعها لمحاذاة مستويات الصورة بشكل صحيح. ومع ذلك، التركيز والمحاذاة مع طبق "وهمية" على انخفاض التكبير يعجل إعداد على عينات حية في التكبير أعلى للحد من الوقت بين إعداد وتجربة وقت البدء.
   2. ركزي المكثف
      1. أغلق الحجاب الحاجز الحقلي.
         ملاحظة: يجب أن تظهر فتحة على شكل مثمن. إذا كان المكثف خارج التركيز تمامًا ، فسيظهر حقل الرؤية بأكمله (FOV) داكنًا.
      2. قم بتدوير المقابض المكثفة التي تركز على المقابض حتى تصبح حواف المثمنة واضحة.
         ملاحظة: ستزداد شدة الضوء مع اقتراب مستويات الصورة من المحاذاة الصحيحة.
   3. محاذاة المكثف.
      1. مركز مكثف الميدان عن طريق ضبط المقابض الانحياز.
         ملاحظة: يجب أن يكون محور المثمن إلى منتصف FOV. تختلف المقابض المحاذية حسب المجهر. على سبيل المثال، بعض المكثفات المجهر لها المقابض، في حين أن البعض الآخر مسامير تتطلب سائق المسمار.
   4. تركيز خيوط المصباح وضبط الفتحة المكثف.
      1. وضع تلسكوب المرحلة أو عدسة برتراند في مسار الضوء لمراقبة الطائرة الخلفية البؤري من الهدف.
         ملاحظة: يجب أن يكون هناك دائرتين متحدة المركز.
      2. بدوره مقبض التركيز عدسة برتراند حتى تبدو حلقات هش.
      3. إزالة عدسة برتراند من مسار الضوء.
   5. فتح الحجاب الحاجز الحقل حتى المثمن هو خارج للتو من FOV.
   6. تغيير الهدف 100x وشريحة حلقة مرحلة مطابقة في مكان قبل إضافة قطرة من زيت الغمر، ووضع طبق عينة أعدت على القمة.
   7. أداء Köhler الإضاءة على الهدف 100x مع طبق عينة البكتيريا.
5. التركيز على البكتيريا باستخدام التعديل غرامة فقط. بمجرد تركيز البكتيريا في FOV من خلال العدسة ، قم بتبديل مسار الضوء إلى الكاميرا عن طريق الضغط على زر الكاميرا على المجهر.
6. انقر فوق الخيار المرحلة في برنامج التصوير.
7. ضبط النسبة المئوية للضوء الصمام DIA المنبعثة عن طريق اختيار مصدر الضوء في البرنامج وإما إدخال يدويا النسبة المئوية المطلوبة من الضوء لاستخدامها أو انزلاق شريط على مقياس النسبة المئوية للضوء.
8. ضبط الوقت التعرض للضوء ديا LED عن طريق النقر على مصدر الضوء وإما إدخال يدويا وقت التعرض المطلوب أو اختيار وقت التعرض من القائمة المنسدلة المقدمة.
   ملاحظة: يختلف وقت التعرض حسب الكاميرا المستخدمة.
9. إذا كان استخدام الفلوريسين، ضبط إعدادات الكاميرا في كل قناة المقابلة (أي TxRed، GFP)، عن طريق النقر على قناة الفلورسنت من الفائدة.
   1. تعيين النسبة المئوية للضوء المفلور المنبعث، ثم ضبط وقت التعرض (كما تم تنفيذها في الخطوتين 7.7 و7.8 لضوء LED DIA).
   2. بدلاً من ذلك، قم بتغيير عمق البت لضبط النطاق الديناميكي عن طريق تحديد أحد خيارات عمق البت الأخرى في القائمة المنسدلة عناصر التحكم المرئية.
10. اختر مواضع XY ذات الأهمية بالنقر على خيار XY في قائمة عناصر التحكم في الاستحواذ.
    1. نقل موقف المرحلة مع عصا الفرح، أو عن طريق النقر على سحب FOV على الشاشة، وانقر على مربع فارغ لحفظ إحداثيات س و ص من موقف معين.
       ملاحظة: يوصى باختيار ما لا يزيد عن ثلاثة مواقع XY مختلفة، أقرب ما يمكن، للحصول على الفاصل الزمني.
11. قم بتشغيل نظام التركيز البؤري المثالي (PFS) إما بالنقر فوق مربع PFS في علامة التبويب XY في قائمة التحكم في الاكتساب أو الضغط على زر PFS في لوحة التحكم joy stick.
12. تدوير المقابض ضبط غرامة للتركيز على الخلايا البكتيرية.
13. انقر فوق زر PFS لكل موضع س ص، مرة واحدة الخلايا في المستوى المطلوب من التركيز.
    ملاحظة: PFS يعوض عن الانجراف في المحور Z أثناء تجارب الفاصل الزمني. وهذا ضروري للحفاظ على تركيز الخلايا البكتيرية مع مرور الوقت. لدى المصنوعات المختلفة أنظمة تعويض مختلفة.
14. اختيار شروط الحصول على الصور بما في ذلك فترة الاكتساب والتردد لكل قناة (على سبيل المثال، على النقيض من المرحلة وكل فلوري) عن طريق الاختيار من الخيارات في قائمة عناصر التحكم في الاستحواذ.
    ملاحظة: بالنسبة للتجارب المعروضة هنا، يتم الحصول على صور التباين في المرحلة على فترات كل 5-10 s بينما يتم الحصول على صور الفلوريس في قنوات GFP و TxRed كل 20 دقيقة.
15. ابدأ التصوير بمجرد إعداد إعدادات المجهر والاستحواذ.

8. اختياري: تعديلات للتصوير الحي / الميت

1. تذوب 2٪ agarose في 10 مل من M8T والسماح تبرد في 50 درجة مئوية حمام مائي لمدة 15 دقيقة على الأقل.
2. إضافة 1 مللي أم من يوديد بروبديسيوم إلى agarose المنصهر.
3. مرة واحدة تبريد، ماصة 915 ميكرولتر من agarose في القالب المعدة.
4. اترك الغطاء ajar واسمحوا وسادة الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. حماية من الضوء.
5. يُغطّى الطبق بالغطاء ويُترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة إضافية.
6. إعداد مناديل الرطوبة.
   1. لفة ورقة خالية من الوبر مسح بإحكام.
   2. ضع المسح في طبق بيتري معقمة وإضافة 500 ميكرولتر من الماء المعقم إلى المسح.
   3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
7. احتضان لوحة وطبق معقمة 35 ملم في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
8. المضي قدما في تلقيح الطبق كما هو مبين في القسم 6: إعداد الخلايا البكتيرية ومنصات التلقيح.

9 - تحليل البيانات

1. تعريف الخلايا
   1. افتح ملف الصورة في برنامج التصوير واحصد الملف ليتضمن فقط الإطارات التي سيتم استخدامها للتتبع، والتكبير إلى الخلايا التي تهمك، وفقط في قناة تباين المرحلة.
      ملاحظة: يمكن حفظ الملف المقصوص كملف جديد حيث يمكن تخزين بيانات التعقب دون التداخل مع الملف الأصلي.
   2. حدد الخيار لاختيار المناطق ذات الأهمية (ROI) في قائمة عناصر التحكم في التحليل وتحديد ROIs عن طريق تتبع الخلايا البكتيرية الفردية أو مجموعات من الخلايا في الإطار الأول لاستخدامها للتحليل.
      ملاحظة: يمكن تعريف ROIs يدوياً أو الثنائيات.
      1. تعريف عائد الاستثمار يدوياً
         1. تتبع محيط كل خلية بكتيرية أو مجموعات من الخلايا لتحديد يدوياً ROIs.
            ملاحظة: في برنامج التحليل، P. aeruginosa، أو غيرها من الخلايا على شكل قضيب، يمكن تتبع يدويا عن طريق اختيار العائد على الاستثمار قطع ناقص ورسم القطع الناقص تعديلها إلى حجم الخلية البكتيرية. بدلاً من ذلك، يمكن تحديد خيار عائد الاستثمار المضلع لتتبع ROIs غير التقليدية الشكل، مثل مجموعات الخلايا.
      2. تحديد ROIs ثنائي
         1. انقر على خيار ثنائي إلى عائد الاستثمار من أجل تعريف ROIs ثنائي.
            ملاحظة: يتم تعريف الكائنات في طبقة ثنائية استناداً إلى فصل الخلايا البكتيرية المنقطة الداكنة عن الخلفية الخفيفة في قناة تباين المرحلة.
         2. لعتبة الخلايا، حدد الخيار العتبة في قائمة عناصر التحكم بالتحليل. حدد قناة الاهتمام وقم بتمرير الأشرطة في الرسم البياني للفلورسل لضبط قيم الفاصل الزمني للعتبة.
            ملاحظة: يمكن أيضا تعريف كائن ثنائي لـ ROIs يمكن تعريفها في الصور الفلورية عن طريق العتبة الخلايا البكتيرية. تحدد العتبة أي شدة الفلوريسين تعتبر أشياءً وما هي شدة الفلورس التي تشكل الخلفية.
2. تتبع الخلية
   1. لتتبع ROIs يدوياً، حدد الإطار التالي في تسلسل التصوير وضبط موضع ROIs بالنقر على كل عائد استثمار وسحبه للمحاذاة مع الموضع الجديد للخلية البكتيرية الأصلية.
      ملاحظة: إذا لم تتغير الخلايا البكتيرية الموقف، لا تحتاج إلى نقل ROIs.
   2. كرر في كافة الإطارات المتتابعة التي يتم تعقب الخلايا.
   3. كما تقسيم الخلايا، تعريف الخلايا بنات كما ROIs جديدة، كما هو موضح في الخطوة 9.1، والبدء في تتبع الخلايا المقسمة حديثا.
      ملاحظة: إذا تم تعريف الخلايا على أنها ثنائيات، استخدم الدالة تعقب الثنائيات لتعقب ROIs تلقائياً في إطارات محددة.
   4. بمجرد أن يتم تعقب الخلايا من خلال جميع الإطارات المحددة، قم بتصدير البيانات ليتم تحليلها.
   5. افتح جدول البيانات وحدد القياسات المطلوبة للتحليل (أي سرعة الكائن أو التسارع أو طول المسار).
      ملاحظة: في حالة القياس على التوجيه، يلزم قياس طول المسار وطول الخط. طول الخط هو قياس المسافة الاقليدية، أو المسافة المستقيمة من أصل المسار إلى حافة مستعمرة S. aureus. طول المسار هو قياس المسافة المتراكمة، أو مجموع قطع المسار من كافة الإطارات. يمكن حساب التوجيه كنسبة من المسافة الإقليدية، D_(E)، (طول الخط)، على المسافة المتراكمة، D_(A)، (طول المسار).
3. القياس الكمي للفلور
   1. تعريف ROIs للخلايا البكتيرية الفلورية كما هو موضح في الخطوة 9.1.
   2. تكرار تتبع أو حركة ROIs للخلايا البكتيرية أو المجموعات في الإطارات الفلورية المتبقية.
   3. تصدير الجدول الذي تم إنشاؤه إلى ملف جدول بيانات لتحليل كثافة الفلورسنت.
   4. في جدول البيانات، ابحث عن العمود الذي يحتوي على "متوسط الكثافة" والذي يمثل متوسط كثافة الفلورسينس لـ ROI للخلية البكتيرية التي تم تتبعها.
   5. رسم بياني لقيم "كثافة الوسط" للنظر في التغييرات في الفلوريسنس بمرور الوقت.
      ملاحظة: تمثل التغيرات في الفلوريسنس مع مرور الوقت تقلب التعبير الجيني للجين المسمى بالفلورسنت الذي يثير الاهتمام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

سيؤدي الاستخدام الناجح للأسلوب الموصوف إلى سلسلة من الإطارات التي تولد فيديو يمكن فيه ملاحظة التفاعلات بين الأنواع بمرور الوقت. التخطيطي في الشكل 1 يوفر مرئيا لتسليط الضوء على الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها إعداد المواد للتصوير. وقد سمح استخدام هذه الطريقة مظاهرة من ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تصف الأساليب المعروضة هنا بروتوكولاً للتصوير بالخلايا الحية لتفاعلات الأنواع البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة مع تعديلات لتطبيقات أخرى بما في ذلك تتبع الخلايا ومراقبة صلاحية الخلايا. هذه الطريقة تفتح آفاقا جديدة لدراسة السلوكيات وحيدة الخلية من الكائنات الحية الدقيقة في تربية الأحي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose pads
35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass	Cellvis	D35-20-1.5-N	One for agarose pad molds, one for experiment
KimWipes	Kimberly-Clark Professional	06-666A
Low-Melt Agarose	Nu-Sieve GTG/Lonza	50081	For making agarose pads
Round-Bottom Spatulas	VWR	82027-492
Round-Tapered Spatulas	VWR	82027-530
Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive	Sigma-Aldrich	S6685-25EA	For agarose pad molds
Sterile Petri Plates, 85 mm	Kord-Valmark /sold by RPI	2900
Tweezers	VWR	89259-944
M8T Minimal Media
D (+) Glucose	RPI	G32045
KH2PO4	RPI	P250500
MgSO4	Sigma-Aldrich	208094
NaCl	RPI	S23025
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
Tryptone	BD Biosciences	DF0123173
Microscope
Andor Sona 4.2B-11	Andor	77026135	Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount.
Filter Cube GFP	Nikon	96372	Filter cube
Filter Cube TxRed	Nikon	96375	Filter cube
H201-NIKON-TI-S-ER	Okolab	77057447	Stagetop incubator
Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking	Nikon	77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950	Software for data analysis
Nikon Ti2 Eclipse	Nikon	Model Ti2-E	Microscope
CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA)	Nikon	MRD00205	Objective
CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA)	Nikon	MRD31905	Objective
ThermoBox with built-in fan heaters	Tokai Hit	TI2TB-E-BK	Enclosure
Bacterial Strains
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT)		PMID: 7604262	Non-mucoid prototroph
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)		PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2		PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT)		PMID: 23404398	USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP)		PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC ΔagrBDCA		PMID: 31713513
Viability Stain
Propidium Iodide	Invitrogen	L7012	LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit