مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية

Summary

هنا ، نحن وصف طريقة للاحترار البلاستوسيستات البشرية vitrified ، وزراعة لهم من خلال فترة زرع في المختبر ، وهضمها في خلايا واحدة وجمع الخلايا الأرومية في وقت مبكر لمزيد من التحقيق.

Abstract

زرع الإنسان، والرضا والالتصاق على سطح الرحم epithelia والغزو اللاحق للبلاستيس في decidua الأم، هو حدث البيولوجية الحرجة ولكن ملغز التي كانت تاريخيا صعوبة في الدراسة بسبب القيود التقنية والأخلاقية. يتم البدء في عملية الزرع عن طريق تطوير التروبكتوميرم إلى الأرومية المبكرة والتمايز اللاحق إلى خطوط فرعية متمايزة. قد يؤدي التمايز التروبيبلاستي المبكر المُنحرف إلى فشل الزرع وأمراض المشيمة وتشوهات الجنين والإجهاض. وقد تم مؤخراً تطوير طرق تسمح للأجنة البشرية بالنمو حتى اليوم الثالث عشر بعد الإخصاب في المختبر في غياب أنسجة الأمومة، وهي فترة زمنية تشمل فترة الزرع في البشر. وقد أعطى هذا الباحثين الفرصة للتحقيق في زرع الإنسان واختصار ديناميات التمايز trophoblast خلال هذه الفترة الحرجة دون الخلط بين التأثيرات الأم وتجنب العقبات الكامنة في دراسة الأحداث المبكرة لتمايز الأجنة في الجسم الحي. لتوصيف مختلف الطانيف الفرعية trophoblast أثناء الزرع، اعتمدنا القائمة ثنائية الأبعاد (2D) أساليب الثقافة الموسعة ووضعنا إجراء لهضم وعزل الأنزيمية أنواع مختلفة من الخلايا trophoblast لمقايسات المصب. الأجنة المستزرعة في ظروف ثنائية الأبعاد لديها مورفولوجيا مسطّحة نسبيًا وقد تكون دون المستوى الأمثل في النمذجة في العمارات الجنينية ثلاثية الأبعاد (3D) في الجسم الحي. ومع ذلك، يبدو أن التمايز الأرومية أقل تأثرا كما يتضح من التغيرات المتوقعة في المورفولوجيا والتعبير الجيني على مدى الثقافة الممتدة. يمكن فصل مختلف التوروفوبلاست sublineageages، بما في ذلك cytotrophoblast، syncytiotrophoblast وتوروفوبلاست المهاجرة حسب الحجم، والموقع، والظهور الزمني، واستخدامها لمزيد من التوصيف أو التجريب. قد يكون فحص هذه الخلايا الأرومية المبكرة مفيدًا في فهم زرع الإنسان ، وعلاج أمراض المشيمة الشائعة ، وتخفيف حدوث فقدان الحمل.

Introduction

من الصعب تاريخياً التحقيق في زرع الإنسان وظهور المشيمة المبكرة ولا يزالان مجهولين إلى حد كبير لأن الأنسجة البشرية لا يمكن الوصول إليها في هذه المرحلة التي لا يمكن فيها اكتشاف الحمل سريرياً. النماذج الحيوانية غير كافية، حيث أن المشيمة البشرية لها ميزاتها الفريدة مقارنة بالثدييات الأوروبية الأخرى. على سبيل المثال ، تغزو المشيمة البشرية بعمق في decidua مع بعض الخلايا الأرومية التي تصل على الأقل إلى الثلث الداخلي من ميوميتوميوم الرحم بينما تعيد الخلايا الأخرى تشكيل الشرايين الحلزونية الرحمية. حتى أسلافنا التطورية الأقرب، الرئيسيات غير البشرية، تظهر الاختلافات في مورفولوجيا المشيمة والتفاعلات الأرومية مع الأنسجة الوَرَقِية الأمومية^1،2،3. الحصول على ما قبل زرع الأجنة البشرية في المختبر لم يكن ممكنا حتى في عام 1980 عندما بدأ الإخصاب البشري السريري في المختبر (IVF) كممارسة روتينية لعلاج العقم⁴. الآن، يمكن زراعة الكيسات البشرية في المختبر للسماح باختيار أجنة أكثر قابلية للحياة لنقلها، فضلا عن تمكين الاختبارات الجينية الآمنة. وقد أدى التحسن في تقنيات زراعة الأجنة، فضلا عن زيادة استخدام التلقيح الاصطناعي العديد من البلاستوسيستات الفائضة التي لا تزال بعد الانتهاء من دورات علاج المريض. مع موافقة المريض، موافقة IRB، ومع بعض القيود، يمكن استخدام هذه البلاستوسيست للدراسات البحثية. لقد أصبحت موردا لا يقدر بثمن التي كانت تستخدم لاشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية⁵, فهم انتقال كتلة الخلايا الداخلية إلى الخلايا الجذعية الجنينية^6,7, ومؤخرا, وقد تم استزراع بنجاح حتى يوم (D) 13 لإعادة تشكيل زرع الإنسان^8,9. من خلال الاستفادة من النهج التي وضعت مؤخرا أوميكس خلية واحدة، والوصول إلى هذه الزرع في مرحلة أنسجة الأجنة البشرية قد عرضت فرصا فريدة لوصف الآليات الجزيئية التي تنظم هذه العملية تمايز الخلايا ديناميكية للغاية، والتي كان من المستحيل في السابق لاستكشاف^{10،11،12،13}.

هنا، نحن وصف الأساليب المستخدمة في نشرتنا الأخيرة التي تميز ديناميات التمايز trophoblast أثناء زرع الإنسان¹². ويشمل هذا البروتوكول ارتفاع درجة حرارة الخلايا البلاستية vitrified، وتربية الجنين الموسعة تصل إلى D12 بعد التلقيح الاصطناعي، والهضم الأنزيمي للجنين في خلايا واحدة، وجمع الخلايا للمصب المقايسات(الشكل 1). هذا النظام ثقافة موسعة تدعم مرحلة ما قبل زرع تطور الجنين البشري دون مدخلات الأم وتلخص التمايز trophoblast التي تظهر متسقة مع الملاحظات التي أجريت من العينات النسيجية منذ سنوات عديدة^14,15,16,17. أثناء الزرع، يتكون عدد الخلايا الدودة التورفوبلاستية من نوعين على الأقل من الخلايا: الخلايا ذات الأصل الأحادي النوى الشبيهة بالسيلوتروبوفبلاست (CTB) والـ متزامنة متعددة النوى (STB) متمايزة بشكل ميؤوس من شفائها. عند هضم التربسين ، فإن CTB هي خلايا صغيرة مستديرة لا يمكن تمييزها بشكل مورفولوجي عن أنساب الخلايا الأخرى (الشكل 2A، اللوحة اليسرى). فصل CTB من أنساب الخلايا الأخرى، مثل الغموض و endoderm البدائية، يمكن تحقيقه من خلال ملفاتهم الشخصية المستنسخة المتميزة التي كشفت عنها تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة. يمكن التعرف بسهولة على خلايا Syncytiotrophoblast على أنها هياكل غير منتظمة الشكل أكبر بكثير من أنواع الخلايا الأخرى وتقع بشكل رئيسي في محيط الجنين(الشكل 2A، اللوحة الوسطى ؛ الشكل 2B، لوحة اليسار). الخلايا التروبيبلاستية المهاجرة (MTB) هي آخر الترومبوست sublineage وجدت خلال نموت الجنين وتمدد ويمكن التعرف على أنها تتحرك على ما يبدو بعيدا عن الجسم الرئيسي للجنين(الشكل 2A، لوحة الحق ، الشكل 2B، لوحة الحق). الترود الأروميست المهاجر ، على الرغم من التعبير عن العديد من العلامات نفسها مثل trophoblast (EVT) ، لا ينبغي أن يشار إليه باسم EVT ، لأن الهياكل التافهة في المشيمة لم تظهر في هذه المرحلة المبكرة من التطور.

تجريبيا، كنا قادرين على جمع CTB صغيرة وكبيرة STB التي يمكن تمييزها بسهولة بعد يتم هضم الأجنة في خلايا واحدة في D8، D10، وD12(الشكل 2A، B). تنشأ التروبيبلاستات المهاجرة في المراحل اللاحقة من زراعة الجنين الممتدة ويمكن جمعها عند D12 قبل الهضم الأنزيمي للجنين بأكمله(الشكل 2A, B). عن طريق فصل ظاهري هذه الثلاثة الفواصل الفرعية trophoblast قبل تحليل خلية واحدة، يمكننا تحديد علامات النسخ محددة وتحديد الدور البيولوجي لكل نوع خلية. Cytotrophoblast هي الانتشارية للغاية وتعمل كخلايا السلف في توريد STB وMTB ينساب متباينة^10,11,12,13. Syncytiotrophoblast تشارك في انتاج هرمونات المشيمة للحفاظ على الحمل ، ويمكن أيضا أن تكون مسؤولة عن الأجنة التجشؤ في بطانة الرحم^{10،11،12،13}. التربوبلاست المهاجرة لديها ميزات أقوى من النمط الظاهري الغازية، و المهاجرة ومن المرجح أن تكون مسؤولة عن أعمق وأكثر اتساعا استعمار بطانة الرحم^10,11,12,13. بعد تعريف التوقيع النسخي لكل نوع خلية، كشفت تحليلات التجميع أيضاً عن مجموعتين فرعيتين إضافيتين من الخلايا التي لا يمكن تمييزها بشكل مورفولوجي عن CTB وكان لها نسخ مع ميزات STB وMTB، على التوالي¹². ومن المرجح أن تكون هذه الخلايا المتوسطة في مرحلة التمييز من CTB إلى المستويات الفرعية MTB أو STB، وكان سيتم تجاهلها إذا تم هضم الأجنة بشكل أعمى وفصل الخلايا عن طريق النسخ وحدها.

يستخدم البروتوكول الموصوف هنا نظام ثقافة ثنائي الأبعاد (2D) وقد لا يكون الأمثل لدعم التنمية الهيكلية ثلاثية الأبعاد ( 3D ) ، كما اقترح منشور حديث يصف نظام ثقافة ثلاثية الأبعاد تم تطويره حديثًا¹³. ومع ذلك، في هذا النظام 2D التمايز من trophoblast في وقت مبكر يبدو أن تتفق مع الملاحظات التي أجريت من العينات في vivo^{14،15،16،17}. ويمكن أيضا أن يكون هذا البروتوكول بسهولة تكييفها للاستخدام في نظام الثقافة 3D وصفها مؤخرا¹³ مع الحد الأدنى من التغييرات. يتم تنفيذ جميع الخطوات مع ماصة micromanipulation المحمولة مع نصائح المتاح تجاريا المتاح أو ماصة الفم من ماصة الزجاج سحبت ناعما تعلق على أنابيب المطاط، وتصفية، وبوق.

Protocol

وقد تم التبرع بجميع الأجنة البشرية بموافقة لاستخدامها في البحوث. وقد وافق المجلس الغربي لمراجعة المؤسسات (دراسة رقم 1179872) على بروتوكولات لثقافة الأجنة البشرية الموسعة، وتتبع المبادئ التوجيهية الدولية. يجب مراجعة أي استخدام للأجنة البشرية من قبل الأخلاقيات المناسبة ومجالس الإدارة المرتبطة بالمؤسسة البحثية التي تستخدم هذا البروتوكول.

1- الإعداد

1. إعداد وسائل الإعلام ولوحات الاسترداد يوم واحد قبل احترار الجنين في غطاء تدفق معقم.
   1. إعداد 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة الكيسات (BM) مع 10٪ v / v المصل البروتين بديل (SPS).
      ملاحظة: وسائط ثقافة Blastocyst قد أو قد لا تحتوي على بروتين المضافة. هنا، استخدمنا وسيلة التي يجب أن تستكمل مع 10٪ من البروتين الألبومين المشار إليها. تحقق من إرشادات الشركة المصنعة للتنويع في هذا المكملات. يجب أن يتم تصفية جميع الوسائط باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر معقمة مرفقة بحقنة معقمة قبل التوازن.
   2. ملء اثنين من مركز جيدا الجهاز ثقافة غسل الأطباق مع 500 ميكرولتر من BM مع 10٪ v / v SPS مغطاة 500 ميكرولتر من زيت الصف ثقافة الجنين.
   3. في طبق ثقافة الأنسجة 60 ملم، طبقة 8 مل من زيت ثقافة الجنين ومن ثم مرساة 20 ميكرولتر قطرات من BM مع 10٪ V / v SPS إلى الجزء السفلي من لوحة الثقافة. جعل 1 قطرة لكل جنين الدفء.
      ملاحظة: قد يتم إجراء المزيد من الأطباق، والأطباق المُسَرَكة، والغسيل حسب الحاجة. ويمكن أيضا أن تضاف قطرات إلى الطبق قبل الطبقات النفط. سوف ترسو قطرات تحت النفط تساعد على الحد من التبخر وأي تغييرات لاحقة في osmolality.
   4. اكويريبرات BM مع 10٪ v / v SPS غسل الأطباق وطبقة الانتعاش في حاضنة في 37 درجة مئوية، 6٪ CO_2، 5٪ O₂ على الأقل 4 ح.
   5. ذوبان قارورة واحدة من الخطوة الأولى من وسائل الإعلام ثقافة موسعة (IVC1) في 4 درجة مئوية أو على أعلى مقاعد البدلاء.
   6. إعداد طبق واحد من غسل 500 ميكرولتر من IVC1 مع عدم وجود تراكب النفط. Aliquot ما يقرب من 4 مل من IVC1 في أنبوب سقف المفاجئة 5 مل.
   7. اكويريبرات IVC1 غسل طبق وصغيرة المفاجئة أنبوب الغطاء من IVC1 في 37 درجة مئوية، 6٪ CO_2، والغلاف الجوي O₂ على الأقل 4 ح.
2. إعداد لوحات الثقافة الموسعة يوم واحد قبل احترار الجنين في غطاء تدفق معقم laminar.
   1. تخفيف الليفي من مصل الإنسان في الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) إلى 30 ميكروغرام / مل. 250 ميكرولتر من 30 ميكروغرام/مل سوف تكون هناك حاجة إلى الليفي لكل جنين لمعطف الغرف.
   2. فتح 8 جيدا غطاء غطاء حزمة تحت غطاء محرك السيارة مع الحرص على عدم لمس الآبار. بلطف ماصة 250 ميكرولتر من 30 ميكروغرام / مل فيبرومينكتين في كل بئر.
   3. العودة الغطاء إلى غطاء الغرف ومكان في 4 درجة مئوية لمدة 20-24 ساعة.
3. إعداد لوحة الثقافة الموسعة في صباح ارتفاع حرارة الجنين.
   1. استرداد غطاء الغرف مع fibronectin ومكان في غطاء تدفق اللامينار. إزالة خليط fibronectin مع ماصة 1 مل والتخلص منها في حاوية النفايات.
   2. استرداد الدافئة، وسائل الإعلام IVC1 توازنها من أنبوب صغير غطاء المفاجئة 5 مل.
   3. Pipette 300 μL من IVC1 توازنها في كل بئر. يجب الحرص على عدم السماح لأي سائل تلمس الغطاء لأن هذا سيزيد من خطر التلوث.
   4. العودة غطاء الغرف مع IVC1 لاحتضان في 37 درجة مئوية، 6٪ CO_2، والغلاف الجوي O₂ حتى إزالة pellucida زونا في الخطوة 4.

2. ارتفاع درجة حرارة الأجنة البشرية D5

ملاحظة: قد يكون لدى الشركات المصنعة الأخرى بروتوكولات مختلفة قليلاً وفقاً لتكنولوجيا التزجيج الخاصة بها. راجع إرشادات الشركة المصنعة للاستخدام عند الانطباق.

1. دافئ 3.0 مل من محلول الذوبان (TS) في طبق 35 مم إلى 37 درجة مئوية. جلب 300 ميكرولتر من محلول التخفيف (DS) واثنين من الآبار من 300 ميكرولتر من محلول الغسيل (WS) في 6 صحن إلى درجة حرارة الغرفة.
2. باستخدام ملقط، قم بإزالة كم جهاز التبريد بعناية مع التأكد من أن الجنين vitrified يبقى دائما تحت النيتروجين السائل.
3. بسرعة نقل جهاز cryo من النيتروجين السائل ويغرق غيض من جهاز التبريد في TS في 37 درجة مئوية. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 1 دقيقة والحفاظ على جهاز التبريد المغمورة حتى ينفصل الجنين في TS.
   ملاحظة: أجنة دافئة واحدة في كل مرة لتتبع هويات الأجنة لأنها قد تتعلق بالمعلومات الديموغرافية المريضة في تحليل المصب.
4. خلال فترة الحضانة 1 دقيقة في TS، قم بإزالة جهاز التبريد بعناية والتقط الجنين بلطف والانتقال إلى الجانب الآخر من طبق TS.
   ملاحظة: إذا كان زراعة أجنة متعددة، يجب أن يكون مجتهداً لإبقاء الأجنة منفصلة لضمان الحفاظ على الهويات الصحيحة.
5. بعد 1 دقيقة، التقط بلطف الجنين مع كمية صغيرة من TS، حوالي 2 ميكرولتر. نقل الجنين إلى الجزء السفلي من 300 ميكرولتر DS جيدا في حين تغطي الجنين في طبقة رقيقة من TS من ماصة. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 3 دقائق ووضع لوحة 6-جيدا على أعلى مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة.
6. بعد 3 دقائق، التقط الجنين بكمية صغيرة من الـ DS، حوالي 2 ميكرولتر، ثم حرك الجنين إلى أسفل البئر التالي الذي يحتوي على 300 ميكرولتر من WS. مرة أخرى، طبقة بلطف كمية صغيرة من DS من ماصة على الجنين. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 5 دقائق والعودة إلى أعلى مقاعد البدلاء.
7. بعد 5 دقائق، التقط الجنين مع الحد الأدنى من حجم WS والانتقال إلى أعلى البئر النهائي من 300 ميكرولتر WS. سوف الجنين ببطء تسقط وتغسل من خلال WS إلى القاع. طرد أي WS محتفظ بها من الماصات إلى بئر فارغة.
8. التقط الجنين بأقل حجم وارجع إلى أعلى نفس بئر WS الذي 300 ميكرولتر. سوف يسقط الجنين مرة أخرى إلى قاع البئر. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 1 دقيقة والعودة لوحة 6-جيدا إلى أعلى مقاعد البدلاء.

3- استعادة الأجنة الدافئة

1. واحد في وقت واحد، ونقل الأجنة الدافئة في طبق أنسجة الجهاز مركز جيدا تحتوي على 500 ميكرولتر من BM توازنها مع 10٪ v / v SPS تحت 500 ميكرولتر من زيت الصف ثقافة الجنين اختلال.
2. غسل الأجنة عن طريق التقاط كل جنين ونقلها حولها إلى عدة مناطق في الطبق في حين تهب وسائل الإعلام القديمة بين التحركات. التقط الجنين ونقله إلى قطرة ثقافة 20 ميكرولتر من BM المُزالة بـ 10% v/v SPS تحت الزيت.
3. اسمحوا الأجنة الدافئة استرداد ل 2 ح في ح ح في ح ح 37 درجة مئوية، 6٪ CO_2، 5٪ O_2.

4. Zona إزالة

1. بعد الشفاء 2 ساعة، وتقييم الأجنة لإعادة التوسع، واتخاذ صور لكل جنين.
2. نقل الأجنة بشكل فردي في 500 ميكرولتر من 3-(N-morpholino)-حمض البروبانسيلفونيك (MOPS) - مؤقتا التعامل مع المتوسطة مع 5٪ (الخامس / الخامس) مصل عجل الجنين (FCS) قبل العلاج مع حل تيرود الحمضية.
3. حرك جنينًا واحدًا بسرعة من خلال 300 ميكرولتر من محلول تيرود الحمضية الدافئة أثناء المشاهدة النشطة من خلال المجهر. سوف تبدأ زونا pellucida بصريا في حل. هذا سوف يستغرق حوالي 5 s.
4. نقل على الفور الجنين مع حل زونا في 300 ميكرولتر من MOPS الدافئة المخزنة المتوسطة لإخماد محلول تيرود الحمضية.
5. نقل الجنين مع الحد الأدنى من حجم MOPS المخزنة المتوسطة في مركز جيدا الجهاز طبق الأنسجة التي تحتوي على 500 ميكرولتر من BM توازن مع 10٪ v / v SPS تحت 500 ميكرولتر من زيت الصف زراعة الجنين لغسيل.
6. ارجع الجنين إلى إسقاط الاسترداد 20 ميكرولتر من الخطوة 3.2.
   ملاحظة: عند الفحص البصري بعد إزالة زونا، يمكن معالجة أي أجنة مع pellucidae زونا الاحتفاظ بها كذلك مع حل تيرود الحمضية إذا لزم الأمر، عن طريق تكرار الخطوات 4.2-4.6. من المرغوب فيه تقليل التعرض إلى حل التيرود.

5. Blastocyst ثقافة موسعة

1. نقل الأجنة بشكل فردي إلى طبق الغسيل مع وسائل الإعلام IVC1 من الخطوة 1.1.6. نقل بعناية واحد الجنين إلى بئر واحدة من غطاء الغرف مع IVC1 توازنها والحفاظ على تحديد الجنين.
   ملاحظة: هذه الخطوة يجب أن يتم الانتهاء بأسرع وقت ممكن لتقليل التبخر المتوسط.
2. عودة غطاء الغرف إلى حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية، 6٪ CO_2، الغلاف الجوي O₂ لمدة 2 أيام.
   ملاحظة: تأكد من ذوبان وتكذيب وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية، 6٪ CO_2، O الغلاف الجوي_{للوسائط} تبادل 4 ساعة مقدما.
3. عند النمو التدريجي D2 (D7 بعد الإخصاب)، قم بفحص ارتباط الأجنة تحت المجهر بعناية وقم بإجراء تبادل الوسائط.
   1. لاحظ أي جنين يتم إرفاقه بالطبق قبل تبادل الوسائط. اضغط بلطف على اللوحة وتفحص ما إذا كان الجنين قد تعلق بشكل آمن على اللوحة تحت المجهر.
   2. إزالة الغطاء وإزالة بعناية 150 ميكرولتر من IVC1 وتجاهل في حين لا يزعج الجنين المرفقة. إذا لم يكن الجنين قد تعلق بعد على لوحة، لا تبادل وسائل الإعلام، كما المصل في IVC1 سوف تساعد في مرفق الجنين.
   3. Pipette 150 μL من وسائل الإعلام الثقافة الموسعة الموازنة ، IVC2 ، ببطء في كل بئر والعودة الغطاء إلى غطاء الغرف.
      ملاحظة: تأكد من تقليل إزالة الغطاء من غطاء الأغطية المحاط بحجرة إلى أدنى حد لتجنب التبخر المتوسط.
4. أعد بعناية غطاء الأغطية المُرفَر إلى الحاضنة دون رش أي وسائط على الغطاء. كرر تبادل وسائل الإعلام وتعلق تحقق كل يوم من ثقافة ممتدة حتى الأجنة جاهزة لل التثبيت أو هضم خلية واحدة.

6. مجموعة اختيارية من وسائل الإعلام المستهلكة

1. اختياريا، وجمع وسائل الإعلام المستهلكة أثناء تبادل وسائل الإعلام الثقافية بعد D7 أو أي يوم بعد ذلك. أثناء الخطوة 5.3.2، بدلاً من تجاهل المحاذاة المتوسطة تجميد 150 ميكرولتر من IVC1 إزالتها في أنبوب معقم، منخفض الربط 0.5 مل للتحليل في المستقبل.

7. تثبيت اختياري للflufluorescence

1. استخدم ماصة 200 ميكرولتر لغسل الأجنة مع 1/2 تبادل وسائل الإعلام من برنامج تلفزيوني لمدة 3x قبل التثبيت لإزالة أي حطام خارج الخلية. غسل الحطام الزائد والبروتين سيساعد على تحسين الوضوح والحد من الخلفية في الصور التي تم الحصول عليها مع المناعة.
2. إزالة جميع وسائل الإعلام وإضافة ببطء 200 ميكرولتر من 4٪ شبهformaldehyde (PFA) في برنامج تلفزيوني إلى البئر. سوف يرغب الجنين في التمسك بسطح السائل. متعددة 150 μL يغسل مع 4٪ PFA قبل إزالة كل السوائل سوف تساعد على تقليل أي ضرر للجنين.
3. احتضان الأجنة في PFA 4% لمدة 20 دقيقة لتثبيت.
4. غسل الأجنة 3x لمدة 10 دقيقة لكل غسل مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ v/ v بوليسوربات 20 في برنامج تلفزيوني جديد.
5. تخزين الأجنة الثابتة في 0.1٪ v/v polysorbate 20 في PBS عند 4 درجة مئوية قبل المضي قدما في بروتوكول المناعةfluorescence.

8. هضم الخلية واحدة مع تريبسين

ملاحظة: الأجنة الطازجة (غير الثابتة) تستخدم في عملية هضم الخلايا المفردة.

1. اغسل الجنين مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولتر من محلول التربسين لكل بئر. العودة أغطية الغرف إلى الحاضنة لمدة 5 دقائق.
2. إزالة غطاء الغرف من الحاضنة وفحص الأجنة تحت منظار مجسم. سوف تبدأ الخلايا على أطراف الجنين في التراجع وينبغي أن يكون MTB لا يزال تعلق على لوحة حيث يتم في مكان بعيد من الجنين.
3. استخدام ماصة صغيرة أو ماصة الفم سحبت ناعما لالتقاط MTB الفردية قبل كسر بعيدا الجنين كله. تجاوز إلى الأمام إلى الخطوة 9.1 لحفظ MTB والعودة إلى الخطوة 8.4 بعد الخطوة 9.3.
4. استخدام ماصة micromanipipulation المحمولة أو ماصة الفم لتم فصل بلطف الجنين عن طريق التعرق صعودا وهبوطا.
5. ستبدأ الخلايا في الانفصال عن الجنين بأكمله. الاستمرار في التبخر الجنين بلطف وبشكل متكرر باستخدام طرف الماصات قطرها أصغر أو ماصة الفم حتى تم احتضان الجنين لما مجموعه 10 دقيقة في التربسين.

9. اختيار خلية واحدة وجمع عينة

1. مع الحد الأدنى من التربسين، نقل الخلايا المتفككة من خلال ثلاث قطرات غسل من 20 ميكرولتر PBS + 0.1٪ بولي فينيلبيروليدون (PVP) تحت زيت ثقافة الجنين مع الحرص على عدم فقدان أي خلايا.
2. بعد غسل الخلايا، استخدم ماصة زجاجية تم سحبها بدقة لتحديد خلية واحدة. بعناية ماصة الخلية الواحدة في أنبوب معقمة 0.2 مل منخفضة الربط مع الحد الأدنى من حجم برنامج تلفزيوني + 0.1٪ PVP.
3. المفاجئة تجميد الخلايا المفردة في النيتروجين السائل (LN_2)،وتخزينها في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

النتائج

أظهرت الأجنة السليمة استمرار انتشارها على مدى انتشارها(الشكل 2B). بدأت الأجنة غير الطبيعية في التراجع عن حوافها الخارجية وتتفكك (الشكل 2C). من تجربتنا، تم إرفاق ما يقرب من 75٪ من الأجنة إلى الجزء السفلي من طبق ليفي المغلفة في 48 ساعة، وزاد المرفق إلى ما يقرب من 90?...

Discussion

وقد سمح تطوير بروتوكول لزراعة الأجنة البشرية من خلال زرع العلماء لاستكشاف وقت مجهول سابقا في التنمية^8,9. هنا، نستخدم نظام ثقافة ممتد لثقافة الأجنة البشرية وندرس التمايز الأرومية المبكر قبل تشكيل المشيمة الزهية. تسمح لنا الطرق الموصوفة هنا بجمع خطوط فرعية م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NORM JECT Luer Lock sterile syringe	VWR	53548-019	Pack of 100
3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	13-998-078
35 mm Corning Primaria tissue culture dish	VWR	62406-038	Case of 500
5 mL snap cap tube	VWR	60819-295	Pack of 25
60 mm Corning Primaria tissue culture dish	VWR	25382-687	Case of 200
6-well dish	Agtech Inc.	D18	Pack of 1, 10, or 50
Acidic Tyrode's solution	Millipore Sigma	T1788	100 mL
Biotix 1250 µL pipette tips	VWR	76322-156	Pack of 960
Blast, blastocyst culture media	Origio	83060010	10 mL
Dilution Solution	Kitazato	VT802	1 x 4 mL
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Thermo Fisher Scientific	1367820D	5.75 in. (146mm); 720/Cs
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Millipore Sigma	D8537
Embryo culture paraffin oil OvOil	Vitrolife	10029	100 mL
Eppendorf PCR tubes 0.2 mL	VWR	47730-598	Pack of 1,000
Eppendorf PCR tubes 0.5 mL	VWR	89130-980	Case of 500
Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution	Millipore Sigma	F0895	1 mg
Gilson 1 mL Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 200-1000 µL
Gilson 20 µL Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 2-20 µL
Gilson 200 µL Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 50-200 µL
G-MOPS handling media	Vitrolife	10129	125 mL
Handling media	Origio	83100060	60 mL
Ibidi 8 well chambered coverslip	Ibidi	80826	15 slides per box
IVC1/IVC2	Cell Guidance Systems	M11-25/ M12-25	5-5mL aliquots
K System T47 Warming Plate	Cooper Surgical	23054
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane	Fisher Scientific	SLGVR33RS	Pack of 50
Mouth pieces	IVF Store	MP-001-Y	100 pieces
Oosafe center well dish	Oosafe	OOPW-CW05-1	Case of 500
Quinn's Advantage SPS	Origio	ART-3010	12x 12 mL
Rubber latex tubing for mouth pieces	IVF Store	IVFS-NRL-B-5	5 ft.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270
Stripper tips	Cooper Surgical	MXL3-275	20/pk 275 µm
Thawing Solution	Kitazato	VT802	2 x 4 mL
The Stripper Micropipetter	Cooper Surgical	MXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	1 x 100 mL
Tween20	Millipore Sigma	P1379-25ML	25 mL bottle
VWR 1-20 µL pipette tips	VWR	76322-134	Pack of 960
VWR 1-200 µL pipette tips	VWR	89174-526	Pack of 960
Washing Solution	Kitazato	VT802	1 x 4 mL