JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا هو بروتوكول لإلحاق CD47 الببتيد (pepCD47) إلى الدعامات المعدنية باستخدام الكيمياء polybisphosphonate. وظيفية من الدعامات المعدنية باستخدام pepCD47 يمنع المرفق وتفعيل الخلايا الالتهابية وبالتالي تحسين التوافق الحيوي.

Abstract

المضاعفات الرئيسية المرتبطة الدعامات المعدنية العارية والدعامات التي تُمَرّد المخدرات هي إعادة الدعامات في الدعامات والتخثر الدعامات المتأخر، على التوالي. وبالتالي، فإن تحسين التوافق الحيوي للدعامات المعدنية لا يزال يشكل تحديا كبيرا. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف تقنية قوية لتعديل السطح المعدني بواسطة الببتيدات النشطة بيولوجيا لزيادة التوافق الحيوي للدم الاتصال يزرع الطبية، بما في ذلك الدعامات داخل الأوعية الدموية. CD47 هو علامة مناعية خاصة بالأنواع الذاتية ولها خصائص مضادة للالتهابات. وقد أظهرت الدراسات أن 22 ببتيد الأحماض الأمينية المقابلة للمجال Ig من CD47 في المنطقة خارج الخلية (pepCD47), له خصائص مضادة للالتهابات مثل البروتين كامل الطول. في دراسات الجسم الحي في الفئران، ودراسات الجسم الحي السابق في الأرانب وأنظمة الدم البشري التجريبية من مختبرنا قد أظهرت أن pepCD47 شل الحركة على المعادن يحسن التوافق الحيوي عن طريق منع التعلق الخلوية الالتهابية والتنشيط. تصف هذه الورقة البروتوكول خطوة بخطوة لإضفاء الطابع الوظيفي على الأسطح المعدنية ومرفق الببتيد. يتم تعديل الأسطح المعدنية باستخدام البايفوسفات بوليولامين مع مجموعات الثيول الكامنة (PABT) تليها إزالة البروتكشن من الثيول وتضخيم المواقع الثيول التفاعلية عن طريق رد فعل مع البولي إثيلينمين مثبتة مع مجموعات بيريديلديثيو (PEI-PDT). وأخيرا، pepCD47، دمج بقايا السيستين المحطة متصلة تسلسل الببتيد الأساسية من خلال المزدوج 8-أمينو-3،6-ديوكسا-أوكتانويل الفضاء، تعلق على السطح المعدني عن طريق السندات كبريتيد. هذه المنهجية من التعلق الببتيد إلى سطح معدني فعالة وغير مكلفة نسبيا، وبالتالي يمكن تطبيقها لتحسين التوافق الحيوي من عدة المواد الحيوية المعدنية.

Introduction

التدخل التاجي عن طريق الجلد هو السطر الأول من العلاج لعلاج أمراض الشريان التاجي (CAD) وينطوي في المقام الأول على الدعامات الشرايين المريضة. ومع ذلك، في الدعامات إعادة تناضح (ISR) وجلخ الدعامات هي المضاعفات الشائعة المرتبطة نشر الدعامات1. يتميز تفاعل الدم في واجهة الدعامات الدموية من خلال الامتزاز الفوري تقريبا من بروتينات البلازما على السطح المعدني ، تليها الصفائح الدموية والخلايا الالتهابية مرفق وتفعيل2. يؤدي إطلاق السيتوكينات الالتهابية وchemokines من الخلايا الالتهابية المنشطة إلى تعديل فينوتيبين من خلايا العضلات السلسة الوعائية (VSMCs) في وسائط tunica ويحفز هجرتهم إلى المقصورة الإلتميمية. انتشار VSMC المنشط في نتائج intima في سماكة طبقة intimal ، التجويف تضييق و في الدعامات restenosis3. وقد تم تطوير الدعامات المُستَرَدَة من المخدرات (DES) لمنع انتشار الـ VSMC؛ ومع ذلك، هذه الأدوية لها تأثير خارج الهدف السامة للخلايا على الخلايا البطانية4،5. ولذلك، في وقت متأخر من الخثار الدعامات هو من المضاعفات الشائعة المرتبطة DES6،7. الدعامات المصنوعة من البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي، مثل بولي-L-lactide أظهرت الكثير من الوعد في التجارب الحيوانية والتجارب السريرية الأولية، ولكن تم التذكير في نهاية المطاف عندما "الحياة الحقيقية" الاستخدام السريري أظهرت دونيتها إلى الجيلالثالث DES8. لذلك، هناك حاجة لتحسين التوافق الحيوي للدعامات المعدنية العارية من أجل نتائج أفضل للمريض.

CD47 هو بروتين عبرmembrane أعرب عنه في كل مكان الذي يمنع الاستجابة المناعية الفطرية عندما ملزمة لمستقبلاتها cognate إشارة بروتين ألفا التنظيمية (SIRPα)9. مستقبلات سيربوا لديه الخلايا المناعية التيروزين المثبطة عزر (ITIM) المجال والأحداث إشارة على SIRPα - CD47 التفاعل يؤدي في نهاية المطاف في downregulation من تنشيط الخلايا الالتهابية10,11,12,13. وقد أظهرت الأبحاث في مختبرنا أن CD47 المؤتلف أو مشتق الببتيد، المقابلة ل22 مجال إيغ الأحماض الأمينية من المنطقة خارج الخلية من CD47 (pepCD47)، يمكن أن تقلل من الاستجابة المناعية المضيفة لمجموعة من المواد الحيوية ذات الصلة سريريا14،15،16. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتنا أن pepCD47 يمكن أن تكون مشلولة إلى الأسطح الدعامات الفولاذ المقاوم للصدأ والحد بشكل كبير من الاستجابة المرضية المرتبطة ريسينسيس. ملاحظة، الأسطح المعدلة pepCD47 قابلة لشروط الاستخدام ذات الصلة مثل التخزين على المدى الطويل وتعقيم أكسيد الإيثيلين17. وتحقيقا لهذه الغاية، قد يكون pepCD47 هدفا علاجيا مفيدا لمعالجة القيود السريرية للدعامات داخل الأوعية.

استراتيجية للتعلق التساهمي من pepCD47 إلى سطح معدني ينطوي على سلسلة من التعديلات الكيميائية الجديدة من سطح المعدن. يتم أولا المغلفة الأسطح المعدنية مع البيسفوسفونات بوليولامين مع مجموعات ثيول كامنة (PABT) تليها deprotection من ثيولس ومرفق من البولي ايثيلينمين (PEI) مع مجموعات ثبت pyridyldithio (PDT). مجموعات PDT من PEI unconsumed في رد الفعل مع deprotected PABT thiols ثم تتفاعل مع pepCD47 دمج thiols في بقايا السيستين المحطة الطرفية، مما أدى إلى pepCD47 ملزمة إلى السطح المعدني عن طريق السندات كبريتيد14،17،18. استخدمنا الفلوروفور مترافق pepCD47 (TAMRA-pepCD47) لتحديد تركيز المدخلات من الببتيد الذي يؤدي إلى تثبيت السطح الأقصى من الببتيد. وأخيرا، قمنا بتقييم القدرة الحادة والمزمنة المضادة للالتهابات من الأسطح المعدنية المغلفة pepCD47، والكيفو السابق، وذلك باستخدام جهاز حلقة تشاندلر، وملحق monocyte / مقايسة التوسع الضامة، على التوالي.

توفر هذه الورقة بروتوكولاً منهجياً لتعلق الببتيدات ذات الثياتيد بالسطح المعدني؛ تحديد كثافة الشل الأقصى للببتيد؛ وتقييم خصائص مضادة للالتهابات من الأسطح المعدنية المغلفة pepCD47 المعرضة للدم كله ومحاديات معزولة.

Protocol

وقد تم الحصول على جميع العينات البشرية لهذه التجربة وفقاً لـ IRB لمستشفى الأطفال في فيلادلفيا. وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات بناء على موافقة من IACUC من مستشفى الأطفال في فيلادلفيا.

1. طلاء الأسطح المعدنية العارية مع PEI-PDT

  1. غسل القسائم احباط الفولاذ المقاوم للصدأ (1 سم × 1 سم أو 0.65 سم × 1 سم) أو أقراص شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ مع 2-isopropanol في شاكر (60 درجة مئوية، وسرعة 200 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق. تنفيذ هذه الخطوة 2 x. ثم غسل 2x مع الكلوروفورم (60 درجة مئوية، وسرعة 200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة لكل من.
  2. ضع عينات الفولاذ المقاوم للصدأ المطهرة في فرن على حرارة 220 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. إعداد 5 مل من 0.5٪ من حل PABT عن طريق حل 25 ملغ من البيسفوسفونات بوليولامين مع مجموعات ثيول كامنة (PABT) و 5 ملغ من بيكاربونات البوتاسيوم (KHCO3)في 5 مل من DDW واحتضان في 72 درجة مئوية في شاكر في 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: بالنسبة لـ PABT، تشير إلى المؤلفات المنشورةسابقاً 18.
  4. غمر رقائق المخبوزات أو أقراص شبكة في 0.5٪ محلول مائي من PABT واحتضان في شاكر (72 درجة مئوية، وسرعة 200 دورة في الدقيقة) لمدة 1 ساعة.
  5. اغسل العينات المعدلة من قبل PABT بالماء المقطر (DDW) لمدة 5x ، ونقل العينات في قارورة جديدة وغسلها مرة أخرى مع DDW لمدة 5x.
  6. إعداد ما مجموعه 5 مل من حل TCEP (12 ملغ / مل) عن طريق حل 60 ملغ من تريس (2-carboxyethyl) هيدروكلوريد فوسفين (TCEP) في 5 مل من 0.1 M العازلة الخليك (0.57 مل من حمض الخليك الجليدي، 820 ملغ من خلات الصوديوم في 100 مل من DDW).
  7. علاج العينات المعدلة PABT مع TCEP لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر.
    ملاحظة: TCEP يتم استخدام لإلغاء الحماية من المجموعات ثيول.
  8. ديغا DDW في قارورة أسفل مستديرة باستخدام جهاز توليد فراغ، مثل مزيل الزفيلي وغسل رقائق TCEP المعالجة أو أقراص شبكة مع ديغاوسيد DDW لمدة 5x. نقل العينات في قارورة جديدة، وبالإضافة إلى ذلك غسل 5x مع دي.دي.دبليو.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان العمل بسرعة لمنع أكسدة الثيول على السطح المعدني بواسطة الأكسجين في الغلاف الجوي.
  9. إعداد 5 مل من 1٪ PEI-PDT الحل عن طريق تخفيف 212.5 ميكرولتر من المخزون PEI-PDT و 125 ميكرولتر من 0.4 M خلات الصوديوم في ديغاوز دي دبليو. تنفيذ الخطوة 1-9 في وقت واحد مع الخطوة 1-8 لتقليل تعرض العينات إلى الهواء في الغلاف الجوي.
    ملاحظة: تم وصف تركيب PEI-PDT في المؤلفات المنشورة سابقا18.
  10. احتضان عينات الفولاذ المقاوم للصدأ غسلها مع 1٪ PEI-PDT. استبدال الهواء مع غاز الأرجون، وختم قوارير الهواء ضيق ومزيج على شاكر في RT لمدة 1 ساعة. إما المضي قدما على الفور مع اقتران الببتيد أو تخزين في 4 درجة مئوية تصل إلى 1 أسبوع.

2. التعلق والتقييم النوعي/الكمي للاحتفاظ بالفلوروهور pepCD47 على السطح المعدني باستخدام المجهر الفلوري والفلوري

  1. غسل رقائق كوبونات أو أقراص شبكة أعدت كما هو موضح في القسم 1، والخطوات 1.1-1.10 أعلاه مع DDW 5x. نقل العينات إلى قارورة جديدة وغسل مع DDW ل5x إضافية. أخيرا غسل 2x مع الإيثانول ديغازيد و 2x مع ديغاسيد ثنائي الفينيل (DMF).
  2. إعداد tetramethylrhodamine (TAMRA)-مترافق بيبCD47 حل الأسهم عن طريق حل TAMRA-مترافق بيبكد47 مسحوق في ثنائي الفينيل متعدد الأشكال ثنائي الغاز (DMF) إلى تركيز نهائي من 1 ملغم / مل. Aliquot حل الأسهم في تخصيصات 1 مل. تخزينها في أنابيب مختومة جيدا تحت الغلاف الجوي الأرجون في -20 درجة مئوية.
  3. تخفيف 1 ملغ / مل من محلول الأسهم من TAMRA-مترافق pepCD47 باستخدام DMF دي الغاز لإعداد التركيزات التالية من الفلوروفور pepCD47 - 10 و 30 و 100 و 200 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: إذا كان TAMRA-مترافق pepCD47 يبدو أن عجلت، والحد من الأسهم TAMRA-مترافق بيب 47 حل باستخدام الخرز TCEP في نسبة 1:1، في RT لمدة 20 دقيقة. لاحظ أنه قبل إضافة PEPCD47 TAMRA-مترافق إلى الخرز TCEP، تدور TCEP حبات الحل، وإزالة supernatant ومن ثم المضي قدما مع إضافة PEPCD47 TAMRA-مترافق.
  4. احتضان كوبونات احباط PEI-PDT المعدلة مع 10، 30، 100 أو 200 ميكروغرام / مل من PEPCD47 TAMRA-مترافق في ثلاث نسخ لكل حالة على شاكر في RT تحت الغلاف الجوي الأرجون لمدة 1 ساعة. احتضان بي آي - PDT تعديل أقراص الشبكة ، فضلا عن قرص شبكة لم يتم تعديلها وراء الخطوة 1.2 (ضوابط المعادن العارية) مع 100 ميكروغرام / مل من PEPCD47 TAMRA - مترافق في ثلاثية الاطليكات في RT تحت الغلاف الجوي الأرجون على شاكر لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يتم تغليف قارورة في رقائق الألومنيوم لحماية محتويات من الضوء.
  5. غسل السطوح المترافقة مع الفلوروفور pepCD47 المغلفة لإزالة الببتيد غير التكافؤ المرفقة بالترتيب التالي: DMF (3x)، DMF / DDW في 1:1، DDW (3x)، 0.3٪ SDS في 20 mM تريس درجة PH 7.4 (3x، 5 دقائق لكل من 70 درجة مئوية على شاكر)، DDW (3x)، تغيير قنينة، وغسل DDW النهائي.
  6. ضع التحكم والأقراص الشبكية المترافقة بشكل متكاوي على زجاج المجهر ، أضف 50 ميكرولتر من PBS ووضع غطاء. أقراص شبكة الصورة باستخدام مجهر الفلورانس المقلوب مجهزة مجموعة مرشح رودامين. التقاط صور تمثيلية في التكبير 100x.
  7. إعداد 15 مل من 12 ملغ / مل حل TCEP عن طريق حل 180 ملغ من TCEP في 1:1 v / الخامس خليط من الميثانول و 0.1 M العازلة الخليك.
  8. احتضان كل احباط غسلها مع 1 مل من حل TCEP على شاكر في RT لمدة 15 دقيقة.
  9. إعداد المعايير التالية عن طريق تخفيف تسلسلي للمخزون PEPCD47 TAMRA-مترافق (1 ملغ / مل) – 100 ميكروغرام / مل, 10 ميكروغرام / مل, 1 ميكروغرام / مل, 0.1 ميكروغرام / مل, و 0.01 ميكروغرام/مل. استخدم حل TCEP كمسيل.
  10. تحليل PEPCD47 TAMRA-مترافق أطلقت من السطح المعدني ضد منحنى المعايرة التي تم إنشاؤها باستخدام المعايير من قبل الفلوريتري في 544/590 نانومتر الإثارة والانبعاثات الطول الموجي.

3. إرفاق pepCD47 الإنسان إلى PEI-PDT السطوح المعدلة

  1. غسل العينات المغلفة PEI-PDT وضعت على النحو المبين في القسم 1، والخطوات 1.1-1.10 أعلاه، مع ديغاوست DDW 5x، وتغيير القارورة وغسل مع ديغاز دي دبليو 5x.
  2. إعداد حل الأسهم pepCD47 الإنسان (1 ملغ / مل) عن طريق حل مسحوق pepCD47 الإنسان في حمض الخليك degassed 50٪ لتحقيق تركيز 1 ملغ / مل.
  3. إعداد تركيز العمل من pepCD47 الإنسان (100 ميكروغرام / مل) عن طريق حل 500 ميكرولتر من مخزون pepCD47 الإنسان في 4500 ميكرولتر من degassed 1x الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
  4. احتضان العينات المغلفة PEI-PDT غسلها مع 100 ميكروغرام / مل من pepCD47 في RT مع اهتزاز لمدة 1 ساعة.
  5. غسل العينات pepCD47 الإنسان المغلفة لإزالة الببتيد الزائد في برنامج تلفزيوني النظام التالي (3x)، DDW (3x)، 0.2٪ توين-20 (3x، 5 دقائق لكل منها)، DDW (3x)، تغيير قنينات وغسل DDW النهائي.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأسطح المغلفة pepCD47 الإنسان الجافة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

4. طلاء الأسطح المعدلة PEI-PDT مع تسلسل مشوش (Scr)

  1. قم بحل مسحوق تسلسل مخفوق في حمض الخليك 0.1٪ لإعداد محلول مخزون من 1 ملغ / مل.
  2. إعداد حل من 100 ميكروغرام / مل من الببتيد المشوش عن طريق حل 500 ميكرولتر من في 4500 ميكرولتر من حمض الخليك 0.1٪ ديغاسيد.
  3. معطف العينات بي بي-PDT غسلها مع 100 ميكروغرام / مل من الببتيد المشوش في RT مع اهتزاز لمدة 1 ساعة.
  4. لإزالة الببتيد المشوش غير المُعَطَّق، اغسل الأسطح بالترتيب التالي 0.01% من حمض الخليك (3x)، DDW (3x)، 0.2% توين-20 (3x، 5 دقائق)، DDW (3x)، قارورة التغيير، وغسيل DDW واحد.

5. تشاندلر حلقة لتحليل المرفق الخلوية إلى الأسطح المعدنية

  1. معطف احباطات معدنية (0.65 سم × 1 سم) مع إما pepCD47 الإنسان أو الببتيد المشوش وفقا للوصف على القسم 1 متبوعا 3 أو 4.
  2. قطع 1/4 "أنابيب PVC إلى ثلاث قطع 38 سم طويلة.
  3. إدراج ما يصل إلى 8 غير معدلة، الببتيد المشوش أو pepCD47 رقائق معدنية معدلة في ثلاثة أنابيب مختلفة.
  4. جمع 30 مل من الدم من متبرعين صحيين بشرية خالية من أي الأدوية المضادة للصفائح الدموية وفقا لبروتوكول IRB المؤسسية. قبل تحميل حقنة مع 1 مل من 4٪ سيترات الصوديوم لمنع تخثر الدم الذي تم جمعه.
  5. وضع 10 مل من الدم في كل أنبوب باستخدام حقنة 10 مل وربط نهايات مع محولات معدنية. ضع الأنابيب المليئة بالدم على عجلات جهاز حلقة تشاندلر.
  6. تمرير الدم على طول رقائق معدنية بالتناوب عجلة في 37 درجة مئوية في السرعة المحسوبة لإنتاج القص من 25 dyns/cm2 ل 4 ح.
  7. استنزاف الدم من الأنابيب والتخلص من الدم وفقا لمتطلبات IRB.
  8. قطع الأنابيب باستخدام مشرط لاسترداد رقائق من كل أنبوب.
  9. إعداد 2٪ حل الجلوتارالديهيد عن طريق تخفيف 10 مل من 4٪ حل الجلوتارالدهيد باستخدام 10 مل من الصوديوم cacodylate العازلة مع 0.1 M كلوريد الصوديوم.
  10. احتضان رقائق في 2٪ حل جلوتارالدهيد لمدة 15 دقيقة وتخزينها في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قبل التحليل، وغسل احباطات معدنية 3X مع برنامج تلفزيوني.

6. تحليل المرفق الخلوية إلى الأسطح المعدنية باستخدام صبغة CFDA

  1. دافئ 8 مل من برنامج تلفزيوني في 15 مل أنبوب في حمام مائي تعيين إلى 37 درجة مئوية.
  2. إعداد CFDA (carboxy-fluorescein diacetate، succinimidyl استر) حل صبغ على النحو التالي - إضافة 90 ميكرولتر من DMSO إلى قارورة صبغ CFDA واحد لتحقيق تركيز المخزون من 10 mM. المقبل، وإعداد تركيز العمل من 93.75 μM عن طريق إضافة 75 ميكرولتر من CFDA الأسهم إلى 8 مل من برنامج تلفزيوني دافئ. مزيج عن طريق عكس الأنابيب عدة مرات وتغطية الأنبوب مع رقائق الألومنيوم.
    ملاحظة: من المستحسن إعداد صبغة CFDA حديثًا قبل كل استخدام.
  3. احتضان كل احباط مع 1 مل من صبغة CFDA في لوحة 24 جيدا. غطي الطبق بورق الألمنيوم ويحضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. غسل رقائق معدنية 3x مع برنامج تلفزيوني لإزالة صبغة الزائدة. صورة باستخدام المجهر المقلوب الفلوري.

7. أحادية الملحق وتوسيع الضامة على pepCD47- تعديل الأسطح المعدنية العارية

  1. جمع 10 مل من الدم المحيطي عن طريق الوصول فينا كافا خلال التضحية من 400-450 غرام ذكور Sprague-Dawley الفئران. تخلط على الفور مع 1000 وحدة دولية من الهيبارين الصوديوم لمنع التخثر.
  2. Pipette 10 مل من الكثافة المتوسطة التدرج في أنبوب مخروطي 50 مل. مزيج الدم مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، وطبقة بعناية المخفف الدم على المتوسط الانحدار الكثافة باستخدام ماصة باستور. أجهزة الطرد المركزي في الدوار دلو يتأرجح في 800 × ز و 18-25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع إعدادات الحد الأدنى من التسارع والتباطؤ.
  3. باستخدام ماصة باستور، وجمع طبقة مبهمة من معطف بافي على واجهة بين البلازما وفيكول. تمييع معطف بافي 1:3 مع برنامج تلفزيوني وطاردة مركزية في 550 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لخلايا معطف بافي.
  4. إعادة تعليق خلايا معطف بافي في 3 مل من ACK تحلل العازلة لlyse تلوث كريات الدم الحمراء. احتضان على الجليد لمدة 4 دقائق. إضافة 12 مل من العازلة فصل الخلية (CSB؛ 0.5٪ BSA، 0.5٪ FBS، 2 mM EDTA / PBS).
  5. جهاز طرد مركزي عند 550 x ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إعادة تعليق بيليه في 10 مل من CSB.
  6. جهاز طرد مركزي في 200 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للقضاء على الصفائح الدموية. كرر مرتين.
  7. إعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من CSB. إضافة 10 ميكروغرام من كل من الأجسام المضادة الجرذان الماوس التالية: CD8a (استنساخ OX-8)، مكافحة CD5 (استنساخ OX-19)، المضادة CD45RA (استنساخ OX-33)، ومكافحة CD6 (استنساخ OX-52).
  8. احتضان في 4 درجة مئوية على أنبوب دوار عمودي لمدة 1 ساعة. إضافة 9.5 مل من CSB. جهاز طرد مركزي عند 300 x ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل supernatant، إعادة تعليق بيليه في 10 مل من CSB وتكرار الطرد المركزي.
  9. إعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من CSB. أضف 150 ميكرولتر من ميكروبات IgG المضادة للماوس. احتضان في 4 درجة مئوية على أنبوب دوار عمودي لمدة 20 دقيقة. إضافة 9.5 مل من CSB. جهاز طرد مركزي عند 300 x ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  10. تجاهل المُندفع. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من CSB.
  11. ضع عمود LS في فاصل مغناطيسي.  رئيس العمود LS مع 3 مل من CSB. تجاهل سرعة نقل العمود. إضافة 1 مل من بيليه خلية إعادة تعليق من الخطوة 7.10. ابدأ في تجميع الإنتاجية. بعد توقف التدفق، إضافة 5 مل من CSB والحفاظ على جمع الإنتاجية العمود حتى توقف تدفق.
  12. الطرد المركزي الإنتاجية العمود (6 مل) التي تحتوي على monocytes مختارة بشكل سلبي في 300 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إعادة تعليق بيليه الصغيرة الناتجة في 2 مل من 1640 1640 10 متوسطة مكمّلة مع FCS 10٪ ، 1 ٪ من القلم / العقدية و 100 نانوغرام / مل الجرذان الضامة عامل تحفيز مستعمرة (M-CSF).
  13. عدّ الخلايا الأحادية باستخدام مقياس الدم. ضبط تركيز أحادية إلى 5 × 105 خلايا / مل.
  14. إضافة 1 مل مجلدات من تعليق monocyte إلى الآبار الفردية من 12 لوحة بئر مع عينات رقائق الفولاذ المقاوم للصدأ العارية (N = 3) أو عينات الفولاذ المقاوم للصدأ المعدلة مع الجرذان pepCD47 (N = 3) وفقا ل1.1-1.10 و 3.1-3.6.
  15. تغيير الوسيلة في أيام 3 و 5 بعد البذر. في اليوم 6 بعد البذر غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإصلاح مع 4٪ شبهformaldehyde في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. غسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  16. إزالة رقائق الفولاذ المقاوم للصدأ ووضعها بشكل فردي في لوحة جديدة 12 جيدا. لا تقلب الرقائق.
  17. احتضان في 0.5٪ Tween-20/PBS لمدة 15 دقيقة ل Permeabilize الخلايا. غسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  18. كتلة في مصل الماعز 10٪ / برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة. استلهم المصل لا تغسل. إضافة الماوس المضادة للجرذة CD68 الأجسام المضادة (المخفف 1:100 في 1٪ BSA / PBS). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. غسل 3x في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل من.
  19. إضافة الماعز المضادة للماوس IgG اليكسا فلور 546 (المخفف 1:200 في 1٪ BSA / PBS). احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. غسل في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. مضادة مع 1 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 صبغ في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. غسل 3x في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل من.
  20. اقلب الرقائق والصورة باستخدام مجهر فلوري مع البصريات المقلوبة. التقط الصور بتكبير 200x مع إعدادات التصفية الزرقاء والأحمرة.
  21. حساب أحادية المرفقة في الصور الفردية وحساب متوسطات المجموعة والانحرافات المعيارية.

النتائج

يتم تقديم الأسطح المعدنية thiol التفاعلية لمرفق الببتيد عن طريق سلسلة من التعديلات الكيميائية، كما هو موضح في الشكل 1. PABT حضانة تليها PEI-PDT العلاج يجعل سطح معدني قابل للتعلق الببتيد. وانضم ببتيد CD47 (pepCD47) التي تحتوي على بقايا السيستين في C-terminus إلى تسلسل pepCD47 الأساسية من خلال جسر ...

Discussion

نحن نبرهن ونصف استراتيجية كيميائية جديدة نسبيا لإلحاق مزيتات الببتيد العلاجية إلى سطح الفولاذ المقاوم للصدأ مع الهدف الشامل للحد من التفاعل السطح مع الخلايا الالتهابية الموجودة في الدم. وتشمل كيمياء البيسفوسفونات الموصوفة هنا تنسيق تكوين السندات بين أكاسيد المعادن ومجموعات البيسفوسفو...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم تطوير البروتوكول والدراسات المقدمة في هذه الورقة من قبل تمويل NIH (NBIB) R01 (# EB023921) إلى IF و SJS ، و NIH (NHLBI) R01 تمويل (# HL137762) إلى IF و RJL.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 M Tris-HCLInvitrogen15567-027pH - 7.5
4% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16539-07
4% Sodium CitrateSigmaS5770
ACK lysing bufferQuality Biologicals118-156-721
anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)Biolegend202301
anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)Biolegend203501
anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)BD Biosciences550979
anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)BioRadMCA341
anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)Biolegend201701
Chloroform Certified ACSFisher ChemicalC298-500
Dimethyl Formammide (DMF)Alfa Aesar39117
Embra stainless steel gridElectron Microscopy SciencesE200-SSstainless steel mesh mesh disks
Ficoll HypaqueGE Healthcare17-1440-02
Glacial acetic acidACROS organic148930025
goat anti-mouse IgG Alexa FluorThermoFisherA11030
Heparin sodiumSagent Pharmaceuticals402-01
Human pepCD47Bachem4099101
IsopropanolFisher ChemicalA426P-4
Metal adaptersLeur Fitting6515IND1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end
MethanolRICCA chemical company4829-32
MicroscopeNikon EclipseTE300
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco14190-136
Pottasium Bicarbonate (KHCO3)Fisher ChemicalP184-500
PVC tubesTerumo-CVS600501/4" X 1/16 8'
sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chlorideElectron Microscopy Sciences11653
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Bio-Rad laboratories161-0302
Sodum actetate (C2H3NaO2)Alfa AesarA13184
Src peptideBachem4092599
Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumenMicrogroup, Medway, MA200973281 cm X 6 mm OD
Stainless steel foils (AISI 316L)Goodfellow, Coraopolis, PA100 mm X 100 mm X 0.05 mm
Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)Bachem4100277
TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Thermo ScientificPG82089
Tween-20Bio-Rad laboratories170-6531
Vybrant CFDA SE Cell Tracer KitInvitrogenV12883

References

  1. Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
  2. van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, 392584 (2013).
  3. Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
  4. Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
  5. Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
  6. Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
  7. Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
  8. Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
  9. Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
  10. Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
  11. vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  12. Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
  13. Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
  14. Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
  15. Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
  16. Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
  17. Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
  18. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
  19. Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
  20. vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
  21. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
  22. Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
  23. Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
  24. Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

166 CD47

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved