تأخر التسليم داخل القلب للخلايا الجذعية بعد إصابة إعادة ضخ الإقفاري في نموذج مورين

Summary

يتم التحقيق في الخلايا الجذعية باستمرار كعلاجات محتملة للأفراد الذين يعانون من تلف عضلة القلب ، ومع ذلك ، يمكن أن يؤثر انخفاض قدرتها على البقاء والاحتفاظ داخل الأنسجة المصابة على فعاليتها على المدى الطويل. في هذه المخطوطة، نُصف طريقة بديلة لتوصيل الخلايا الجذعية في نموذج من اِصابة إعادة ضخ الإقفار.

Abstract

هناك اهتمام كبير في استخدام الخلايا الجذعية (SCs) لاستعادة وظيفة القلب في الأفراد الذين يعانون من إصابات عضلة القلب. الأكثر شيوعا، تتم دراسة العلاج بالخلايا الجذعية القلبية عن طريق تقديم SCs بالتزامن مع تحريض إصابة عضلة القلب. ومع ذلك، فإن هذا النهج يمثل قيدين هامين: قد تؤثر البيئة الإقفارية المعادية المبكرة للالتهابات على بقاء الـ SCs المزروعة، ولا تمثل سيناريو احتشاء تحت الحاد حيث من المرجح أن يتم استخدام SCs. هنا نحن وصف سلسلة من جزأين من العمليات الجراحية لاستقراء إصابة الإقفاريات reperfusion والولادة من الخلايا الجذعية mesenchymal (MSCs). قد تسمح هذه الطريقة من إدارة الخلايا الجذعية لقابلية البقاء الأطول والاستبقاء حول الأنسجة التالفة من خلال التحايل على الاستجابة المناعية الأولية. تم حث نموذج من إصابة إعادة ضخ الإقفاري في الفئران يرافقها تسليم الخلايا الجذعية mesenchymal (3.0 × 10⁵) ، والتعبير بشكل ثابت عن المراسل الجيني firefly luciferase تحت المروج CMV أعرب عن المكونة ، داخل الرحمية 7 أيام في وقت لاحق. تم تصوير الحيوانات عن طريق الموجات فوق الصوتية والتصوير بالإنارة الحيوية لتأكيد الإصابة وحقن الخلايا ، على التوالي. الأهم من ذلك، لم يكن هناك أي معدل مضاعفات إضافية عند تنفيذ هذا النهج الإجراءين للتسليم SC. هذه الطريقة من إدارة الخلايا الجذعية، مجتمعة مع استخدام الدولة من بين أحدث الجينات مراسل، قد تسمح لدراسة في الجسم الحي من صلاحية والاحتفاظ SCs زرع في حالة من نقص التروية المزمنة ينظر عادة سريريا، في حين يتحايل أيضا على الاستجابة الأولية الموالية للالتهابات. باختصار، وضعنا بروتوكولاً لتأخر وصول الخلايا الجذعية إلى عضلة القلب، والذي يمكن استخدامه كنهج جديد محتمل في تعزيز تجديد الأنسجة التالفة.

Introduction

ولا تزال أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الأكثر شيوعاً في معدلات الاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم. وقد وجد أن الأحداث الإقفاري القلبية الضارة إلى الوظيفة العامة للقلب والخلايا المحيطة¹. فقط ̴0.45-1.0% من عضلة القلب سوف تتجدد كل عام بعد حدوث تلف عضلة القلب². على الرغم من الطلب المتزايد والتركيز المتأصل على تطوير العلاجات، العلاجات المساعدة في تجديد الأنسجة المصابة كان من الصعب إنشاء ولا تزال تتطلب المزيد من التحسين^3,4,5. وقد أدخلت علاجات الخلايا الجذعية كمسار بديل لتجديد الأنسجة التالفة بعد حدوث حدث نقص التروية; ومع ذلك، تم الطعن في تقدم هذه العلاجات من خلال البقاء على قيد الحياة والاحتفاظ بالخلايا إلى منطقة المصابة⁶.

يمكن وصف البيئة الدقيقة للقلب بعد حدوث نقص في التروية بأنه نقص في الأكسجة، ومناصر للأكسدة، ومناصر للالتهابات، وتقديم ظروف عدائية للخلايا الجذعية العلاجية للتكيف مع البقاء على قيد الحياة^7،8. كما يتم تشغيل استجابة مناعية بعد الإصابة، اللمفاويات الساذجة، الضامة، العدلات والخلايا الصاري محاولة لإصلاح الضرر عن طريق إزالة الخلايا المحتضرة والتضمين عملية لإعادة عرض الأنسجة^9،10،11. في غضون الأيام 3 الأولى بعد نقص التروية، والتهاب في ذروته مع الافراج عن السيتوكينات الموالية للالتهابات مع أعداد كبيرة من العدلات ومحاديات في المنطقة^10،12. بعد 7 أيام، وقد هدأت الكثير من الالتهاب والانتقال إلى الخلايا التعويضية يبدأ، والاستمرار حتى اكتمال سلسلة إعادة عرض، ما يقرب من 14 يوما في الفئران¹³. طريقتنا الجراحية هي نهج بديل محتمل لإدخال البيولوجيات في عضلة القلب لتجاوز ذروة الاستجابة المناعية الفطرية بعد إصابة إعادة حقن الإقفاري. وفي الوقت نفسه، فإنه سيسمح لدراسة أي علاجات في حالة نقص التروية/نقص التروية المزمن حيث قد يكون هناك متغيرات مختلفة للنظر بالمقارنة مع احتشاء عضلة القلب الحاد.

Protocol

وأجريت التجارب على فئران أنثى C57BL/6، وعمرها 10-12 أسبوعاً، و20-25 غرام من وزن الجسم. امتثلت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوان للمعايير الواردة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (معهد الثروة الحيوانية المختبرية، الأكاديمية الوطنية للعلوم، بيثيسدا، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) وتمت الموافقة عليها من قبل كلية الطب في Mayo Clinic (مايو كلينك) لجنة الرعاية الطبية الحيوانية المؤسسية (IACUC).

1. التحضير والنوبات

1. أوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل الجراحة. إذا كانت العمليات الجراحية المتعددة التي يتعين إجراؤها في جلسة واحدة، تنظيف الأدوات بعد كل وإعادة تعقيم باستخدام معقمة حبة ساخنة.
2. تخدير الفئران مع 3.5-4٪ isoflurane في 1 L / min O₂ في غرفة التعريفي.
3. إدارة Buprenorphine SR 1 ملغ / كغ (مسكن) تحت الجلد، وزن الحيوان، وإدخال الوزن في جهاز التنفس الصناعي.
4. يحلق الجانب الأيسر من الصدر من القص إلى مستوى الكتف وتطبيق كريم إزالة الشعر لإزالة الفراء الزائد.
5. بالنسبة لإجراء إعادة ضخ الإقفاري بـ ISCHEMIA، حافظ على الضغط الموجب لنهاية الإنهاء (PEEP) على جهاز التنفس الصناعي عند 2 سمH₂O. للحقن المتأخر من إجراء الخلايا تغيير دعوى إلى 3 سمH₂O لمنع انهيار الرئة.
6. Intubate الحيوان باستخدام أنبوب endotracheal 20 غ، ونقل إلى وسادة التدفئة التي تسيطر عليها للحفاظ على درجة حرارة الجسم من 35-37 درجة مئوية.
7. ضع الماوس على جهاز التنفس الصناعي في إعادة شغل الطرف الجانبي مع نهاية الجمجمة على اليسار ونهاية الcaudal على اليمين.
8. الحفاظ على التخدير في 2-2.5٪ ايزوفلوران في 1 L / دقيقة O₂ لبقية العملية.
9. فرك منطقة جراحية بالتناوب بين بوديوني اليود والكحول مسحات ثلاث مرات وتطبيق مرهم العيون على كلتا العينين.

2. إصابة الإستريميا reperfusion

1. باستخدام مشرط #10 شفرة جعل شق عمودي 2.5 مم إلى يمين الحلمة في أقصى اليسار في مجال الرؤية.
2. باستخدام مقص قطع من خلال طبقات العضلات السطحية حتى العضلات الوربية والضلوع مرئية.
3. أثناء رفع الأضلاع والأنسجة المحيطة ، تقطع من خلال الفضاء الوربي بين الأضلاع الرابعة والضلع الخامس ، ثم أدخل مُعَاو الجفن في المساحة المفتوحة.
4. سحب الميوارديوم باستخدام ملقط منحني، تحريك الرئة صعودا والخروج من العرض.
5. تصور الشريان LAD و, باستخدام خياطة النايلون 9-0, تمر من خلال عضلة القلب تحت الشريان 2.5 مم من بعد إلى auricle اليسار وربط عقدة مربعة فضفاضة.
6. قطع 1 سم من أنابيب البولي إيثيلين ووضعها داخل عقدة فضفاضة.
7. تأمين خياطة حول أنابيب، تأكيد نقص التروية، ثم الافراج بعد 35 دقيقة.
   ملاحظة: تأكيد نقص التروية عن طريق شحوب وعدم انتظام ضربات القلب البطيني.
8. بعد الإفراج عن الربط وإزالة الأنابيب، انتظر لمدة 5 دقائق لتأكيد إعادة ضخ عضلة القلب.
9. ضع أنبوب قسطرة 24 G I.V. في تجويف الصدر مسافة واحدة بينية إلى يمين الفتحة.
10. أغلق الشق الوربي مع خياطة قابلة للامتصاص 6-0 في نمط متقطع بسيط.
11. أغلق طبقة العضلات مع خياطة قابلة للامتصاص 6-0 في نمط خياطة مستمر.
12. بعد إغلاق طبقة العضلات السطحية، وإزالة أنبوب الصدر في حين سحب الهواء من تجويف الصدر باستخدام حقنة 1 مل درنة درنة.
13. إغلاق شق الجلد مع خياطة 6-0 absorbable في نمط فراش أفقي مستمر
    ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام خياطة النايلون ونمط خياطة متقطع لطبقة الجلد.
14. إدارة 1.5 مل من الحارة المالحة تحت الجلد وتطبيق مرهم ثلاثي المضادات الحيوية على موقع شق لمنع العدوى.
15. إيقاف ايزوفلوران والسماح للحيوان بالتنفس من خلال جهاز التنفس الصناعي على 100٪ O₂ حتى يتمكن من التنفس بشكل مستمر دون مساعدة.
16. نقل الماوس إلى قفص الفراش خالية من الفراش أو قفص مع الفراش المغطاة (منشفة ورقية أو الستائر) على وسادة دافئة مع درجة حرارة 35-37 درجة مئوية حتى تعافى تماما.

3. ماوس mesenchymal تسليم الخلايا الجذعية

ملاحظة: سلالة الفئران المستخدمة في هذا الإجراء هي خط أصيل وتعتبر متطابقة وراثيا. تم الحصول على الخلايا الجذعية mesenchymal من الحيوانات من نفس السلالة، وعن طريق تصميم البروتوكول، لم يتم تحريض كبت المناعة¹.

1. أكمل خطوات التحضير والنوبات كما تم من قبل لإجراء أول.
2. إزالة خياطة من طبقة الجلد باستخدام مقص والملقط.
3. مع مشرط #10، قم بعمل شق في نفس مكان الجراحة السابقة.
4. الاستمرار في استخدام مشرط لقطع من خلال ندبا حتى خياطة طبقة العضلات مرئية
5. باستخدام مقص والملقط إزالة خياطة وقطع طبقة العضلات مفتوحة.
6. تصور وإزالة الغرز عقد الأضلاع معا ومواصلة قطع من خلال العضلات الوربية من شق السابقة.
   ملاحظة: قد تكون الرئتين قد التزمت بجدار الصدر، إذا حدث ذلك، استخدم ملقطًا حادًا أو منحنيًا لفصلها بعناية وإطلاقها.
7. ضع مُناسِّر الجفن في الفضاء الوربي وحدد مكان منطقة الربط السابق.
8. تحميل الخلايا الجذعية mesenchymal (3.0 × 10⁵) ، علقت في 20 ميكرولتر PBS ، في حقنة الأنسولين 30 G ، ثني الإبرة قليلا حسب الحاجة للزاوية المناسبة لحقن.
   ملاحظة: تم عزل الخلايا الجذعية الماسية (MSCs) من الأنسجة الدهنية للفئران C56BL/6 التي يبلغ عمرها 4-6 أسابيع. تم نقل خلايا المرور المبكر (p3) مع ناقل يعبر عن جين اليراعات luciferase تحت المروج CMV للسماح في مراقبة صلاحية الخلية الحية. وقد تميزت الدهنية مشتقة الماوس MSC من تدفق القياسات الخلية وكانت الخلايا إيجابية لD44، CD29، CD90 وD105 ولكن سلبية لعلامة الدم CD45¹⁴. قبل الحقن، كانت MSCs مثقفة لممر واحد على الأقل لتجنب فقدان الخلايا من عملية الذوبان.
9. تتحرك في الاتجاه من القمة نحو قاعدة القلب إدراج الحقنة في المنطقة ما حولها حتى فتح إبرة تماما داخل عضلة القلب.
10. مرة واحدة داخل حقن ببطء الخلايا في عضلة القلب، والانتظار 3 s، ثم إزالة الإبرة.
11. مراقبة القلب عن كثب لمدة 3 دقائق للتأكد من عدم وجود ردود فعل غير طبيعية للخلايا مثل الرجفان البطيني.
12. ضع أنبوب قسطرة 24 G IV في تجويف الصدر مسافة نتركوسية واحدة إلى يمين الفتحة.
13. أغلق الطبقات الوربية والعضلات والجلد وأزل أنبوب الصدر بنفس طريقة الإجراء الأول.
14. إدارة 1.5 مل من الحارة المالحة تحت الجلد وتطبيق مرهم ثلاثي المضادات الحيوية على موقع شق لمنع العدوى.
15. إيقاف ايزوفلوران والسماح للحيوانات للتنفس من خلال جهاز التنفس الصناعي على 100٪ O₂ حتى يتمكن من التنفس بشكل مستمر دون مساعدة.
16. نقل الماوس إلى قفص الفراش خالية من الفراش أو قفص مع الفراش المغطاة (منشفة ورقية أو الستائر) على وسادة دافئة مع درجة حرارة 35-37 درجة مئوية حتى تعافى تماما.

4- الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية باتباع كلا الإجراءين

1. مراقبة الحيوان بشكل مستمر حتى يتم تأسيس التنفس العفوي، و إعادة شغل القص والحركة الطبيعية.
2. مواصلة الملاحظة كل 15-30 دقيقة لمدة 3 ساعات على الأقل في يوم الجراحة.
3. تحقق من الفئران للتأكد من عدم الوهن أو الألم غير الطبيعي مرة واحدة يوميًا لمدة 5 أيام ، ثم مرتين إلى 3 مرات أسبوعيًا.
4. إذا كان الحيوان يظهر علامات الألم (أي تقوس الظهر، والحد الأدنى من الحركة، grimacing، أو الفراء scruffy) بعد 72 ساعة بعد العملية، وتوفير جرعة إضافية من Buprenorphine ريال مسكن.

النتائج

تم تحريض إصابة إعادة ضخ الإسترشيا في الفئران في اليوم 0 ، تليها مخطط صدى القلب بعد الجراحة وتخطيط كهربية القلب في اليوم السابق لزرع الخلايا الجذعية. وأكد الموجات فوق الصوتية وتحليل تخطيط القلب احتشاء وانخفاض وظيفة الانقباض البطين(الشكل 1A-D). وتبين من مواصلة فحص الب...

Discussion

أكثر من 85 مليون شخص في جميع أنحاء العالم يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية³. ارتفاع انتشار هذه الأحداث الإقفارية يبرر المزيد من التطوير والتوسع في العلاجات البديلة لتعزيز تجديد الأنسجة التالفة. تستخدم الطرق التقليدية إجراء إعادة ضخ الإقفار الإقفاري في بيئة حادة مع الإد?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl Irrigation, USP	Baxter	0338-0048-04
11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable	SAI Infusion Technologies	PSS-SD
24G 3/4" IV catheter tube	Jelco	4053
28G x 1/2" 1mL allergy syringe	BD	305500	Injection of analgesic
30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe	Ulticare	08222.0933.56	Injection of stem cells
6-0 S-29, 12" Vicryl suture	Ethicon	J556G	Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure
9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture	Ethicon	2829G	Ligation of the LAD artery
Absorbent underpad	Thermo Fischer Scientific	14-206-64	For underneath the animal
Alcohol prep pads, 2 ply, medium	Coviden	6818
Anti-fog face mask	Halyard	49235
Bonn Strabismus scissors, curved, blunt	Fine Science Tools	14085-09
Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity).
Castroviejo needle holders, curved	Fine Science Tools	12061-01
Curity sterile gauze sponges	Coviden	397310
Delicate suture tying forceps, 45 angle bent	Fine Science Tools	11063-07
Electric Razor	Wahl		Fur removal
Isoflurane 100 ml	Cardinal Health	PI23238	Anesthetic
Lab coat
Monoject 1 mL hypodermic syringe	Coviden	8881501400
Moria iris forceps, curved, serrated (x2)	Fine Science Tools	11370-31
Moria speculum retractor	Fine Science Tools	17370-53
Mouse endotracheal intubation kit	Kent Scientific
Nair depilatory cream	Johnson & Johnson		Fur removal
Optixcare eye lube plus	Aventix		Sterile ocular lubricant
Physiosuite ventilator	Kent Scientific
PolyE Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	72-0191	Temporary compression of LAD artery
Povidone-iodine swabs	PDI	S41125
Scalpel, 10-blade	Bard-Parker	371610
Sterile 3" cotton tipped applicators	Cardinal Health	C15055-003
Sterile 6" tapered cotton tip applicators	Puritan	25-826-5WC
Sterile gloves	Cardinal Health	N8830
Sterilization pouches	Medline	MPP100525GS
Surgery cap
Surgical Microscope	Leica	M125
Suture tying forceps, straight (x2)	Fine Science Tools	10825-10
Transpore surgical tape	3M	1527-1
Triple antibiotic ointment	G&W Laboratories	11-2683ILNC2	Topical application to prevent infection
Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved	Fine Science Tools	15004-08
Vetflo vaporizer	Kent Scientific