JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا البروتوكول ، تم وصف طريقة للتنقيب الجيني وتحليل تسلسل نيوكليوزيداز البيورين (PN ، EC: 3.2.2.1) بناء على RNA-Seq. تم تطبيق تحليل ProtProm لإظهار الهياكل الثانوية والثالثية الفريدة ل PN. علاوة على ذلك ، تم استنساخ جين PN من النسخ للتحقق من موثوقية نتائج RNA-Seq.

Abstract

فطر كاتربيلر (Ophiocordyceps sinensis) هو أحد أكثر الفطريات قيمة في الطب الصيني التقليدي (الطب الصيني التقليدي) ، ويحتوي على الكثير من المكونات النشطة مثل الأدينوزين. يعتبر الأدينوزين مكونا فعالا بيولوجيا يحتوي على مجموعة متنوعة من الأنشطة المضادة للورم والمناعة. من أجل توضيح آلية نيوكليوزيداز البيورين (PN) في التخليق الحيوي للأدينوزين ، تم استخراج جين يشفر PN بنجاح وتحليله بشكل أكبر بناء على قاعدة بيانات RNA-Seq لفطر اليرقة. كان (كدنا) كامل الطول ل PN 855 نقطة أساس ، والذي قام بترميز 284 من الأحماض الأمينية. أظهر تحليل BLAST أعلى تماثل بنسبة 85.06٪ مع هيدرولاز النيوكليوزيد في NCBI. أظهر تحليل ProtProm أن الوزن الجزيئي النسبي كان 30.69 كيلو دالتون والنقطة المتساوية الكهربية كانت 11.55. تم التنبؤ بالهيكل الثانوي ل PN بواسطة Predict Protein. أظهرت النتائج أن هيكل ألفا الحلزون يمثل 28.17٪، وهيكل الخيط 11.97٪، وهيكل الحلقة يمثل 59.86٪. علاوة على ذلك ، تم استنساخ جين PN بشكل أكبر من النسخ واكتشافه بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز للتحقق. توفر هذه الدراسة أساسا علميا أكثر كفاية وأفكارا جديدة للتنظيم الجيني للتخليق الحيوي للأدينوزين في الطب الصيني التقليدي الفطري.

Introduction

يحتوي الطب الصيني التقليدي الفطري (TCM) على موارد وفيرة من الأنواع1،2. فطر كاتربيلر (Ophiocordyceps sinensis) هو فطر معروف للطب الصيني التقليدي ويعتبر مصدرا للأدوية المبتكرة3،4. فطر كاتربيلر هو خليط مشترك من الدودة والفطريات يوجد في هضبة التبت في جنوب غرب الصين ، حيث يعتبر Hirsutella sinensis طفيليا على جسم اليرقة5. حاليا ، تم الإبلاغ عن H. sinensis باعتباره التباين الوحيد لفطر اليرقة وفقا لأدلة البيولوجيا الجزيئية والمورفولوجية6،7 ، وله سمية أقل ارتباطا وفعالية سريرية مماثلة مقارنة بفطر اليرقةالبرية 8. تم الكشف عن أن H. sinensis يمتلك مجموعة متنوعة من المكونات الفعالة بيولوجيا ، مثل النيوكليوسيدات والسكريات والإرغوستيرول ، مع تأثيرات دوائية واسعة النطاق مثل إصلاح إصابة الكبد9،10،11. الأدينوزين هو عنصر نشط نموذجي معزول عن فطر اليرقة ، وهو نوع من قلويد البيورين12. يحتوي الأدينوزين على مجموعة متنوعة من الأنشطة البيولوجية: الأنشطة المضادة للورم والبكتيريا والمناعية13،14. لسوء الحظ ، لا تزال آلية التخليق الحيوي للأدينوزين وكذلك الجينات الرئيسية المعنية غير واضحة15،16.

يظهر الأدينوزين بشكل أساسي تأثيره المضاد للورم من خلال الإجراءات المثبطة للمناعة في البيئة المكروية للورم17. أفيد أن الأدينوزين أظهر وظائف مثبطة للمناعة ، وهو أمر بالغ الأهمية لبدء إصلاح الأنسجة بعد الإصابة وحماية الأنسجة من الالتهاب المفرط18،19. علاوة على ذلك ، ثبت أن قمع المناعة بوساطة الأدينوزين يمكن أن يضعف بشدة المراقبة المناعية للسرطان بالإضافة إلى تعزيز نموالورم 20. وبالتالي ، من الضروري دراسة آلية التخليق الحيوي للأدينوزين لتطبيقه على نطاق واسع في مكافحة الورم.

تم الإبلاغ عن أنه يمكن إجراء عرض كامل للجينات المعبر عنها ومستويات التعبير عنها بشكل منهجي عن طريق تسلسل الجيل التالي من النسخ21. علاوة على ذلك ، تم تطبيق تسلسل النسخ وتحليلها للتنبؤ بالجينات المشاركة في مسار التخليق الحيوي للمكونات النشطة ، وإجراء مزيد من التحقيق في تفاعل مسارات التخليق الحيوي المختلفة22. نيوكليوزيداز البيورين (PN ، EC 3.2.2.1) هي فئة من النوكليوزيداز مع خصوصية الركيزة لنيوكليوسيدات البيورين ، والتي يمكنها تحلل روابط الجليكوزيدات من نيوكليوسيدات البيورين إلى سكريات وقواعد23. عادة ما يلعب أدوارا مهمة في التخليق الحيوي الأدينوسين. وأفيد أن مسار التخليق الحيوي للأدينوزين في الطب الصيني التقليدي الفطري قد توقع; أظهر qPCR والتعبير الجيني أن تراكم الأدينوزين المتزايد هو نتيجة لانخفاض تنظيم جين PN ، مما يشير إلى أن جين PN قد يلعب دورا مهما في التخليق الحيوي للأدينوزين15. لذلك ، يجب توضيح آلية PN في التخليق الحيوي للأدينوزين على وجه السرعة. ومع ذلك ، لم يتم مزيد من دراسة معلومات التسلسل وبنية البروتين ل PN بالإضافة إلى الجينات الرئيسية الأخرى المشاركة في التخليق الحيوي للأدينوزين للطب الصيني التقليدي الفطري.

في هذه الدراسة ، تم استخراج تسلسل جديد لجين PN من بيانات RNA-Seq لفطر اليرقة وتم التحقق منه عن طريق استنساخ الجينات. علاوة على ذلك ، تم تحليل الخصائص الجزيئية وبنية البروتين ل PN بشكل شامل ، والتي يمكن أن توفر توجيهات وأفكارا جديدة لتنظيم الجينات للتخليق الحيوي للأدينوزين.

Protocol

ملاحظة: تم ترسيب سلالة من التباين من فطر اليرقة (H. sinensis) في مختبرنا. الإشريكية القولونية تم الحفاظ على DH5 بواسطة مستشفى شنتشن ، جامعة بكين للطب الصيني.

1. التحضير ل RNA-Seq

  1. حصاد الفطريات
    1. تحضير وسط التخمير لتخمير H. sinensis: مسحوق دقيق الذرة (1٪) ، شرانق دودة القز (1.5٪) ، مستخلص الخميرة (0.5٪) ، التربتون (1٪) ، الجلوكوز (1.5٪) ، النخالة (1.5٪) ، الدكسترين (0.5٪) ، KH2PO4 (0.02٪) و MgSO4 (0.01٪).
    2. تحضير التلقيح بواسطة وسط تخمير بنسبة 10٪ للزراعة الواسعة (أضف 10 مل وسط لكل 100 مل وسط). قم بإجراء التخمير المغمور بحالة 16 درجة مئوية على شاكر دوار عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 10 أيام.
    3. تتكاثر وتحصد فطريات اللاجنسية من شفرة فطر اليرقة لمدة 10 أيام. جهاز الطرد المركزي الوسط المخمر وتخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي. قم بتعليق الفطريات بإضافة 100 مل من الماء فائق النقاء لمدة 3 مرات وإزالة المادة الطافية عن طريق الطرد المركزي. اطحن الفطريات النظيفة إلى مسحوق باستخدام النيتروجين السائل.
  2. الحمض النووي الريبي Seq
    1. استخرج الحمض النووي الريبي الكلي لشفرة فطر اليرقة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة (جدول المواد) وقم بمعالجة العينة باستخدام DNase I الخالي من RNase (جدول المواد).
    2. عزل mRNA عن أنظمة عزل الحمض النووي الريبي PolyATtract mRNA الكلية ، وعزل poly (A) mRNA باستخدام حبات مع oligo (dT) وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة (جدول المواد).
    3. خذ الأجزاء القصيرة كقوالب لتجميع (كدنا) لأول حبلا بواسطة بادئات سداسية عشوائية وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة (جدول المواد). قم بإجراء تخليق (كدنا) الثاني وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
    4. بعد ذلك ، قم بإنشاء مكتبات التسلسل باستخدام مجموعة إعداد مكتبة Ultra RNA وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة (جدول المواد).
    5. قم بتنقية الأجزاء القصيرة بواسطة مجموعة استخراج PCR وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة (جدول المواد) وحلها بواسطة مخزن EB المؤقت ، على التوالي.
    6. قم بتوصيل الأجزاء القصيرة (عتبة 300 نقطة أساس) بمحولات التسلسل وفقا لنتيجة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
    7. بعد ذلك ، قم بإجراء التضخيم باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام القوالب المختارة من الأجزاء المناسبة.
    8. تسلسل المكتبة بواسطة Illumina HiSeq 4000 مع تسلسل مزدوج وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. قم بتصفية القراءات الأولية المتسخة من بيانات التسلسل الأولية للحصول على بيانات نظيفة. اعتمد تجميع denovo للحصول على Unigenes بأقل N لا يمكن تمديدها على أي من الطرفين.
    9. قم بمحاذاة تسلسلات Unigene بواسطة blastx مع قواعد بيانات البروتين مثل nr و Swiss-Prot و KEGG و COG (القيمة الإلكترونية < 0.00001). استرجع البروتينات ذات أعلى تشابه في التسلسل مع Unigenes المعطاة جنبا إلى جنب مع التعليقات التوضيحية الوظيفية للبروتين. لخص نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي (جدول المواد).
      ملاحظة: تم استخدام المجموعات التجارية في الخطوات المذكورة أعلاه ، وتم إجراء جميع العمليات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

2. التعدين الجيني للبيورين نوكليوزيداز

  1. قم بتنزيل ملفات نتائج RNA-Seq على الكمبيوتر. ابحث عن ملفات نتائج التعليقات التوضيحية ل Unigenes المجمعة من نتائج RNA-Seq.
    ملاحظة: تم استخدام قراءات الطرف المزدوج مرة أخرى لملء الفجوات في السقالات للحصول على تسلسلات بأقل Ns لا يمكن تمديدها على أي من الطرفين. تم تعريف هذه التسلسلات على أنها Unigenes. يوفر التعليق التوضيحي Unigene معلومات عن التعبير والتعليق التوضيحي الوظيفي ل Unigene.
  2. افتح مسار ملفات التعليقات التوضيحية وأدخل الخريطة 00230 في شريط البحث ؛ ثم ابحث عن استقلاب البيورين (MAP00230) في تصنيف KEGG لملفات التعليقات التوضيحية.
  3. ضع علامة EC: 3.2.2.1 (PN) باللون الأحمر في الخريطة المشروحة 00230 وتشير إلى وجود Unigenes مجمعة تم شرحها إلى PN.
    ملاحظة: كان هناك ثلاثة Unigenes (Unigene10777 و Unigene14697 و Unigene17827) مشروحة إلى PN بعد النقر فوق رقم EC 3.2.2.1 وتظهر في الخريطة المشروحة 00230.
  4. انقر فوق رقم EC 3.2.2.1 واعرض معلومات Unigenes المشروحة.
  5. افتح برنامج LTFViewer واستورد ملف Unigene.fa باستخدام اختصار Ctrl-O واعرض معلومات تسلسل Unigenes المجمعة.
  6. ابحث عن معلومات تسلسل Unigene10777 و Unigene14697 و Unigene17827 باستخدام اختصار Ctrl-F .
  7. قم بتنزيل معلومات التسلسل الخاصة ب Unigene10777 و Unigene14697 و Unigene17827 باستخدام اختصارات Ctrl-C و Ctrl-V.
  8. تخلص من Unigene10777 و Unigene17827 بتسلسلات قصيرة للغاية من إطار القراءة المفتوح (ORF).
    ملاحظة: تم عرض معلومات التسلسل الأساسية في برنامج LTFViewer.
  9. حدد Unigene14697 (حجم 1,705 نقطة أساس ، فجوة 0 0٪) مع طول مناسب من ORF لمزيد من الدراسة.

3. تحليل المعلوماتية الحيوية

  1. تحليل ORF لجين PN بواسطة ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/).
    1. الصق التسلسل في المربع. اختر المعلمات على النحو التالي ، الحد الأدنى لطول ORF (nt): 75 ، الشفرة الجينية: 1. قياسي ، كودون بدء ORF للاستخدام: ATG فقط. انقر فوق الزر "إرسال" للحصول على معلومات ORF.
  2. استخدم أداة ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html) لحساب الكتلة الجزيئية النظرية والنقطة متساوية الكهرب.
    1. الصق تسلسل الأحماض الأمينية (في رمز مكون من حرف واحد) في المربع وانقر فوق الزر " حساب المعلمات " للحصول على النتائج.
  3. قم بتطبيق خادم SignalP5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) للتنبؤ بببتيدات الإشارة.
    1. أدخل تسلسلات البروتين بتنسيق FASTA. اختر المعلمات على النحو التالي ، مجموعة الكائنات الحية: حقيقيات النوى ، تنسيق الإخراج: إخراج طويل. انقر فوق الزر "إرسال " للحصول على النتائج.
  4. تطبيق BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) لتحليل تماثل تسلسل البروتين.
    1. انقر فوق الزر "انفجار البروتين" وأدخل التسلسل في المربع. اختر المعلمات على النحو التالي ، قاعدة البيانات: تسلسل البروتين غير الزائد (nr) ، الخوارزمية: blastp (بروتين بروتين BLAST). انقر فوق الزر "انفجار" للحصول على النتائج.
  5. قم بتطبيق برنامج Clustal X (http://www.clustal.org/) لمحاذاة التسلسلات الحمضية ل PN من الفطريات المختلفة.
    1. قم بتحميل ملف أو الصق التسلسلات في المربع. قم بتعيين المعلمات على النحو التالي ، تنسيق الإخراج: ClustalW مع عدد الأحرف. انقر فوق الزر "إرسال " للحصول على النتائج. يمكن ل Clustal X التعرف فقط على الملفات بتنسيق FASTA ، ويمكن أن يتضمن مسار الملفات أسماء إنجليزية فقط.
  6. استخدم MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/) لإجراء شجرة النشوء والتطور.
    1. افتح البرنامج وانقر فوق ملف زر لتحميل التسلسلات. حدد نوع البيانات ك تسلسلات البروتين ، وانقر فوق الزر "موافق " للمتابعة إلى الخطوة التالية. بعد ذلك ، انقر فوق الزر Phylogeny وحدد Bootstrap Test Phylogeny ، ثم انقر فوق Neighbor Join Tree. حدد المعلمات الافتراضية وانقر فوق الزر "حساب " للحصول على النتائج.
  7. قم بتطبيق InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/) لتحديد المجال التحفيزي ل PN.
    1. أدخل التسلسل في المربع. حدد المعلمات الافتراضية وانقر فوق الزر "بحث " للحصول على النتائج.
  8. قم بتطبيق Predict Protein (http://www.predictprotein.org/) عبر الإنترنت للتنبؤ بالهيكل الثانوي للبروتين.
    1. أدخل تسلسل حمض أميني (رمز حرف واحد) في المربع ، ثم انقر فوق الزر predictProtein للحصول على النتائج.
  9. تطبيق الأدوات عبر الإنترنت SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) لتقييم الهيكل ثلاثي الأبعاد ل PN24.
    1. انقر فوق الزر "بدء النمذجة" والصق التسلسل المستهدف في المربع. املأ عنوان المشروع ومعلومات البريد الإلكتروني وانقر على زر البحث عن القوالب للحصول على النتائج.

4. استنساخ الجينات وبناء البلازميد المؤتلف

  1. تصميم بادئات التصميم التي احتوى التمهيدي العكسي الخاص بها على موقع NotI وكان التمهيدي الأمامي يحتوي على موقع EcoRI.
  2. أظهر التمهيدي الأمامي على النحو التالي: AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'-3') ، والتمهيدي العكسي على النحو التالي: ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'-3') بواسطة Primer Express.
  3. تحضير البادئات وكذلك (كدنا) لفطريات اليرقة لاستنساخ جين PN . قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: التمسخ المسبق عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، والتمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، وإعادة التشكيل عند 55 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، والتكرار لمدة 35 دورة ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. الحصول على شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل واكتشافها عن طريق الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز للتحقق. قم بربط شظايا PCR باستخدام pMD18-T. إجراء نظام ربط PMD18-T على النحو التالي: 1 ميكرولتر PMD18-T ، 4 ميكرولتر محلول 1 ، و 5 ميكرولتر جين مستهدف. اضبط الشروط على النحو التالي: الحفاظ على 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ، والتعطيل عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  5. انقل البلازميدات المؤتلفة إلى بكتريا قولونية المختصة خلايا JM109 وفقا لدليل التشغيل25.
  6. هضم البلازميدات المؤتلفة pMD18-T / PN والمتجهات ppic9K باستخدام EcoRI و NotI. ربط الشظايا بعد الهضم بواسطة T4 DNA ligase.
  7. قم ببناء البلازميد المؤتلف ppic9K / PN لمزيد من التعبير غير المتجانس.

النتائج

كان تسلسل ORF لجين PN 855 نقطة أساس في الطول ، والذي قام بترميز 284 من الأحماض الأمينية بكتلة جزيئية محسوبة تبلغ 30.69 كيلو دالتون ونقطة متساوية كهربية متوقعة تبلغ 11.55 ، مما يشير إلى أن PN هو بروتين قلوي. تم إجراء تطبيق خادم SignalP4.0 لتحديد ببتيد الإشارة ، وأشارت النتائج إلى أن PN ?...

Discussion

تواجه صحة الإنسان سلسلة من المشاكل الطبية الرئيسية مثل أمراض الأورام والقلب والأوعية الدموية والأوعية الدمويةالدماغية 26،27. ينظر إلى الطب الصيني التقليدي على أنه مصدر البحث والتطوير للطب المبتكر ، بسبب موارده الغنية بالأنواع وهيكله ووظ?...

Disclosures

أفاد المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31871244 ، 81973733 ، 81803652) ، مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة قوانغدونغ (2019A1515011555 ، 2018A0303100007) ، مؤسسة شنتشن للجنة الصحة وتنظيم الأسرة (SZBC2018016) ، الصندوق الخاص للتنمية الاقتصادية والتكنولوجية لمنطقة Longgang بمدينة Shenzhen (LGKCYLWS2020064 ، LGKCYLWS2019000361).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-free DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA Isolation SystemsPromegaIII
Random hexamer-primersThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep KitNEBE7530S
PCR extraction kitQiaQuick
AgaroseTransGen BiotechGS201-01
High-throughput sequencerIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF programNCBI
ProtParam toolSIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTNCBI
Clustal X programUCD Dublin
MEGACenter for Evolutionary Medicine and Informatics4.0
InterProScanEuropean Molecular Biology Laboratory
Predict ProteinTechnical University of Munich
WISS-MODELSwiss Institute of Bioinformatics
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agaroseSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA Loading BufferSigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
Gel imaginganalysis systemSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA ligaseEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

References

  1. Dong, C. J. The traditional Chinese medicine fungus Cordyceps and its biotechnological production. Research Journal of Biotechnology. 8, 1-2 (2013).
  2. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1806 (2017).
  3. Koganti, P., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206 (2013).
  4. Shen, C. Y., Jiang, J. G., Li, Y., Wang, D. W., Wei, Z. Anti-ageing active ingredients from herbs and nutraceuticals used in traditional Chinese medicine: pharmacological mechanisms and implications for drug discovery. British Journal of Pharmacology. 174, (2017).
  5. Jiang, Y., Yao, Y. J. Names related to Cordyceps sinensis anamorph. Mycotaxon. 84, 245-254 (2002).
  6. Chen, Y. Q., Wang, N., Qu, L. H., Li, T. H., Zhang, W. M. Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA. Biochemical Systematics and Ecology. 29, 597-607 (2001).
  7. Liu, Z. Y., et al. Molecular evidence for the anamorph-teleomorph connection in Cordyceps sinensis. Mycological Research. 105, 827-832 (2001).
  8. Yu, S. J., Zhang, Y., Fan, M. Z. Analysis of volatile compounds of mycelia of Hirsutella sinensis, the anamorph of Ophiocordyceps sinensis. Applied Mechanics and Materials. 140, 253-257 (2012).
  9. Singh, M., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206 (2013).
  10. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  11. Lin, S., et al. Enhancement of cordyceps polysaccharide production via biosynthetic pathway analysis in Hirsutella sinensis. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 872-880 (2016).
  12. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7, 1806 (2017).
  13. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  14. Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nature Reviews. Cancer. 13, 842-857 (2013).
  15. Lin, S., Zou, Z., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Transcriptome analysis reveals the molecular mechanisms underlying adenosine biosynthesis in anamorph Strain of caterpillar fungus. BioMed Research International. 2019, 1864168 (2019).
  16. Lin, S., et al. Biosynthetic pathway analysis for improving the cordycepin and cordycepic aid production in Hirsutella sinensis. Applied Biochemistry and Biotechnology. 179, 633-649 (2016).
  17. Allard, B., Beavis, P. A., Darcy, P. K., Stagg, J. Immunosuppressive activities of adenosine in cancer. Current Opinion in Pharmacology. 29, 7-16 (2016).
  18. Fredholm, B. B. Adenosine, an endogenous distress signal, modulates tissue damage and repair. Cell Death and Differentiation. 14, 1315-1323 (2007).
  19. Ohta, A., Sitkovsky, M. Role of G-protein-coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation and protection from tissue damage. Nature. 414, 916-920 (2001).
  20. Allard, B., Turcotte, M., Stagg, J. CD73-generated adenosine: orchestrating the tumor-stroma interplay to promote cancer growth. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 485156 (2012).
  21. Zhang, Y., Wang, X., Nan, P., Li, J., Jin, L. De novo transcriptome sequencing of genome analysis provides insights into Solidago canadensis invasive capability via photosynthesis. Journal of Plant Interactions. 14, 572-579 (2019).
  22. Liu, Z. Q., et al. Transcriptome sequencing and analysis of the entomopathogenic fungus Hirsutella sinensis isolated from Ophiocordyceps sinensis. BMC Genomics. 16, 106 (2015).
  23. Ogawa, J., et al. Purification, characterization, and gene cloning of purine nucleosidase from Ochrobactrum anthropi. Applied and Environmental Microbiology. 67, 1783-1787 (2001).
  24. Konstantin, A., et al. The swiss-model workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 16, 195-201 (2006).
  25. Chung, C., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 2172-2175 (1989).
  26. Lin, S., et al. Association between aldose reductase gene C(-106)T polymorphism and diabetic retinopathy: A systematic review and Meta-Analysis. Ophthalmic Research. 63, 1-10 (2020).
  27. Peng, Y., et al. Inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT) transplantation model of murine islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
  28. Zhang, T. T., Jiang, J. G. Active ingredients of traditional Chinese medicine in the treatment of diabetes and diabetic complications. Expert Opinion on Investigational Drugs. 21, 1625-1642 (2012).
  29. Lin, S., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Expression, purification and characterization of 5'-nucleotidase from caterpillar fungus by efficient genome-mining. Protein Expression and Purification. 168, 105566 (2020).
  30. Kinjo, N., Mu, Z. Morphological and phylogenetic studies on Cordyceps sinensis distributed in southwestern China. Mycoence. 42, 567-574 (2001).
  31. Xiao, J. H., Ying, Q., Xiong, Q. Nucleosides, a valuable chemical marker for quality control in traditional Chinese medicine Cordyceps. Recent Patents on Biotechnology. 7, 2 (2013).
  32. Tu, P., Yong, J., Guo, X. Discovery, research and development for innovative drug of traditional Chinese medicine under new situations. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 40, 3423-3428 (2015).
  33. Zheng, P., et al. Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine. Genome Biology. 12, 116 (2011).
  34. Covarrubias, R., et al. Role of the CD39/CD73 purinergic pathway in modulating arterial thrombosis in mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36, 1809-1820 (2016).
  35. Ogawa, Y., Murayama, N., Yanoshita, R. Molecular cloning and characterization of ecto-5'-nucleotidase from the venoms of Gloydius blomhoffi. Toxicon. 54, 408-412 (2009).
  36. Lin, S., et al. Mining and characterization of two novel chitinases from Hirsutella sinensis using an efficient transcriptome-mining approach. Protein Expresion and Purification. 133, 81-89 (2017).
  37. Ueda, M., Hirano, Y., Fukuhara, H. Gene cloning, expression, and X-ray crystallographic analysis of a β-mannanase from Eisenia fetida. Enzyme and Microbial Technology. 117, 15-22 (2018).
  38. Rebets, Y., Kormanec, J., Luzhetskyy, A., Bernaerts, K., Anné, J. Cloning and expression of metagenomic DNA in Streptomyces lividans and subsequent fermentation for optimized production. Methods in Molecular Biology. 1539, 99 (2017).
  39. Wang, S. S., Ning, Y. J., Wang, S. N., Zhang, J., Chen, Q. J. Purification, characterization, and cloning of an extracellular laccase with potent dye decolorizing ability from white rot fungus Cerrena unicolor GSM-01. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 920-927 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Ophiocordyceps sinensis CDNA BLAST ProtProm

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved