JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تطبيق إكسوسووم هو أداة ناشئة لتطوير الأدوية والطب التجديدي. نحن ننشئ بروتوكول عزل إكوسوم مع نقاء عالية لعزل إكسوسومات من الخلايا الجذعية رواية محددة تسمى CB-SC للدراسات الميكانيكية. نحن أيضا coculture CB-SC المستمدة من الاكسوس مع monocytes الإنسان، مما يؤدي إلى تمايزها إلى الضامة المتميزة الظاهري.

Abstract

علاج اختصاصي الخلايا الجذعية (SCE) هو نهج سريري جديد لعلاج مرض السكري من النوع 1 وأمراض المناعة الذاتية الأخرى. يعمم العلاج SCE خلايا الدم أحادية النواة للمريض المعزول (على سبيل المثال، الخلايا اللمفاوية والموحدات) من خلال جهاز استئصال الخلايا السفلية، ويشارك في الثقافات خلايا الدم أحادية النوى للمريض مع الخلايا الجذعية المشتقة من دم الحبل السري (CB-SC) في جهاز SCE، ثم تعيد هذه الخلايا المناعية "المتعلمة" إلى دم المريض. Exosomes هي الحويصلات خارج الخلية بحجم نانو بين 30\u2012150 نانومتر الموجودة في جميع وسائل الإعلام ثقافة الخلايا والخلايا الحيوية. لمزيد من استكشاف الآليات الجزيئية الكامنة تحت العلاج SCE وتحديد إجراءات exosomes الافراج عن CB-SC، ونحن التحقيق في الخلايا التي phagocytize هذه الكوسومات أثناء العلاج مع CB-SC. من خلال المشاركة في زراعة ديو المسمى بـ CB-SC المشتقة من الإزقاقات مع خلايا أحادية النوى الدموية الطرفية البشرية (PBMC) ، وجدنا أن الإكزومات المشتقة من CB-SC تم تناولها في الغالب من قبل monocytes البشرية ذات CD14 الإيجابية ، مما يؤدي إلى تمايز أحادية في النوع 2 الضامة (M2) ، مع مورفولوجيا تشبه المغزل وتعبير العلامات الجزيئية السطحية المرتبطة بـ M2. هنا، نقدم بروتوكول لعزل وتوصيف اكسوزومات مشتقة من CB-SC والبروتوكول للثقافة المشتركة من الاكسوس المستمدة من CB-SC مع monocytes الإنسان ورصد التمايز M2.

Introduction

الخلايا الجذعية لدم الحبل السري (CB-SC) هي نوع فريد من الخلايا الجذعية التي تم تحديدها من دم الحبل السري البشري وتتميز عن الأنواع الأخرى المعروفة من الخلايا الجذعية مثل الخلايا الجذعية الميزينشية (MSC) والخلايا الجذعية الدموية (HSC)1. استنادا إلى خصائص فريدة من نوعها من التشكيل المناعي وقدرتها على الالتزام بإحكام إلى سطح أطباق بيتري، وضعنا تقنية جديدة معينة كمربي الخلايا الجذعية (SCE) العلاج في التجارب السريرية2،3. أثناء العلاج SCE ، يتم جمع خلايا الدم الأحادية الطرفية للمريض (PBMC) وتعميمها من خلال فاصل الخلايا والمشاركة في الثقافة مع CB-SC في المختبر. ثم تعاد هذه الخلايا "المتعلمة" (CB-SC-تعامل PBMC) إلى الدورة الدموية للمريض في نظام حلقة مغلقة. وقد أثبتت التجارب السريرية بالفعل السلامة السريرية وفعالية العلاج SCE لعلاج أمراض المناعة الذاتية بما في ذلك مرض السكري من النوع 1 (T1D)2,4 و الثعلبة areata (AA)5.

Exosomes هي عائلة من الجسيمات النانوية مع أقطار تتراوح 30\u2012150 نانومتر، وتوجد في جميع وسائل الإعلام بيوفلورويد والخلايا ثقافة6. يتم إثراء إكسوسومات مع العديد من الجزيئات النشطة بيولوجيا بما في ذلك الدهون، mRNAs، والبروتينات، وmicroRNAs (ميرنا)، وتلعب دورا هاما في الاتصالات من خلية إلى خلية. في الآونة الأخيرة، أصبحت اكسوزومات أكثر جاذبية للباحثين وشركات الأدوية نظرا لإمكاناتهم العلاجية في العيادات7،8،9. في الآونة الأخيرة، أظهرت دراساتنا الميكانيكية أن الإكسوسومات CB-SC التي تم إصدارها تساهم في التشكيل المناعي للعلاج SCE10.

هنا، ونحن وصف البروتوكول لاستكشاف آلية العلاج SCE استهداف monocytes بواسطة اكسوزومات CB-SC صدر. أولاً، تم عزل الاستئصالات الصادرة من CB-SC من الوسائط المكيفة المشتقة من CB-SC باستخدام أساليب الاستئصال الفائق والتحقق من صحتها عن طريق قياس التدفق، واللطخة الغربية (البنك الدولي) وتشتت الضوء الديناميكي (DLS). ثانياً، تم تسمية الكوسومات المشتقة من CB-SC بصبغة شفة خضراء فلورية: ديو. ثالثاً، كانت هذه المنشآت مُزَمَّقة مع PBMC لدراسة النسب المئوية الإيجابية من الإزوسومات المشتقة من ديو CB-SC في المنشآت الفرعية المختلفة من PBMC بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة. يوفر هذا البروتوكول إرشادات لدراسة عمل الإكسوسومات الكامنة في التشكيل المناعي للخلايا الجذعية.

Protocol

ويتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية المؤسسية في مركز الاكتشاف والابتكار، هاكينساك ميريديان هيلث. تم شراء وحدات الدم معطف الإنسان من مركز الدم في نيويورك (نيويورك، نيويورك). تم جمع وحدات دم الحبل السري البشري من متبرعين أصحاء وتم شراؤها من بنك الدم الدولي Cryo-Cell (Oldsmar, FL). وقد حصل كل من مركز نيويورك للدم وكريو-سيل على جميع الاعتمادات لجمع الدم وتوزيعه، بموافقة المجلس ووقّع استمارات الموافقة من المتبرعين.

1. خلية ثقافة وإعداد CB-SC- مشتقة المتوسطة مشروطة

  1. نقل 25 مل من دم الحبل السري (جدول المواد) أكثر من 20 مل من الكثافة المتوسطة الانحدار (γ = 1.077) إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  2. جهاز طرد مركزي في 1,690 x ز لمدة 20 دقيقة في 20 درجة مئوية في الدوار دلو يتأرجح دون الفرامل.
  3. نقل بعناية طبقة الخلية أحادية النوى (معطف بافي) إلى أنبوب جديد مخروطي 50 مل. ملء أنبوب مخروطي مع الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) إلى 40 مل. مزيج وطاردة مركزية لخلايا بيليه في 751 × ز لمدة 10 دقيقة في 20 درجة مئوية.
  4. تجاهل supernatant وإضافة 15 مل من ACK تحلل العازلة(جدول المواد)إلى بيليه الخلية. إعادة تعليق الخلايا من خلال الأنابيب. ثم احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: هذه الخطوة إزالة خلايا الدم الحمراء.
  5. ملء أنبوب مخروطي مع 25 مل من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 751 × ز لمدة 5 دقائق والتخلص من فوق للحصول على خلايا أحادية النواة.
  6. غسل 2x مع 40 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة العازلة تحلل المتبقية.
  7. جهاز طرد مركزي في 751 × ز لمدة 5 دقائق ل بيليه الخلايا.
  8. تخلص من الخلايا أحادية النواة في دم الحبل السري وإعادة تعليقها مع 10 مل من الوسيط الخالي من المصل(جدول المواد)لكل أنبوب.
  9. الجمع بين خلايا أحادية النوى في دم الحبل السري إلى أنبوب واحد.
  10. اتخاذ 20 μL تعليق الخلية وخلط مع 20 ميكرولتر من 0.4٪ trypan حل الأزرق(جدول المواد)في أنبوب 1.5 مل.
  11. قم بتحميلها في شريحة الغرفة وتحديد رقم الخلية وقابلية الخلية للتطبيق باستخدام عداد خلية تلقائي.
    ملاحظة: يتم تخفيف تعليق الخلية عند 1:10 إذا كان تركيز الخلية أعلى من 1 × 107 خلايا/مل.
  12. بذور الخلايا أحادية النوى في 150 مم × 15 ملم أطباق بيتري في 1 × 106 خلايا / مل، 25 مل / طبق في مصل خال من الخلايا المتوسطة المعرفة كيميائيا.
  13. احتضان في 37 درجة مئوية تحت 8٪ CO2 شروط لمدة 10\u201214 أيام حتى CB-SC تصل إلى أكثر من 80٪ التقاء.
  14. تجاهل افرا و غسل مع 15 مل من برنامج تلفزيوني لكل طبق بيتري; ثم، إزالة برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: يتم إرفاق CB-SC بأطباق بيتري بإحكام.
  15. كرر الخطوة 1.14 مرتين.
  16. أضف 25 مل من مصل خالي من الوسيلة الكيميائية في طبق بيتري.
  17. احتضان في 37 درجة مئوية تحت 8٪ ثاني2 شروط لمدة 3\u20124 أيام.
  18. جمع المتوسط مكيفة CB-SC المستمدة في أنابيب مخروطية 50 مل.

2- توصيف CB-SC

  1. فصل CB-SC بواسطة pipetting 10 مل من خلية الفصل على أساس برنامج تلفزيوني العازلة صعودا وهبوطا مع تلميح ماصة 5 مل(جدول المواد).
  2. أجهزة الطرد المركزي في 1690 × ز لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه وإعادة تعليق في 200 μL من برنامج تلفزيوني.
  3. إصلاح و Permeabilize الخلايا لتلوين داخل الخلايا عن طريق تلطيخ إعداد عدة (جدول المواد).
  4. إضافة 5 ميكرولتر من مانع Fc(جدول المواد)لكل عينة واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمنع مانع Fc الربط غير المحدد عند التلطيخ بالأجسام المضادة.
  5. إضافة الفلوريسنس-مترافق الماوس المضادة للأجسام المضادة البشرية أحادية النسيلة بما في ذلك CD34، CD45، SOX2، OCT3/4، CD270، وGalectin 9 في 25 ميكروغرام / مل(جدول المواد)إلى 100 ميكرولتر حجم الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع حماية خفيفة.
  6. بعد تلطيخ، وغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي في 751 × ز لمدة 10 دقيقة إلى خلايا بيليه.
  7. إعادة تعليق الخلايا مع 200 μL من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى أنبوب 5 مل.
  8. تنفيذ عملية استئصال التدفق للتحقق من صحة التعبير من CB-SC-المرتبطة علامات أعلاه محددة.

3- عزل الاكسوس المستمد من CB-SC

  1. جهاز طرد مركزي المتوسط المُكيف الذي تم جمعه من الخطوة 1.18 عند 300 x غم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل فائقة إلى أنبوب جديد 50 مل المخروطية.
  2. جهاز طرد مركزي المُجمع من الخطوة 3.1 عند 2000 x غم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. نقل فائقة إلى أنبوب جديد 50 مل المخروطية.
  3. جهاز طرد مركزي المُجمع من الخطوة 3.2 عند 10000 x ز لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. نقل فائقة إلى أنبوب جديد 50 مل المخروطية.
    ملاحظة: يتم استخدام الدوار زاوية ثابتة بحيث يتم عجلت الكريات الخلية إلى جانب الأنبوب. وضع علامة على جانب الغطاء ورسم دائرة على جانب الأنبوب حيث من المتوقع بيليه.
  4. تراكبات التصفية التي تم جمعها من الخطوة 3.3 مع مرشح 0.22 ميكرومتر(جدول المواد).
  5. نقل 15 مل من وسائل الإعلام إلى كل 10 كيلو ادا وحدة تصفية الطرد المركزي(جدول المواد).
  6. أجهزة الطرد المركزي في 4000 × ز لمدة 30 دقيقة لعزل وسائط الإكسوسومات المركزة.
  7. نقل الاكسوسات المركزة إلى أنبوب الطرد الفائق. ثم، اكسوزومات بيليه في 100،000 س ز لمدة 80 دقيقة في 4 °C.
  8. تجاهل عظمى وإعادة تعليق exosomes بيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 100،000 س ز لمدة 80 دقيقة في 4 درجة مئوية لجمع الكريه exosomes.
  10. إعادة تعليق بيليه اكسوزومات في 200 μL من برنامج تلفزيوني عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.

4- توصيف الكوسومات المشتقة من الـ CB-SC

  1. تحديد كمية تركيز البروتين الكلي لإعداد الإكسوسوم بواسطة مجموعة طقم حمض ثنائي شونونيك (BCA)
    1. Pipette 10 μL من كل عينة من الزفير القياسية والمعزولة على شكل ايزوسومات معدة في الخطوة 3.10 في لوحة 96-well في مكررة.
    2. أضف 200 ميكرولتر من الكاشف العامل من مجموعة BCA إلى كل بئر. مزيج محتويات لوحة بدقة على لوحة شاكر لمدة 10 s.
      ملاحظة: كاشف العمل (WR): 50 جزء كاشف A مع 1-جزء كاشف B.
    3. تغطية لوحات مع احباط واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. تبريد لوحات إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. قياس امتصاص العينة في 562 نانومتر عن طريق قارئ لوحة.
  2. إعداد وتلطيخ من إضحاوس لتدفق عملية استئصال
    1. التقاط اكسوزومات بإضافة 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المضادة للإنسان CD63 (حجم 4.5 ميكرومتر)(جدول المواد)إلى 25 ميكروغرام من الإكسوسومات المشتقة من CB-SC المعدة في الخطوة 3.10 في إجمالي 100 ميكرولتر حجم برنامج تلفزيوني.
    2. احتضان أنبوب بين عشية وضحاها (18\u201222 ساعة) في 4 درجة مئوية على شاكر في 800 دورة في الدقيقة.
    3. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 300 س ز لمدة 30 s لجمع العينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
    4. إضافة 300 μL من العزل العازلة (0.1٪ البوم الدم البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني) ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب.
      ملاحظة: هذه الخطوة يغسل exosomes ربط حبة.
    5. ضع الأنبوب على حامل مغناطيس لمدة 1 دقيقة (جدول المواد) وتجاهل المابير.
    6. كرر الخطوات 4.2.4\u20124.2.5.
    7. إعادة تعليق exosomes حبة ملزمة مع 400 ميكرولتر من العازلة العزل.
    8. Aliquot 100 ميكرولتر من الاكسوسات المربوطة بالخرز لكل أنبوب.
    9. إضافة الأجسام المضادة المترافقة مع الفلور (CD9-FITC، CD81-PE، و CD63-FITC في 25 ميكروغرام/مل، على التوالي) إلى كل أنبوب تدفق مع اكسوزومات CD63 التي تم التقاطها بالخرز.
      ملاحظة: يعمل IgGs المطابق Isotype كـ عناصر تحكم سالبة.
    10. احتضان لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع حماية خفيفة على شاكر في 800 دورة في الدقيقة.
    11. كرر الخطوات 4.2.4\u20124.2.5.
    12. إعادة تعليق exosomes حبة ملزمة في 200 ميكرولتر من العزلة العازلة ونقلها إلى أنابيب تدفق 5 مل.
    13. ضع الأنابيب في عينة الدوارة من تدفق سايتوميتر.
    14. افتح البروتوكول لاختبار الاكسوسوم.
    15. تشغيل العينة تلقائيا بواسطة تدفق مقياس المقاييس.
  3. اكتشاف الكوسوم بواسطة لطخة غربية
    ملاحظة: لطخة الغربية هي طريقة راسخة ونحن لن ندخل في تفاصيل الأسلوب نفسه.
    1. lyse الكريات من اكسوزومات CB-SC المستمدة من الخطوة 3.10 مع 100 ميكرولتر من العازلة RIPA، ماص 20x، ثم وضع على الجليد لمدة 5 دقائق.
    2. كمي تركيز البروتين من ميزات الاكسوس بواسطة مجموعة BCA وتحميل 25 ميكروغرام من البروتين في البئر.
    3. فصل البروتينات بواسطة جل الكهرباء لمدة 40 دقيقة في 150 V.
    4. نقل البروتين إلى بولي فينيليدين فلوريد (PVDF) غشاء باستخدام طريقة نقل شبه الجافة11.
    5. سد الغشاء مع 5٪ الحليب غير الدهني لمدة 30 دقيقة.
    6. احتضان مع 2 ميكروغرام / مل المضادة للإنسان Alix (جدول المواد) و 1 ميكروغرام / مل المضادة للأجسام المضادة كالنشين البشرية (جدول المواد).
    7. الكشف عن البروتين عن طريق chemiluminescence مع نظام التصوير الرقمي.
  4. التحقق من صحة الكوسوم من خلال تشتت الضوء الديناميكي (DLS)
    1. تمييع 10 ميكروغرام من عينات الإكسوسوم المشتقة من CB-SC في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. نقل 1 مل من العينة المخففة إلى cuvette شبه الصغر المتاح(جدول المواد).
    3. ضع الـ cuvette في أداة DLS. تعيين معامل الانكسار (RI) كـ 1.39 لكافة شاشة العينة.
    4. تشغيل العينات في 25 درجة مئوية والحصول على ثلاثة قياسات لكل كسر للحصول على متوسط حجم التوزيع.
  5. التحقق من صحة إكسوسومات عن طريق المجهر الإلكترون انتقال (TEM)
    1. معطف formvar على 300 شبكة شبكات النحاس12 (جدول المواد).
    2. تعزيز formvar مع طبقة إضافية من الكربون المتبخر على شبكات النحاس12.
      ملاحظة: مثل هذا النهج طلاء ممتازة لدعم العينة.
    3. تحميل 10 ميكرولتر من عينات إكسوسوسوم على الشبكات وترك للهواء الجاف.
    4. عينات البقعة السلبية مع خلات أورانيل لمدة 5 دقائق.
    5. غسل ثلاث مرات مع DI الماء وتترك لتجف الهواء.
    6. مراقبة وتصوير العينات تحت TEM. تعيين الجهد المتسارع في 200 كيلو فولت وحجم بقعة في 2.

5. التدبير ديو المسمى CB - SC المستمدة من الاكوسوم التي اتخذتها مختلف المنشآت الفرعية من PBMC

  1. تسمية CB-SC المستمدة من الاكسوس مع صبغة ديو الدهنية الفلورية الخضراء
    1. نقل 100 ميكروغرام من إكسوزومات استخراجية من نوع CB-SC (أعدت في الخطوة 3.10) إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل.
    2. تمييع العينة مع برنامج تلفزيوني إلى 5 مل.
    3. إضافة صبغة فلوروفية ديو فلورسنت ديو(جدول المواد)حتى يصل تركيز العمل إلى 5 ميكرومتر.
    4. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء.
    5. نقل العينة إلى أنبوب فائق الوضوح.
    6. أجهزة الطرد المركزي في 100،000 س ز لمدة 80 دقيقة إلى بيليه ديو المسمى CB-SC المستمدة exosomes.
    7. إعادة تعليق الاكسوس المسمى في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  2. إعداد PBMC الإنسان
    1. نقل 25 مل من معطف بافي الإنسان(جدول المواد)أكثر من 20 مل من الكثافة المتوسطة الانحدار (γ = 1.077) في أنبوب مخروطي 50 مل.
    2. كرر الخطوات من 1.2 إلى 1.11.
    3. نقل 1 × 106 PBMC إلى لوحة 24-well المُهَم المعالجة غير المعالجة بالأنسجة (1 مل/بئر).
      ملاحظة: تم استخدام لوحة غير معالجة للأنسجة لتجنب التمسك بوحددات.
  3. شارك في الثقافة ديو المسمى exosomes مع PBMC
    1. نقل 40 ميكرولتر ديو المسمى CB-SC- exosomes المستمدة أعدت في الخطوة 5.1.7 إلى كل PBMC-تحتوي على جيدا في لوحة 24-جيدا باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. إضافة نفس حجم برنامج تلفزيوني للسيطرة على الآبار.
    2. مزيج بواسطة pipetting 10x. احتضان لمدة 4 ساعات.
    3. جمع 200 ميكرولتر- المعالجة PBMC وتسمية مع Hoechst 33342 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل افرا و إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    5. خلايا جبل على شرائح المجهر.
    6. مراقبة وتصوير التفاعل بين ديو المسمى CB-SC-المشتقة من الاكسوس مع هويشت 33342-المسمى PBMC باستخدام المجهر.
    7. نقل الخلايا المتبقية من الخطوة 5.3.3 إلى أنبوب 1.5 مل.
    8. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل افرا وإعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    9. أضف 5 ميكرولتر من مانع Fc لكل عينة. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    10. إضافة الأجسام المضادة (CD3، CD4، CD8، CD11c، CD14، CD19، وD56 في 25 ميكروغرام / مل)(جدول المواد) لطخةPBMC.
      ملاحظة: يعمل IgGs المطابق Isotype كـ عناصر تحكم سالبة.
    11. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع حماية خفيفة.
    12. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي في 300 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية ل بيليه الخلايا.
    13. إعادة تعليق الخلايا مع 200 μL PBS. إضافة 5 ميكرولتر من يوديد بروبديسيوم.
    14. استخدام تدفق cytometry لتقييم مستوى امتصاص اكسوسوسوم المسمى ديو في السكان الفرعية المختلفة من PBMC.

6. دراسة عمل اكسوزومات مشتقة من CB-SC على أحاديات

  1. العزلة الإنسان CD14-monocytes إيجابية
    1. نقل 3 × 107 PBMC الإنسان في أنبوب 15 مل.
    2. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. ضع عمود الفصل (جدول المواد) في فاصل المغناطيس (جدول المواد).
    4. غسل أعمدة الفصل ثلاث مرات مع 2 مل من الباردة تشغيل العازلة(جدول المواد).
    5. إعادة تعليق الخلايا في 300 μL من برنامج تلفزيوني الباردة. أضف 60 ميكرولتر من ميكروبات CD14. تخلط جيدا واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    6. إضافة 6 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. إعادة تعليق الخلايا في بيليه 500 μL من الباردة تشغيل العازلة.
    8. نقل الخلايا إلى عمود الفصل (المعدة في الخطوة 6.14) والسماح لهم بالمرور.
    9. اغسل عمود الفصل ثلاث مرات مع 2 مل من المخزن المؤقت في الغسيل. ارفع العمود من فاصل المغناطيس وضعه في أنبوب طرد مركزي 15 مل.
      ملاحظة: يجب وضع أنبوب 15 مل على الجليد بسبب الالتزام بـ CD14-positive monocytes إلى الأنبوب في درجة حرارة الغرفة.
    10. نقل 2 مل من الباردة تشغيل العازلة إلى أعلى العمود وعزل الخلايا CD14 إيجابية في أنبوب 15 مل.
    11. جهاز طرد مركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية إلى بيليه الخلايا إيجابية CD14.
    12. إعادة تعليق الخلايا مع 2 مل من مادة كيميائية الباردة المعرفة مصل الحرة المتوسطة(جدول المواد).
    13. نقل 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل.
    14. وصمة عار مع 10 ميكرولتر من كروم أورانج مترافق المضادة للدم البشري CD14 مل ب (جدول المواد) لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: يعمل IgGs المطابق Isotype كـ عناصر تحكم سالبة.
    15. إضافة 1 مل PBS إلى الخلايا. جهاز طرد مركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة إلى خلايا بيليه.
    16. إعادة تعليق الخلايا في 200 μL من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى أنبوب 5 مل. تحديد نقاء الخلايا أحادية CD14 إيجابية عن طريق تدفق الخلايا.
  2. علاج أحاديات مع اكسوزوس مشتقة من CB-SC
    1. البذور 1 × 106 monocytes المنقاة مع الكيميائية المعرفة مصل خالية من المتوسط ثقافة(جدول المواد)في الأنسجة ثقافة المعالجة 6-جيدا لوحة (2 مل / جيدا).
    2. احتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
    3. تجاهل المصات الفائق مع 1 مل ماصة. إضافة 2 مل من 37 درجة مئوية قبل تسخين الكيميائية المحددة الكيميائية مصل خالية من المتوسط(جدول المواد)بلطف.
      ملاحظة: تم الالتزام monocytes إلى لوحة داخل 2 ساعة. تم تحديد الخلايا العائمة على أنها تلوثات ميتة أو غيرها من الخلايا.
    4. أضف 80 ميكروغرام من الاكسوس المشتق من CB-SC المعزولة من الخطوة 3.10 إلى الثقافات أحادية في لوحة 6-جيدا مع حجم إجمالي قدره 2 مل.
      ملاحظة: تمت إضافة نفس حجم برنامج تلفزيوني للتحكم في الآبار.
    5. احتضان في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 3\u20124 أيام.
    6. تصوير مورفولوجيا الخلية باستخدام مجهر مقلوب في 200× التكبير (جدول المواد).
    7. فصل الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا في 1 مل من خلية الفصل على أساس برنامج تلفزيوني العازلة مع 1 مل ماص تلميح.
    8. حصاد الخلايا المرفقة المتبقية عن طريق مكشطة الخلية.
      ملاحظة: منذ أحاديات أساسية أو الضامة متباينة إرفاق بإحكام، تبقى بعض الخلايا الالتزام إلى أسفل بعد العلاج مع العازلة الانفصام. لذلك، يتم حصاد هذه الخلايا مع مكشطة الخلية.
    9. جمع الخلايا في 1،690 س ز لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في 200 μL من برنامج تلفزيوني.
    10. أضف 5 ميكرولتر من مانع Fc (25 ميكروغرام/مل) لمنع الربط غير المحدد.
    11. إضافة الأجسام المضادة (CD14، CD80، CD86، CD163، CD206، وD209 في 25 ميكروغرام / مل، جدول المواد)إلى الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: IgGs متطابقة مع الأيزوتايب بمثابة التحكم السالب
    12. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة. تجاهل افرا وإعادة تعليق مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    13. إضافة 5 ميكرولتر من يوديد بروبدييوم لكل عينة (200 ميكرولتر) ونقل الخلايا إلى أنبوب تدفق جديد 5 مل.
    14. تنفيذ عملية استئصال التدفق وتقييم مستويات التعبيرات CD14 و CD80 و CD86 و CD163 و CD206 و CD209.

النتائج

في البداية، تم فحص النمط الظاهري ونقاء CB-SC بواسطة قياس التدفق الخلوي مع علامات CB-SC المرتبطة مثل مستضد الكريات البيض المشترك CD45، وعوامل النسخ الخاصة بالخلايا ES OCT3/4، وSOCX2. CB-SC عرض مستويات عالية من CD45، OCT3/4، SOX2، CD270، و 9 galectin التعبير، ولكن لا تعبير عن CD34 (الشكل 1A). وأكد تحليل تدفق ق...

Discussion

تطبيق الإكسوسوم هو مجال ناشئ للتشخيص السريري، والتطورات الدوائية والطب التجديدي. هنا، نقدم بروتوكول مفصل بشأن إعداد اكسوزومات مشتقة من مادة CB-SC والدراسة الوظيفية للاكسوسومات على التمييز بين أحاديات الإنسان. أظهر البروتوكول الحالي أن الإكسوسومات الوظيفية المشتقة من SC يتم عزلها بالطرد ا?...

Disclosures

الدكتور تشاو هو مؤسس Tianhe الخلايا الجذعية للتكنولوجيا الحيوية هي شركة الدكتور جاو مخترع التكنولوجيا Cell Cell. ولا يملك جميع المؤلفين الآخرين أي مصالح مالية قد تكون ذات صلة بالعمل المقدم.

Acknowledgements

ونحن ممتنون للسيد بوددار والسيد لودفيغ على الدعم السخي للتمويل من خلال مؤسسة هاكينساك UMC. ونحن نقدر لورا تشاو لتحرير اللغة الإنجليزية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml Microcentrifuge tubeFisher Scientific05-408-129
15 ml conical tubeFalcon352196
24-well plateFalcon351147Non-tissue culture
plate
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)Millipore sigmaD4292-20MGStore at 4 °C
300 Mesh GridsTed Pella1GC300
50 mL conical tubeFalcon352070
6-well plateFalcon353046Tissue culture plate
96-well plateFalcon353072Tissue culture plate
ACK Lysis BufferLonza10-548E100 ml
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter UnitMillipore sigmaUFC901024
Anti-Human AlixBiolegend634501store at 4 °C, RRID: AB_2268110
Anti-Human CalnexinBiolegend699401store at 4 °C, RRID: AB_2728519
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7BD Bioscience561356store at 4 °C, RRID: AB_10611859
Anti-Human CD14 antibody, Karma OrangeBeckman CoulterB36294store at 4 °C, RRID: AB_2728099
Anti-Human CD163 antibody, PEBD Bioscience556018store at 4 °C, RRID: AB_396296
Anti-Human CD19 antibody, PC5Beckman CoulterIM2643Ustore at 4 °C, RRID: AB_131160
Anti-Human CD206 antibody, FITCBD Bioscience551135store at 4 °C, RRID: AB_394065
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421BD Bioscience564127store at 4 °C, RRID: AB_2738610
Anti-Human CD270 antibody, PEBiolegend318806store at 4 °C, RRID: AB_2203703
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic BlueBiolegend300431store at 4 °C, RRID: AB_1595437
Anti-Human CD34 antibody, APCBeckman CoulterIM2427Ustore at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD4 antibody, APCBD Bioscience555349store at 4 °C, RRID: AB_398593
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7Beckman CoulterIM3548Ustore at 4 °C, RRID: AB_1575969
Anti-Human CD56 antibody, PEBeckman CoulterIM2073Ustore at 4 °C, RRID: AB_131195
Anti-Human CD63 antibody,PEBD Bioscience561925store at 4 °C, RRID: AB_10896821
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterA94686store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD80 antibody, APCBeckman CoulterB30642store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD81 antibody, FITCBD Bioscience561956store at 4 °C, RRID: AB_394049
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterB30646store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD9 antibody, FITCThermoScienticMA5-16860store at 4 °C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421Biolegend348919store at 4 °C, RRID: AB_2716134
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660ThermoScientic50-5841-82store at 4 °C, RRID: AB_11218882
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488ThermoScientic53-9811-82store at 4 °C, RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA1933
Buffy coatNew York Blood Center40-60 ml/unit
Cell scraperFalcon353085
Disposable semi-micro cuvetteVWR97000590
Dissociation bufferGibco131510014100 ml
Dual-Chanber cell counting slidesBio-Rad1450015
Exosome-Human CD63 Detection reagentThermoFisher Scientific10606Dstore at 4 °C
Ficoll-Paque PLUS density grandient mediaGE Health17-1440-03500 ml
Fixed-Angle Rotor(25°)Thermo Scientifc75003698Maxium 24,700 x g
Gallios flow cytometerBeckman Coulter3 lasers
10 Color Max
Human cord bloodCryo-Cell International40-100 ml/unit
Human Fc BlockBD Bioscience564220store at 4 °C
Immun-Blot PVDF membraneBio-Rad1620177
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µmMillipore SigmaSLGP033RS
Optima XE-90 UltracentrigugeBeckman Coulter
Orbital Shaker MP4BioExpressS-3500-1
PBSThermoFisher Scientific10010049500 ml
Propidium IodideBD Bioscience56-66211Estore at 4 °C
Nikon Eclipse Ti2 microscopeNikon instruments IncEclipse Ti2NIS-Elements software version 5.11.02
Hochest 33342Thermo Scientifc622495 ml
Revert microsopyFisher scientific12563518
Rotor 41 TiBeckman Coulter331362Maxium 41,000 rpm
Sorvall St 16R CentrifugeThermo Scientifc75004381
Swinging Bucket RotorThermo Scientifc75003655
TC-20 cell counterBio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 IncubatorThermoFisher Scientific
Transmission electron microscopyJEOLJEM-2100 PLUS
Ultracentrifuge tubeBeckman Coulter331372
X'VIVO 15 Serum-free mediumLonzaBEBP04-744Q1000 ml Culture medium, store at 4 °C

References

  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
  3. Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
  4. Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
  5. Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
  6. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  7. Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
  8. Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
  9. Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
  10. Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
  11. Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
  12. Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
  13. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  15. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

165 CB SC SCE 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved