فائقة الدقة تصوير الخلايا الحية من الهياكل دون الخلوية

Summary

هنا هو بروتوكول فائقة الدقة التصوير بالخلايا الحية في الأنسجة سليمة. لقد قمنا بتوحيد شروط تصوير مجموعة الخلايا الجذعية البالغة الحساسة للغاية في بيئة الأنسجة الأصلية. وتنطوي هذه التقنية على تحقيق التوازن بين الاستبانة الزمنية والمكانية للسماح بالملاحظة المباشرة للظواهر البيولوجية في الأنسجة الحية.

Abstract

كانت هناك منذ فترة طويلة مقايضة حاسمة بين الدقة المكانية والزمنية في التصوير. وقد تم تقليديا التصوير خارج الحد الحيود للضوء يقتصر على استخدامها فقط على عينات ثابتة أو الخلايا الحية خارج الأنسجة المسماة مع إشارة الفلورسنت قوية. تتطلب تقنيات تصوير الخلايا الحية فائقة الدقة الحالية استخدام مسابير مضان خاصة ، أو إضاءة عالية ، أو اكتساب صور متعددة مع معالجة ما بعد الاستحواذ ، أو في كثير من الأحيان مزيج من هذه العمليات. وتحد هذه الشروط المسبقة بشكل كبير من العينات والسياقات البيولوجية التي يمكن تطبيق هذه التقنية عليها.

هنا نحن نصف طريقة لأداء فائقة الدقة (~ 140 نانومتر XY القرار) الوقت الفاصل الزمني التصوير الخلايا الحية في الموقع. هذه التقنية متوافقة أيضا مع كثافة الفلورسنت المنخفضة ، على سبيل المثال ، EGFP أو mCherry الموسومة داخليا في الجينات المعبر عنها بشكل منخفض. كدليل على المبدأ ، استخدمنا هذه الطريقة لتصور هياكل فرعية متعددة في اختبار Drosophila. أثناء إعداد الأنسجة ، يتم الحفاظ على كل من البنية الخلوية ومورفولوجيا الأنسجة داخل الخصية المشرحة. هنا ، نستخدم هذه التقنية لتصوير ديناميات microtubule ، والتفاعلات بين microtubules والغشاء النووي ، فضلا عن ارتباط microtubules إلى centromeres.

تتطلب هذه التقنية إجراءات خاصة في إعداد العينات وتركيب العينات وشل حركة العينات. بالإضافة إلى ذلك، يجب الحفاظ على العينات لعدة ساعات بعد تشريح دون المساس وظيفة الخلوية والنشاط. في حين أننا قمنا بتحسين ظروف التصوير الحي فائق الدقة على وجه التحديد في الخلايا الجذعية الجرثومية الذكور Drosophila (GSCs) والخلايا الجرثومية السلف في أنسجة الخصية تشريح، وهذه التقنية تنطبق على نطاق واسع على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المختلفة. إن القدرة على مراقبة الخلايا في ظل ظروفها الفسيولوجية دون التضحية بالدقة المكانية أو الزمنية ستكون بمثابة أداة لا تقدر بثمن للباحثين الذين يسعون إلى معالجة الأسئلة الحاسمة في بيولوجيا الخلايا.

Introduction

تصور الهياكل دون الخلوية وديناميات البروتين في الخلايا الحية مع القرار وراء حد الحيود للضوء وعادة ما يكون تحديا كبيرا^1-3. في حين تم تطوير تقنيات متعددة فائقة الدقة مثل الاستشحات البصري - إعادة الإعمار - المجهر (STORM) ، والتنظير الضوئي المنشط - التعريب الدقيق (PALM) وحفز الانبعاثات - الاستنفاد (STED)^4،5،6 المجهر ، والمضاعفات في إعداد العينات ، فضلا عن الحاجة إلى الحفاظ على الجدوى والنشاط في الجسم الحي ، والحد من استخدام المجهر فائقة الدقة التقليدية لتصوير العينات الحية. لا يمكن أن يصل المجهر البؤري التقليدي إلى الدقة المكانية بعد دقة XY ~ 230 نانومتر وغالبا ما يكون غير كاف لمراقبة الهياكل الفرعية الخلوية المعقدة^5و6. ومع ذلك ، فإن التطور الأخير في المجهر confocal ، Airyscan فائقة الدقة التصوير ، قادرة على تحقيق ما يقرب من 140 نانومتر (XY القرار)^7،8 ولديه إعداد عينة بسيطة نسبيا التي تتوافق مع التصوير الحي. منذ هذا النظام الكشف عن التصوير يتطلب وقتا طويلا اقتناء، قرارها المكانية عالية لا تأتي على حساب القرار الزمني⁹. لذلك، هناك حاجة إلى طريقة لضمان أن يتم توسيع التصوير بالخلايا الحية مع دقة مكانية عالية.

هنا، طورنا طريقة لمراقبة الخلايا الحية في الأنسجة السليمة بدقتها المثلى لفك الهياكل دون الخلوية مع معلومات مكانية مفصلة. تم تصميم هذه الطريقة على هذا النحو بحيث يمكن تركيب العينات بشكل ثابت لفترة طويلة من الزمن (~ 10 ساعة) دون تحريك أو تدهور. يمكن لوسائط الخلايا الحية المستخدمة في هذه التقنية دعم الوظيفة الخلوية وتجنب الbleaching الضوئي لمدة تصل إلى 10 ساعات تحت المجهر فائق الدقة. وأخيرا، يقلل هذا البروتوكول من معظم الضغوط الناجمة عن الإضاءة المستمرة لأشعة الليزر على مدى فترات طويلة من الزمن مثل نقص الأكسيجة، والتغيرات في الرطوبة ودرجة الحرارة، فضلا عن استنفاد المغذيات.

باستخدام هذا البروتوكول لتصوير Drosophila الذكور الخلايا الجذعية الجرثومية (GSCs)، كنا قادرين على ملاحظة كيف النشاط غير المتماثل من microtubules يسمح للتفاعل التفضيلي مع الكروماتيدات الشقيقة المتميزة وراثيا^{10،11،12،13}. هذه الأنواع من الأحداث الخلوية هي ديناميكية للغاية ويصعب جدا تصور في الخلايا الحية باستخدام طرق التصوير فائقة الدقة الأخرى مثل العاصفة، بالم، أو الأمراض المنقولة جنسيا. نتوقع أن تصبح هذه الطريقة مفيدة للغاية لعلماء الأحياء الخلية لأنها تهدف إلى فهم الهياكل دون الخلوية الديناميكية للخلايا الحية الموجودة في الأنسجة. هناك العديد من المجالات التي يمكن تطبيق هذه الطريقة على, مثل دراسة ديناميات البروتينات; فهم حركة الخلايا؛ وتتبع النسب وعمليات التمايز الخلوي، من بين تطبيقات أخرى ممكنة.

Protocol

1. إعداد كوكتيل تصوير الخلايا الحية (وسائط الخلية الحية)

1. ملحق شنايدر Drosophila المتوسطة مع 15٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 0.6x البنسلين / العقدية. ضبط درجة الحموضة إلى حوالي 7.0.
2. قبل استخدام الوسيطة مباشرة، أضف الأنسولين إلى تركيز نهائي قدره 200 ميكروغرام/مل.
   ملاحظة: هذه الوسائط أمر بالغ الأهمية للحفاظ على انقسام الخلايا الطبيعية وتطوير الخصية Drosophila أثناء التصوير الفاصل الزمني^10،14.

2. إعداد طبق زجاج زراعة الخلايا السفلية

1. استخدم طبق زراعة الخلايا الزجاجية المغلفة بالزجاج من L-lysine بقطر 35 مم لاختبار Drosophila. البئر الداخلي للطبق لديه قاع زجاجي قطره 23 مم وجانب بارتفاع 1 مم(الشكل 1A-a).
   ملاحظة: اختر طبق زجاجي القاع يسمح بمسافة عمل أقصر وفتحة رقمية أكبر وهدف تكبير أعلى؛ هذه الميزات هي حاسمة للحصول على صورة فائقة الدقة.
2. استخدم غشاء غسيل الكلى (MWCO: 12-14kD) الذي يسمح بالتبادل الغازي. قطع الغشاء إلى قطع صغيرة.
   ملاحظة: يجب أن تكون قطع الغشاء أصغر من المساحة الزجاجية للطبق ولكنها كبيرة بما يكفي لتغطية العينة.
3. نقع الغشاء مع 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الخلية الحية ل ~ 5 دقيقة. لا تستخدم غشاء جاف على العينة، لأنه قد يضر بها. يساعد الغشاء على منع الإجهاد نقص الأكز.
4. إعداد 2-3 الزجاج خفيف الوزن أو قطع بلاستيكية لوضع على الغشاء بحيث الأنسجة لن تطفو. للقيام بذلك، أولا تأخذ الحلقة الخارجية من أنبوب الطرد المركزي 50 مل وقطع عليه إلى قطع صغيرة. ثم قم بتعقيم القطع بالإيثانول بنسبة 70٪ قبل الاستخدام.
   ملاحظة: تضمن هذه الخطوة بقاء العينة على السطح أثناء التصوير وعدم طفوها، وهو أمر حاسم للحصول على أفضل النتائج.
5. إعداد حلقة ~ 25 ملم في القطر ووضعه في الجانب مرتفعة من الطبق. ضع غطاء عليه لتوليد غرفتين. الغرفة السفلية سوف تحتوي على العينة في حين أن الغرفة العليا ستكون بمثابة غرفة الرطوبة لمنع العينة من التجفيف.
   1. لجعل هذا الخاتم، وقطع الحلقة الخارجية من أنبوب الطرد المركزي 50 مل، والتي سوف تسمح لها لتناسب بشكل آمن على الجانب مرتفعة من طبق 35 ملم. يمكن إجراء حلقة مماثلة بطرق أخرى ، على سبيل المثال ، باستخدام شريط مطاطي أو ربطة عنق بلاستيكية لتناسب على الجانب المرتفع من الطبق لعقد الغطاء بشكل صحيح دون التدخل في العينة.
      ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة، خاصة بالنسبة للعينات الحساسة للضغوط مثل حالات نقص الأكز، والتغيرات في درجة الحرارة والرطوبة.

3. تشريح الخصيتين من الذباب الذكور وتصاعد

1. اتخاذ ~ 10 الذباب الذكور الشباب (2-3 يوم من العمر) وتشريح الخصيتين في وسائل الإعلام الخلية الحية للحصول على ~ 10 أزواج من الخصيتين الكبار Drosophila.
   1. تشريح الذباب تحت مجهر تشريح في طبق تشريح باستخدام ملقط ناعم.
      ملاحظة: سلالة Drosophila melanogaster (ذبابة الفاكهة) يحمل UAS-α-Tubulin-GFP transgene يقودها سائق الخلايا الجرثومية المبكر نانوس-Gal4.
   2. توليد السلالات التالية طرق في Drosophila melanogaster باستخدام التكنولوجيا CRISPR-Cas9: لامين-mCherry (علامة C-المحطة الطرفية) وCENP-A-Dendra2-CENP-A [علامة في الموقع الداخلي (بين 118-119 كودون)].
      ملاحظة: في حين أن هناك حاجة إلى اختبار واحد فقط من نوعية ممتازة لكل تجربة، وتركيب عدد كاف من الأنسجة (15-20) أو الخلايا سوف تضمن أنه سيكون هناك عينة صحية واحدة على الأقل مع إشارات مضان ممتازة للتصوير الفاصل الزمني.
2. غسل الخصيتين مرتين في وسائط الخلايا الحية في طبق تشريح.
   1. استخدام ماصة لإضافة وسائل الإعلام تليها إزالة وسائط الخلية الحية كخطوة الغسيل.
   2. إزالة الأنسجة الزائدة باستخدام ملقط. أي نسيج إضافي سيتدخل في التصوير.
      ملاحظة: لا تستخدم المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) لغسلها، لأنها قد تؤثر على ديناميكيات مكونات خلوية معينة.
3. أضف 100-150 ميكرولتر من وسائط الخلايا الحية إلى الطبق (أعد في الخطوة 2.1) ووزعه على السطح الزجاجي باستخدام طرف ماصة. انتشار وسائل الإعلام على السطح سوف تسمح للأنسجة التمسك بشكل صحيح إلى الطبق.
4. نقل الخصية إلى الطبق باستخدام ملقط غرامة وتقديمهم إلى وسط الطبق (الشكل 1A-ب).
   ملاحظة: تجنب نقل الحطام لأنه سيتداخل مع التصوير وقد يقلل من جودة الصورة.
5. إزالة وسائل الإعلام الزائدة الخلية الحية (ترك ما يقرب من 10 ميكرولتر من وسائل الإعلام) للسماح للأنسجة لتسطيح والتمسك بشكل صحيح إلى الطبق. قم بتنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب تجفيف العينة.
6. ضع الغشاء قبل الرطب (المعد في الخطوة 2.2 و 2.3) فوق الخصية(الشكل 1A-c).
7. وضع 2-3 الأوزان البلاستيكية الصغيرة (أعدت في الخطوة 2.4) على الغشاء بحيث العينة لن تطفو وإضافة بسرعة 100-150 ميكروغرام من وسائل الإعلام الخلية الحية (الشكل 1A-D).
   ملاحظة: إضافة الوسائط بسرعة وبلطف يضمن أن العينة لن تجف أو تصبح المشردين.
8. ضع الحلقة البلاستيكية (المعدة في الخطوة 2.5) على الجانب المرتفع من الطبق(الشكل 1B-a).
9. ضع غطاء 22 مم × 22 مم أعلى الحلقة (الشكل 1B-b). هذا يولد غرفتين.
10. خذ قطعة من ورق الأنسجة، وخففها بالماء، ثم قم بتدليبها ووضعها على الغطاء، لإنشاء غرفة رطبة(الشكل 1B-c). أغلق غطاء الطبق(الشكل 1B-D)وابدأ تصوير الخلايا الحية.
    ملاحظة: إذا كان العينة حساسة للضوء، نفذ القسم 3 في الظلام.

4. تصوير الخلايا الحية من الخلايا الجذعية الجرثومية الذكور Drosophila (GSC) في الموقع

1. ضع الطبق تحت المجهر فائق الدقة وآمنه بمشابك المرحلة.
   1. فتح برنامج التصوير، بدوره على ضوء المرسلة، واستخدام الهدف 63x للتركيز على النسيج الخصية مع مقبض التركيز.
      ملاحظة: إذا كان هناك صعوبة في تحديد موقع عينة مع الهدف 63x ثم أولا استخدام الهدف 40x أو 20x قبل التبديل إلى 63x.
   2. تشغيل الليزر، انقر فوق لايف،والعثور على GSC مع الموقف الأمثل وحالة. تجنب الخصية التي تحتوي على إشارة مضان منخفضة أو التي تحتوي على المحور (المتخصصة) بعيدا عن السطح.
      ملاحظة: في الخصيتين Drosophila، يتم إرفاق GSCs بلوحة الوصل.
2. ضبط التركيز ل GSCs وتحديد الإعدادات الصحيحة للعينة، بما في ذلك طاقة الليزر، والإلكترونات ضرب (EM) كسب، في المتوسط، والتكبير لوضع Airyscan. استخدم الإعدادات التالية كمثال لاختبارات Drosophila التي تعبر عن EGFP الموسومة α-tubulin في الخلايا الجرثومية في المراحل المبكرة.
   1. تعيين حجم الإطار بين 512 × 512 بكسل و 1024 × 1024 بكسل عن طريق النقر فوق حجم الإطار.
   2. تعيين متوسط الإطار إلى 1 أو 2 بالنقر فوق متوسط.
      ملاحظة: زيادة حجم الإطار (>1024 × 1024 بكسل) وأداء متوسط أكثر (أي أكثر من 2) يمكن أن يؤدي إلى photobleaching أو phototoxicity.
   3. تعيين طاقة الليزر إلى 1٪-2٪ عن طريق النقر على الليزر.
      ملاحظة: قد يؤدي تعزيز طاقة الليزر أيضا إلى bleaching ضوئية أو السمية الضوئية.
   4. تعيين مكاسب EM أدناه المستوى الموصى به (< 800) بالنقر فوق كسب رئيسي.
      ملاحظة: قد يؤدي زيادة EM إلى إنشاء قطع أثرية.
   5. قم بتكبير المنطقة أو الخلية ذات الاهتمام لتقليل وقت الحصول على الصورة وتقليل bleaching. وهذا يسمح أيضا للعينة البقاء على قيد الحياة لفترة أطول.
3. بدء التقاط الصورة الفاصل الزمني باستخدام وضع Airyscan بالنقر فوق بدء التجربة.
   1. قبل النقر فوق بدء التجربة،تأكد من تكوين عملية الاستحواذ بالشكل الأمثل.
   2. إذا كان يعرض تحذيرا مع إشعار "لم يتم تكوين اقتناء Airyscan على النحو الأمثل"، ثم انقر فوق الأمثل في مقطع حجم الإطار، انقر فوق الأمثل في مقطع z-المكدس، وانقر فوق الأمثل لمسح المقطع المنطقة (الحد الأدنى من 1.3 التكبير مطلوب للتصوير فائقة الدقة).
4. تحسين الفاصل الزمني وعدد شرائح z ومدة التصوير الفاصل الزمني وفقا للتصميم التجريبي ونوع العينة ، بحيث لا يتم اختراق جودة الصورة ولن يتم القبض على الخلايا في مراحل معينة من دورة الخلية.
   1. وكمثال على ذلك، تظهر في الخطوات التالية معلمات التصوير الفاصل الزمني لاختبارات دروسوفيلا التي تعبر عن α-توبولين الموسومة ب EGFP في الجرثومة المبكرة.
   2. لأكثر من 5 ساعة التصوير الفاصل الزمني، صورة على فاصل زمني 10 دقيقة مع 1٪ قوة الليزر واتخاذ ما يصل إلى 30 ض شرائح في كل نقطة زمنية.
   3. بالنسبة للعمليات الخلوية الديناميكية للغاية، مثل ديناميكيات microtubule، قم بتعيين فاصل زمني قدره دقيقتان بين النقاط الزمنية، وأجر تصويرا بفاصل زمني يتراوح بين 1-2 ساعة بقوة ليزر 1٪، واأخذ ما يصل إلى 30 شريحة z في كل نقطة زمنية.
   4. بالنسبة للأحداث الخلوية النادرة، مثل ديناميكيات الكروماتين الطوروفي المبكر (أحداث 2-3 دقائق)، قم بتعيين تصوير الخلايا الحية بفاصل زمني قدره دقيقة واحدة بين النقاط الزمنية، وأجر التصوير بفارق زمني قدره 30 دقيقة عند طاقة ليزر 1٪، واأخذ ما يصل إلى 30 شريحة z في كل نقطة زمنية.
      ملاحظة: قد تختلف هذه المعلمات لعينات مختلفة، لذلك سوف تكون هناك حاجة إلى التغيير للاستخدام الأمثل للعينة محددة.
5. قم إما بالتصوير الفاصل الزمني أو التصوير باللقطات الحية، اعتمادا على حساسية العينة والتصميم التجريبي.
   ملاحظة: الفيلم القصير هو 15-30 دقيقة، وفيلم طويل هو أكثر من 5 ساعة.
6. إذا كانت العينة حساسة جدا ولا يمكن دراستها عن طريق التصوير الفاصل الزمني باستخدام مجهر فائق الدقة ، كما هو الحال في كثير من الأحيان مع Drosophila MALE GSCs ، قم بإجراء لقطة حية فائقة الدقة (SRLS) للعينة في مراحل دورة الخلية المختلفة (كما هو موضح في الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4).
   1. إذا كان يتم التقاط حدث بيولوجي نادر الخلية أو البروتين من الفائدة لديه مستوى التعبير منخفضة، ثم تنفيذ SRLS.
   2. لSRLS، والعثور على خلية في مرحلة دورة الخلية محددة كنت مهتما. على سبيل المثال، إذا كان التركيز على ربط microtubules-kinetochore، ثم استخدام خلية في بروميتافاس أو ميتافيزي.
      ملاحظة: سيساعد هذا في ضمان حصولك على صورة عالية الجودة للخلية ذات الاهتمام في الوقت المناسب دون المخاطرة بالسمية الضوئية للعينة أو تبييض الفلوروفوريس، والتي قد تحدث خلال فيلم أطول.
   3. إذا كنت تستخدم SRLS، قم بتصوير مراحل مختلفة لدورة الخلية ذات أهمية عبر خلايا متعددة ورتب هذه الصور بترتيب زمني.
      ملاحظة: يمكن استخدام هذا لبناء ترتيب زمني للأحداث مع تعظيم صحة الإشارة والأنسجة ، للحصول على دقة زمنية ممتازة للحدث لعينات حساسة بشكل خاص أو عينات ذات إشارة منخفضة.

5. تجهيز Airyscan من الصور الخلية الحية

1. بعد الحصول على الصورة باستخدام برنامج التصوير، حدد معالجة، انقر فوق دفعة، ثم حدد معالجة Airyscan.
   1. حدد الصور التي ستتم معالجتها ثم انقر فوق تشغيل/عملية للحصول على الصور فائقة الدقة.
   2. تنفيذ المعالجة باستخدام الإعداد الافتراضي.
      ملاحظة: لن تعمل معالجة Airyscan إلا إذا تم إنشاء إعدادات التصوير بشكل صحيح للتصوير Airyscan.

النتائج

يوفر تصوير الخلايا الحية خارج حدود الحيود في أنسجة دروسوفيلا، وخاصة بالنسبة ل GSCs، فرصة للتحقيق في ديناميكيات الأحداث دون الخلوية في سياق تطور دورة الخلية. في الآونة الأخيرة ، أظهرت دراسة تستخدم هذا البروتوكول أن أنشطة microtubule في مركز الأم مقابل سنتروسوم الابنة غير متماثلة زمنيا في GSCs<...

Discussion

توفر طرق الفحص المجهري فائقة الدقة دقة مكانية عالية يصل إلى 10s من نانومتر^4،5،6. تسمح طرق الفحص المجهري STORM و PALM بدقة تصل إلى 20 إلى 50 نانومتر (دقة XY)، في حين يوفر المجهر STED دقة تتراوح بين 20 و100 نانومتر (دقة XY). الدقة المكانية للميكروسكوبي SIM يقتصر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A