JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف هنا تحليلا بسيطا تجانس مقصورة الخلية B المناعية مورين في أنسجة الصفاق والطحال ونخاع العظام عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن تكييف البروتوكول وتوسيعه ليشمل أنسجة الماوس الأخرى.

Abstract

وقد ميزت دراسات مستفيضة تطور وتمايز خلايا مورين B في الأعضاء اللمفاوية الثانوية. تم عزل الأجسام المضادة التي تفرزها الخلايا B وتطويرها إلى علاجات راسخة. التحقق من صحة تطور خلايا مورين B ، في سياق الفئران المعرضة للمناعة الذاتية ، أو في الفئران ذات الجهاز المناعي المعدل ، هو عنصر حاسم في تطوير أو اختبار العوامل العلاجية في الفئران وهو استخدام مناسب لقياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام المعلمات الخلوية الراسخة لتدفق الخلايا B لتقييم تطور الخلية B في الصفاق المورين ونخاع العظام والطحال ، ولكن يجب الالتزام بعدد من أفضل الممارسات. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكمل التحليل الخلوي التدفقي لمقصورات الخلية B قراءات إضافية لتطوير الخلية B. البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية يمكن أن تعزز فهمنا للنوع البري ، ونماذج الماوس المعرضة لل المناعة الذاتية وكذلك الفئران المؤنسة التي يمكن استخدامها لتوليد الأجسام المضادة أو الجزيئات الشبيهة بالأجسام المضادة كعلاجات.

Introduction

أصبحت الأجسام المضادة أحادية النسيلة على نحو متزايد العلاج الاختياري للعديد من الأمراض البشرية لأنها تصبح جزءا من الطب السائد1،2. لقد سبق لنا أن وصف الفئران المعدلة وراثيا التي تنتج بكفاءة الأجسام المضادة التي تؤوي مناطق متغيرة بشرية بالكامل مع ثوابت IgH الماوس3،4. في الآونة الأخيرة ، وصفنا الفئران المعدلة وراثيا التي تنتج جزيئات تشبه الأجسام المضادة التي لها مستضد ملزم متميز5. وتفرز الأجسام المضادة من قبل الخلايا B وتشكل أساس الحصانة الفكاهية التكيفية. هناك نوعان متميزان من الخلايا B، B-1 و B-2. في الثدييات ، تنشأ خلايا B-1 في كبد الجنين وتثري في الأنسجة المخاطية والتجاويف الجنبية والبريتونية بعد الولادة ، في حين تنشأ خلايا B-2 في كبد الجنين قبل الولادة وبعد ذلك في نخاع العظام (BM). يتم إثراء خلايا B-2 في الأعضاء اللمفاوية الثانوية بما في ذلك الطحال والدم6,7,8. في BM، يبدأ السلف الدموي B-2 في التفريق إلى الخلايا الموالية ل B عند بدء إعادة ترتيب سلسلة Ig mu الثقيلة9,10. إعادة ترتيب ناجحة من سلسلة Ig الثقيلة وتجميعها في مستقبلات الخلية ما قبل B (قبل BCR)، جنبا إلى جنب مع الإشارات والتوسع التكاثري، يؤدي إلى التمايز إلى خلايا ما قبل B. بعد خلايا ما قبل B إعادة ترتيب كابا Ig (Igκ)، أو إذا كانت غير منتجة، Ig lambda (Igλ) سلاسل الضوء، فإنها زوج مع μ سلسلة ثقيلة، مما أدى إلى التعبير السطحي IgM BCR. من المهم الإشارة إلى أن التعبير السطحي IgM معروف بأنه ينخفض في ظل ظروف النشاط التلقائي ، مما يساهم في تحمل الذات في الخلايا B غير المستجيبة وظيفيا أو التحسسية 11،12. ثم تدخل الخلايا B غير الناضجة مرحلة انتقالية ، حيث تبدأ في التعبير المشترك عن IgD والهجرة من BM إلى الطحال. في الطحال ، يزيد تعبير IgD أكثر وتنضج الخلايا إلى مرحلة ثانية من الخلايا B الانتقالية ، يليها الانتهاء من حالة نضجها وتطورها إلى إما منطقة هامشية (MZ) أو خلايا الجريبية (Fol) 13،14،15. في الفئران البالغة ، في بيئة غير مريضة ، لا يزال عدد الخلايا B الناضجة ثابتا على الرغم من توليد 10-20 مليون خلية B غير ناضجة يوميا في BM. من هذه، ثلاثة في المئة فقط تدخل بركة من الخلايا B ناضجة. حجم مقصورة الخلية الطرفية B مقيد بموت الخلية، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدة عوامل بما في ذلك التفاعل الذاتي والنضج غير المكتمل16,17,18. وقد استخدم تحليل التدفق الخلوي على نطاق واسع لتوصيف وعدد العديد من المقصورات الفرعية للخلايا المناعية في البشر والفئران. في حين أن هناك بعض أوجه التشابه بين الإنسان ومقصورات الخلية B مورين، ينطبق هذا البروتوكول فقط على تحليل خلايا مورين B. تم تطوير هذا البروتوكول بهدف كتابة الفئران المعدلة وراثيا ، لتحديد ما إذا كان التلاعب الجيني سيغير تطور الخلية B. كما كان قياس التدفق الخلوي شائعا بشكل كبير في العديد من التطبيقات الإضافية ، بما في ذلك في قياس تنشيط الخلية ، والوظيفة ، والانتشار ، وتحليل الدورة ، وتحليل محتوى الحمض النووي ، وموت الخلايا المبرمج وفرز الخلايا 1920.

قياس التدفق الخلوي هو الأداة المفضلة لتوصيف مختلف مقصورات الخلايا الليمفاوية في الفئران والبشر ، بما في ذلك في الأعضاء المعقدة مثل الطحال ، BM والدم. نظرا لواشف الأجسام المضادة الخاصة بالماوس المتاحة على نطاق واسع لقياس التدفق الخلوي ، يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق ليس فقط في البروتينات السطحية للخلايا ولكن أيضا البروتينات الدهنية داخل الخلايا والسيتوكينات ، وكذلك readouts21 الوظيفية. هنا نحن نبين كيف يمكن استخدام كاشفات قياس التدفق الخلوي لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا B عند نضجها والتمييز في الأعضاء اللمفاوية الثانوية. بعد التحسين الأمثل لظروف تلطيخ، والتعامل مع العينات، وإعداد الصك الصحيح والحصول على البيانات، وأخيرا تحليل البيانات، يمكن استخدام بروتوكول لتحليل التدفق الخلوي الشامل لمقصورة الخلية B في الفئران. ويستند هذا التحليل الشامل على تسمية عقود من العمر وضعت من قبل هاردي وزملاؤه، حيث يمكن تقسيم تطوير خلايا BM B-2 إلى كسور مختلفة (كسر) اعتمادا على تعبيرهم عن B220، CD43، BP-1، CD24، IgM وIgD22. هاردي وآخرون، أظهرت أن B220 + CD43 BM B الخلايا يمكن تقسيمها إلى أربع مجموعات فرعية (كسر A-C') على أساس BP-1 و CD24 (30F1) التعبير، في حين B220+ CD43-(dim to neg) BM B الخلايا يمكن حلها في ثلاث مجموعات فرعية (كسر D-F) على أساس التعبير التفاضلي من IgD وسطح IgM23. يتم تعريف الكسر A (خلايا ما قبل pro-B) على أنه BP-1- CD24 (30F1)-، يتم تعريف الكسر B (الخلايا المؤيدة ل B المبكرة) على أنه BP-1- CD24 (30F1)+، ويتم تعريف الكسر C (الخلايا المتأخرة المؤيدة ل B) على أنه BP-1+ CD24 (30F1)+، ويتم تعريف الكسر C (خلايا ما قبل B المبكرة) على أنه BP-1+ وCD24high. وعلاوة على ذلك، يتم تعريف الكسر D (خلايا ما قبل B) على أنه خلايا B220+ CD43- IgM-B، ويتم تعريف الكسر E (الخلايا B التي تم إنشاؤها حديثا، والجمع بين الخلايا غير الناضجة والانتقالية) على أنه خلايا B220+ CD43- IgM+ B والكسر F (الخلايا B الناضجة المعاد تدويرها) على أنها خلايا B220high CD43- IgM+ B. في المقابل، يمكن تقسيم غالبية الخلايا B السذاجة الموجودة في الطحال إلى خلايا B ناضجة (B220+ CD93-) وخلايا انتقالية (T1، T2، T3) اعتمادا على التعبير عن CD93 و CD23 و IgM. يمكن حل الخلايا B الناضجة إلى مناطق هامشية ومجموعات فرعية جريبية استنادا إلى التعبير عن IgM و CD21/CD35 ، ويمكن تقسيم المجموعات الفرعية الجريبية إلى نوع جريبي ناضج I ومجموعات فرعية من النوع B الجريبي اعتمادا على مستوى التعبير السطحي IgM و IgD24. هذه المجموعات الخلية B splenic التعبير عن سلسلة الضوء في الغالب Igκ. وأخيرا، تم وصف مجموعات خلايا B-1 B، التي تنشأ في كبد الجنين وتوجد بشكل رئيسي في التجاويف الصفاقية والجنبية للفئران البالغة، في الأدبيات. يمكن تمييز هذه الخلايا البريتونية B من الخلايا B-2 B الموصوفة سابقا بسبب افتقارها إلى تعبير CD23. ثم يتم تقسيمها إلى مجموعات B-1a أو B-1b ، مع تعريف الأول بوجود CD5 والثاني بغيابه25. سلفات الخلايا B-1 وفيرة في كبد الجنين، ولكن لا توجد في BM الكبار. في حين أن خلايا B-1a و B-1b تنشأ من أسلاف مختلفين ، إلا أنهما تزرعان التسوس البريتوني والبليبي24. وعلى النقيض من خلايا B-2، فإن خلايا B-1 قادرة بشكل فريد على التجديد الذاتي ومسؤولة عن إنتاج الأجسام المضادة الطبيعية IgM.

يمكن أن تنشأ عيوب في تطور الخلية B في كثير من الحالات، بما في ذلك أوجه القصور في مكونات BCR26،27، اضطرابات جزيئات الإشارات التي تؤثر على BCR قوة الإشارة14،28،29، أو تعطيل السيتوكينات التي تعدل بقاء الخلية B30،31 . وقد ساهم تحليل تدفق قياس الخلايا من مقصورات اللمفاوية في توصيف كتل تطوير الخلية B في هذه الفئران وغيرها الكثير. ميزة واحدة من تحليل تدفق الخلايا من مقصورات اللمفاوية هو أنه يوفر القدرة على إجراء قياسات على الخلايا الفردية التي تم الحصول عليها من الأنسجة الحية منفصلة. ويتيح توافر الكواشف في نطاق متوسع من الفلوروفوريس إجراء تحليل متزامن لمعلمات متعددة ويمكن من تقييم عدم تجانس الخلايا باء. وعلاوة على ذلك، فإن تعداد الخلايا B عن طريق تحليل التدفق الخلوي يكمل المقايسات المناعية الأخرى مثل أساليب الكيمياء المناعية التي تصور توطين الخلايا داخل الأعضاء اللمفاوية، والكشف عن مستويات الأجسام المضادة المتداولة كمقياس للمناعة الفكاهية، فضلا عن اثنين من المجهر الفوتون لقياس استجابات الخلية B في المكان الحقيقي والوقت32.

Protocol

أشرفت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) على جميع دراسات الماوس ووافقت عليها. أجريت التجربة على أنسجة من ثلاثة فئران أنثى C57BL/6J (17 أسبوعا من العمر) من مختبرات جاكسون. يتجدد جميع الأجسام المضادة قبل بدء التجربة لتحديد التركيز المثالي. عند استخدام حبات التعويض للتعويض بلون واحد، تأكد من أنها وصمة عار كما مشرق أو أكثر إشراقا من العينات الخاصة بك. احتفظ بجميع المخازن المؤقتة والأجسام المضادة والخلايا على الجليد أو عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. بعد إضافة صبغة البقاء، قم بإجراء جميع الخطوات والحضانات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية إما في الإضاءة المنخفضة أو في الظلام.

1. حصاد الخلايا البريتونية وعزل خلية واحدة

  1. قتل الماوس باستخدام ثاني أكسيد الكربون أو وفقا للبروتوكول المعتمد.
  2. وضع الماوس على ظهره، رذاذ مع الإيثانول 70٪، وقطع الجلد البطن الخارجي مع مقص، مع الحرص على عدم قطع الصفاق.
  3. حقن 3 مل من الجليد الباردة غسل العازلة (0.5٪ ألبوم مصل البقر (BSA) في DPBS [vol/vol]) في تجويف الصفاق مع حقنة 3 مل مزودة إبرة قياس 25.
  4. تدليك بلطف الصفاق مع أطراف الأصابع.
  5. كرر الخطوتين 1.3 و1.4.
  6. أدخل حقنة سعة 3 مل مزودة بإبرة 18 جم من خلال الصفاق، مع الحرص على تجنب الأعضاء والدهون.
  7. استخراج العازلة غسل، التي تحتوي الآن على الخلايا البريتونية، ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد.
  8. كرر الخطوتين 1.3 و1.4.
  9. قطع ثقب صغير في الصفاق في حين عقد مع ملاقط.
  10. إدراج ماصة نقل المتاح في الحفرة وجمع العازلة غسل المتبقية، مرة أخرى تجنب الدهون والأعضاء.
  11. نقل الخلايا البريتونية المتبقية التي تم جمعها إلى أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد.
    ملاحظة: تجاهل العينة إذا كان تلوث الدم واضحا.
  12. احتضان الخلايا على الجليد حتى اكتمال استخراج الطحال والعظام.
  13. طرد الخلايا في 300 × ز لمدة 8 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق العملاق.
  14. Resuspend بيليه الخلية في 1 مل من العازلة غسل.
  15. تصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي نظيف 15 مل على الجليد.
  16. تحديد تركيز الخلية باستخدام أداة عداد الخلية أو مقياس الدم.

2. حصاد الطحال وعزل خلية واحدة

  1. وضع الماوس على بطنه وقطع من خلال الصفاق على الجانب الخلفي الأيسر باستخدام مقص نظيفة. قطع الطحال، وإزالة الدهون والأنسجة الضامة.
  2. نقل الطحال إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل الدقيقة التي تحتوي على 1 مل من عازلة غسل على الجليد.
  3. احتضان الطحال على الجليد حتى اكتمال استخراج العظام.
  4. نقل الطحال إلى أنبوب التفكك الآلي مع 5 مل من العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء. وضع أنبوب على أداة فصاسير الأنسجة وتفكك لمدة 60 ق لإنشاء تعليق خلية واحدة.
    ملاحظة: يجوز أيضا استخدام طرق روتينية أخرى للحصول على تعليق الطحال أحادي الخلية مثل التحطيم بين الشرائح الزجاجية المتجمدة في مخزن الغسيل المؤقت. إذا تم استخدام طريقة أخرى من التفكك، اتبع الانفصال مع الطرد المركزي، والطموح، ومن ثم إعادة الإنفاق في 5 مل من العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء قبل الاستمرار في الخطوة 2.5.
  5. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  6. إضافة 10 مل من 4 °C غسل العازلة التي تحتوي على EDTA 2mM.
  7. نقل إلى أنبوب نظيف مخروطي 15 مل.
  8. طرد الخلايا في 300 × ز لمدة 8 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق العملاق.
  9. Resuspend بيليه الخلية في 5 مل من 4 درجة مئوية غسل العازلة.
  10. تصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي نظيف 15 مل على الجليد.
  11. تحديد تركيز الخلية باستخدام أداة عداد الخلية أو مقياس الدم.

3. حصاد BM وعزل خلية واحدة

  1. إزالة الجلد من النصف السفلي من جسم الماوس. تقليم العضلات الزائدة من الساق. إزالة الساق بأكملها مع مقص، مع الحرص على عدم قطع عظم الفخذ. تنظيف عظم الفخذ والساق عن طريق إزالة العضلات المتبقية, الدهون, والقدمين.
  2. نقل العظام إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل تحتوي على 1 مل من عازلة غسل على الجليد.
  3. ثقب الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق 0.5 مل، وترك حفرة صغيرة بما يكفي لعظام الساق لا تبرز. أدخل أنبوب 0.5 مل في أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 1.5 مل. قص قبالة نهاية عظم الفخذ والساق قريبة من الركبة ووضع نهايات قطع تواجه أسفل في أنبوب 0.5 مل.
  4. طرد مركزي الخلايا في 6,780 x g لمدة 2 دقيقة في 4 °C.
  5. Resuspend بيليه الخلية في 1 مل من خلايا الدم الحمراء تحلل العازلة ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 3 مل إضافية من العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء.
  6. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  7. إضافة 10 مل من 4 °C غسل العازلة التي تحتوي على EDTA 2mM.
  8. طرد الخلايا في 300 × ز لمدة 8 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق العملاق.
  9. Resuspend بيليه الخلية في 3 مل من 4 درجة مئوية غسل العازلة.
  10. تصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي نظيف 15 مل على الجليد.
  11. تحديد تركيز الخلية باستخدام أداة عداد الخلية أو مقياس الدم.

4. وصمة عار الخلايا وإعداد التعويض

  1. Aliquot 106 خلايا من كل نوع الخلية من كل إلى 96 جيدا يو لوحة أسفل.
    1. تأكد من تضمين ما يكفي من الآبار لجميع العينات والضوابط، بما في ذلك وصمة عار كاملة، مضان ناقص واحد (FMO)، غير ملطخة، وأخيرا التعويض اختياري لون واحد لكل الفلوروفور المستخدمة.
    2. بالنسبة إلى لوحة نضوج BM ولوحة نضوج الطحال ، فإن خلايا aliquot في بئرين ، 106 خلايا لكل بئر ، لكل عينة وصمة عار كاملة. بالنسبة لعناصر التحكم في قابلية التعويض ذات اللون الواحد، أضف 2 × 106 خلايا من كل نوع خلية إلى الآبار الفردية.
  2. طرد مركزي لوحة في 845 × ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية. decant supernatant عن طريق عكس بسرعة ونفض الغبار لوحة على بالوعة، مع الحرص على عدم عبر تلوث الآبار.
  3. إعادة إنفاق الخلايا في 200 ميكرولتر من DPBS (بدون BSA أو FBS). هذه الخطوة مهمة لإزالة البروتين قبل تلطيخ مع صبغة قابلية البقاء على قيد التشغيل أمين رد الفعل.
  4. كرر الخطوتين 4.2 و4.3.
  5. كرر الخطوة 4.2.
  6. Resuspend الخلايا في 100 μL صبغة البقاء المخفف 1:1،000 في DPBS.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم الخلايا للتعويض بلون واحد، لا تقم بإضافة صبغة صلاحية لتلك الآبار.
    1. لكل مجموعة وصمة عار، وترك العديد من الآبار غير الملطخة لعينة غير ملطخة تماما وأي ضوابط أخرى قد تحتاج إليها.
    2. لكل مجموعة وصمة عار، وترك بئر إضافية غير ملطخة للسيطرة FMO البقاء.
    3. لضوابط التعويض عن البقاء لون واحد: Resuspend الخلايا 2 × 106 ، aliquoted في الخطوة 4.1، في 200 ميكرولتر من صبغة الجدوى المخففة. نقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق، والخلايا الحرارية لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية، ونقل 100 ميكرولتر من الخلايا التي تقتلها الحرارة مرة أخرى إلى البئر الأصلي مع الخلايا الحية المتبقية 100 ميكرولتر.
  7. احتضان الخلايا عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، محمية من الضوء، لمدة 30 دقيقة.
  8. طرد مركزي لوحة في 845 × ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية. decant supernatant عن طريق عكس بسرعة ونفض الغبار لوحة على بالوعة، مع الحرص على عدم عبر تلوث الآبار.
  9. إعادة إنفاق الخلايا في 200 ميكرولتر من DPBS (بدون BSA أو FBS).
  10. كرر الخطوتين 4.8 و4.9.
  11. كرر الخطوة 4.8.
  12. Resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من كتلة Fc المخفف 1:50 (التركيز النهائي = 10 ميكروغرام / مل) في العازلة وصمة عار (0.5٪ BSA في DPBS [vol/vol]).
    1. للخلايا البريتونية - إضافة أيضا 5 ميكرولتر من مانع أحادية الخلية للحد من تلطيخ غير محددة.
  13. احتضان الخلايا في 4 درجة مئوية، محمية من الضوء، لمدة 15 دقيقة.
  14. إعداد يمزج ماجستير وصمة عار كاملة وFMOs في العازلة وصمة عار لحجم النهائي من 100 ميكرولتر لكل 106 خلايا. راجع الجدول 1-الجدول 4 لقوائم الأجسام المضادة.
    ملاحظة: يتم إجراء FMOs عن طريق تضمين جميع الأجسام المضادة في مجموعة وصمة عار باستثناء واحد. إعداد FMO لكل الأجسام المضادة في مجموعة وصمة عار. عندما تحتوي مجموعة البقع على العديد من الأصباغ الرائعة ، استبدل 50 ميكرولتر من العازلة البقعة الرائعة لحاجز البقع لكل عينة
  15. دون إزالة كتلة FC، إضافة 100 ميكرولتر من يمزج وصمة عار كاملة وFMOs إلى آبار مختارة.
  16. إعداد عناصر تحكم التعويض بلون واحد لكل الأجسام المضادة في مجموعة وصمة عار.
    1. إذا كان استخدام حبات التعويض اتبع توجيهات التصنيع للاستخدام.
    2. إذا كنت تستخدم الخلايا، أضف الأجسام المضادة ذات الثزاز إلى 106 خلايا، محفوظة سابقا في الخطوة 4.6.1 دون صبغة البقاء، في 100 ميكرولتر من البقع العازلة. إذا كانت جميع الخلايا في العينة إيجابية لعلامة معينة، فخصم الخلايا غير الملطخة لاستخدامها عند الحصول على بيانات التعويض على مقياس التدفق الخلوي.
  17. احتضان الخلايا والخرز في 4 درجة مئوية، محمية من الضوء، لمدة 30 دقيقة.
  18. طرد مركزي لوحة في 845 × ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية. decant supernatant عن طريق عكس بسرعة ونفض الغبار لوحة على بالوعة، مع الحرص على عدم عبر تلوث الآبار.
  19. Resuspend الخلايا والخرز في 200 ميكرولتر من العازلة وصمة عار.
  20. كرر الخطوتين 4.18 و4.19 مرتين.
  21. كرر الخطوة 4.18.
  22. لإصلاح العينات للتحليل في غضون 48 ساعة، وإعادة الإنفاق الخلايا والخرز في 200 ميكرولتر من 2٪ paraformaldehyde في DPBS.
    تنبيه: Parafomaldehyde هو خطر صحي خطير واشتعال. راجع ورقة بيانات Safty قبل الاستخدام.
  23. احتضان الخلايا والخرز في 4 درجة مئوية، محمية من الضوء، لمدة 30 دقيقة.
  24. كرر الخطوتين 4.18 و4.19 مرتين.
  25. ضع لوحة فلتر فوق لوحة نظيفة 96 جيدا U-bottom. باستخدام ماصة متعددة، نقل كل عينة إلى بئر من لوحة التصفية.
  26. الطرد المركزي لوحة التصفية-96 جيدا الإعداد لوحة U-أسفل في 845 × ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية. إزالة لوحة التصفية وdecant supernatant عن طريق عكس بسرعة ونفض الغبار لوحة على بالوعة، مع الحرص على عدم عبر تلوث الآبار.
  27. للوحة نضوج BM والطحال resuspend الخلايا الملطخة بالكامل في 100 ميكرولتر من العازلة وصمة عار. الجمع بين الآبار 2 لكل في 1 جيدا. إعادة إنفاق اللوحات المتبقية، FMOs، والضوابط في 200 ميكرولتر من العازلة وصمة عار.
  28. احتضان الخلايا الثابتة والخرز في 4 درجة مئوية، محمية من الضوء، بين عشية وضحاها.

5. تدفق اكتساب البيانات الخلوية

  1. تهيئة ومراقبة الجودة تدفق السيتومتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. قم بتحميل القالب الخاص بكل لوحة.
  3. قبل تسجيل البيانات، تأكد من أن جميع الأحداث لكل عينة على نطاق واسع ومرئية على مخططات النقاط.
  4. ضوابط تعويض قياسية لكل لوحة وصمة عار باستخدام تعويض وصمة عار واحدة أعدت في الخطوة 4.16. تعيين بوابات موجبة وسلبية لكل عينة. هل لديك البرنامج حساب مصفوفة التعويض.
  5. ابدأ في الحصول على العينة الأولى، وتأكد من تعيين البوابات بشكل مناسب.
  6. تعيين الجهاز لتسجيل ما لا يقل عن 50،000 أحداث الخلية B للوحة الخلية B الصفاق والطحال Igκ ولوحة Igλ؛ 150,000 أحداث الخلية B لفريق النضج BM; و 300,000 أحداث الخلية B للوحة نضوج الطحال.
  7. لكل لوحة وصمة عار، تشغيل وتسجيل عينات ملطخة بالكامل لكل حيوان، عينة غير ملطخة، وFMOs.

6. تحليل البيانات

  1. تابع تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي. اتبع استراتيجيات الصياغة المبينة في الشكل 1، الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4. 

النتائج

هنا نقدم استراتيجية gating لتميز تطوير الخلية B في الصفاق الماوس، BM والطحال. يتم تشكيل أساس التحليل حول مفهوم تلطيخ مع صبغة البقاء، ثم gating من doublets على أساس إلى الأمام مبعثر المنطقة (FSC-A) وإلى الأمام مبعثر الارتفاع (FSC-H)، وأخيرا gating من الحطام عن طريق اختيار الخلايا وفقا لخصائصه?...

Discussion

وقد مكن تحليل التدفق الخلوي للأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية من تحديد تعداد الخلايا B الفرعية في الفئران والبشر في وقت واحد منذ ثمانينيات القرن العشرين. وقد استخدم كمقياس للحصانة الفكاهية ويمكن تطبيقه كذلك لتقييم وظائف الخلية B. تستفيد هذه الطريقة من توافر الكاشف لتقييم المراحل المختلفة ...

Disclosures

جميع المؤلفين هم من موظفي ومساهمي شركة ريجينرون للأدوية

Acknowledgements

نشكر ماثيو سليمان على قراءته النقدية للمخطوطة. كما نشكر أقسام عمليات Vivarium و Flow Cytometry Core في ريجينرون لدعمها هذا البحث.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL safe-lock Eppendorf tubesEppendorf 223636110.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes Eppendorf 223641111.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes Corning 35209715 mL conical tube
18 gauge needleBD305196
25 gauge needleBD 305124
3 mL syringeBD309657
70 mM MACS SmartStrainer Miltenyi Biotec 130-110-916 70 mM cell strainer
96 well U bottom plate VWR10861-564
ACK lysis buffer GIBCO A1049201red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter PlatePall Corporation8027filter plate
B220eBiosciences17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κBD552843compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κBD552844compensation beads
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich A8577BSA
BP-1BD740882
Brilliant Stain BufferBD566349brilliant stain buffer
C-KitBD564011
CD11bBD563168
CD11bBioLegend101222
CD19BD560143
CD21/35BD562756
CD23 BD740216
CD24 (HSA)BioLegend138504
CD3BD561388
CD3BioLegend100214
CD43BD553270
CD43BioLegend121206
CD5BD563194
CD93BD740750
CD93BioLegend136504
DPBS (1x)ThermoFisher14190-144DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506ThermoFisher65-0866-14viability dye
Extended Fine Tip Transfer PipetteSamco233disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometerBDcustom orderflow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)BD553142Fc block
FlowJoFlowjoflow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-096-334automated dissociation tube 
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-095-937tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G)BioLegend108422
IgDBioLegend405710
IgMeBiosciences25-5790-82
KappaBD550003
LambdaBioLegend407308
paraformaldehyde, 32% SolutionElectron Microscopy Sciences15714
Ter119BioLegend116220
True-Stain Monocyte BlockerBioLegend426103monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0ThermoFisher15575038EDTA
Vi-CELL XRBeckman Coulter731050cell counter instrument 

References

  1. Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).
  2. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
  3. Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
  4. Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
  5. Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
  6. Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
  7. Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
  8. Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
  9. Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
  10. von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
  11. Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
  12. Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
  13. Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
  14. Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
  15. Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
  16. Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
  17. Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
  18. Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
  19. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
  20. Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
  21. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  22. Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
  23. Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
  24. Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
  25. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  26. Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
  27. Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
  28. Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
  29. Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
  30. Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
  31. Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
  32. Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
  33. Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
  34. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
  35. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
  36. Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , 21 (2007).
  37. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

167 B

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved