الجيل الخالي من المعدلة وراثيا من الخلايا العصبية المشتقة من الدم

Summary

نحن نقدم طريقة خالية من المعدلة وراثيا (المعدلة وراثيا خالية) للحصول على الخلايا مع النمط الظاهري العصبية من خلايا الدم الطرفية المبرمجة. تنشيط مسار الإشارات المرتبطة بروتين الإنسان الجديد المرتبطة GPI يكشف عن طريقة فعالة خالية من المعدلة وراثيا للحصول على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

Abstract

تحدث العديد من الاضطرابات العصبية البشرية بسبب انحطاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الدماغ. بسبب القيود المفروضة في الاستراتيجيات الدوائية وغيرها من الاستراتيجيات العلاجية، لا يوجد حاليا علاج متاح للدماغ المصاب أو المريض. استبدال الخلايا يظهر كاستراتيجية علاجية واعدة للظروف العصبية. حتى يومنا هذا، تم إنشاء الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) بنجاح من أنسجة الجنين أو الخلايا الجنينية البشرية (ES) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). بدأت عملية التمايز عن طريق تفعيل البروتين الجليكوبروتين البشري المرتبط ب GPI ، والذي يؤدي إلى توليد خلايا جذعية متعددة القدرات. هذه الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) تفرق في المختبر إلى خلايا ذات النمط الظاهري العصبي كما هو مبين في المجهر الساطع والمناعة. يؤكد التحليل الهيكلي الفائق لهذه الخلايا عن طريق المجهر الإلكتروني بنيتها البدائية وكذلك مورفولوجيا تشبه الخلايا العصبية وخصائص دون الخلوية.

Introduction

تطوير طرق أبحاث الخلايا الجذعية الأساسية وقبل السريرية يشجع التطبيق السريري للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للأمراض العصبية. يعتمد هذا العلاج المحتمل بشكل حاسم على طريقة توليد الخلايا العصبية البشرية مما يؤدي إلى الانتعاش الوظيفي^1.

الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) تجديد الذات وتفرق إلى خلايا عصبية جديدة طوال الحياة في عملية تسمى تكوين الأعصاب الكبار. فقط مناطق الدماغ المقيدة جدا تؤوي NSCs المختصة لتوليد الخلايا العصبية حديثي الولادة في مرحلة البلوغ. يمكن أن تؤدي هذه NSCs إلى خلايا عصبية ناضجة ، والتي تشارك في التعلم والذاكرة ، وبالتالي استبدال الخلايا العصبية المفقودة أو التالفة. لسوء الحظ، هذه NSCs موجودة بكميات محدودة وهذا التكوين العصبي المحدود ينخفض بسرعة خلال نمو الأحداث². لذلك ، يجب النظر في مصادر أخرى للخلايا العصبية في هدف العلاج الخلوي.

من الصعب علاج الأمراض العصبية التنكسية باستخدام النهج الدوائية القياسية. وتستند استراتيجيات علاجية جديدة لاحتضان العديد من الاضطرابات العصبية التي لا يمكن عصبها على علاجات استبدال الخلايا من الأنسجة المريضة والمصابة. زرع NSC يمكن أن تحل محل الخلايا التالفة وتوفير آثار مفيدة. وتشمل المصادر الأخرى لاستبدال الخلايا العصبية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC)، والتي تستمد من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الأريمية الثديية³، وكذلك iPSCs⁴، والتي لديها قدرة واسعة على التجديد الذاتي مثل ESCs وقادرة على التفريق إلى أنساب الخلايا المختلفة. ويمكن أيضا أن تنشأ NSCs عن طريق إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الليفية البشرية تجنب الدولة متعددة القدرات⁵.

العلاج ببدائل الخلايا لا يزال يمثل مشكلة صعبة. على الرغم من أن ESC أو الجنين أو iPS يمكن أن يكون مصدرا لتوليد الخلايا العصبية لعلاج العديد من الأمراض العصبية غير القابلة للشفاء ، فإن استبدال خلايا SCs البالغة الذاتية للأنسجة التالفة هو بديل أفضل يتحايل على المخاوف المناعية والأخلاقية والسلامة.

تفعيل البروتين البشري المرتبط ب GPI عن طريق ربط الأجسام المضادة عبر الفوسفور من PLCа/PI3K/Akt/mTor/PTEN يبدأ متمايزة خلايا سلف الدم وتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs)⁶. هذه الخلايا تفرق في المختبر نحو الخلايا العصبية كما أكد عن طريق التحليل المجهري للإلكترون برايتفيلد والمناعة وانتقال الإلكترون (TEM).

في هذا العمل نقوم بوصف الجيل الخالي من المعدلات وراثيا من BD-PSCs وإعادة تمايزها بنجاح إلى خلايا ذات النمط الظاهري العصبي.

Protocol

تم الحصول على الموافقات الأخلاقية عند إجراء التجارب.

1. عزل خلايا الدم المحيطي البشري أحادية النوى (PBMNCs)

1. التأكد من أن جميع المتبرعين وقعوا على موافقة مستنيرة قبل سحب الدم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
2. خذ 30 مل من الدم من المتبرعين الأصحاء من قبل الموظفين الطبيين المدربين وفقا للبروتوكول القياسي.
3. عزل PBMNCs حسب كثافة التدرج الوسائط. استخدم 10 مل من الوسائط مع 25 مل من الدم المخفف بموجب الفوسفات العازل (PBS)، والطرد المركزي عند 300 × ز لمدة 30 دقيقة.
4. عزل الطبقة الفاصلة بين البلازما ووسائط تدرج الكثافة عن طريق الأنابيب. اغسل الخلايا المعزولة ب 5 مل من برنامج تلفزيوني معقم وطارد مركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق.
5. عد عدد الخلايا بالطرق القياسية باستخدام غرفة العد.

2. تفعيل البروتين الجليكوبروتين البشري المرتكز على GPI بواسطة الأجسام المضادة التي تتشابك على سطح PBMNCs

1. ضع الخلايا أحادية النووية 6 ×^{10 6} (MNCs) في أنابيب 15 مل وأد ربط الأجسام المضادة عن طريق احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الخاصة ببروتين الغشاء المرتبط ب GPI البشري (30 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة في PBS مع 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA) عند 37 درجة مئوية.
2. استبدال وسيط الحضانة مع المتوسطة Dulbecco المعدلة من إيسكوف تستكمل مع مصل البقر الجنين 10٪ (FBS).
3. تنمو الخلايا في 15 مل أنابيب البوليسترين، ووضع الأنابيب في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 8-10 أيام (دون اهتزاز). على D5، إضافة إضافية 1-2 مل من المتوسطة إيسكوف تكملها مع 10٪ FBS إلى كل أنبوب 15 مل.

3. فرز الخلايا المتمايزة التي تم إنشاؤها حديثا

1. عد الخلايا مع عداد الخلية الآلي (18 μL تعليق الخلية + 2 ميكرولتر صبغة مضان) أو في غرفة العد.
2. الطرد المركزي تعليق الخلية المستزرعة (5-7 × 10⁶) في 300 × ز لمدة 10 دقيقة ونسبر الناسخ الناتج مع ماصة باستور معقمة.
3. إعادة تعليق بيليه الخلية في 90 ميكرولتر من درجة الحموضة برنامج تلفزيوني المبردة مسبقا 7.2، 0.5٪ BSA و 2 M M EDTA.
4. أضف CD45 حبات مغناطيسية إيجابية بحجم نانو (80 ميكرولتر) إلى تعليق الخلية واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
5. غسل الخلايا بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت PBS والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة.
6. إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS.
7. غسل العمود مع 500 ميكرولتر من العازلة برنامج تلفزيوني المبردة مسبقا ووضعه في المجال المغناطيسي.
8. ضع تعليق الخلية على العمود واغسله ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (مرتين) وتدفق الطرد المركزي الذي يحتوي على خلايا سلبية CD45. جمعها في المتوسطة إيسكوف تكملها مع 1٪ BSA.
9. عد الخلايا في غرفة العد.

4. إعداد أطباق زراعة الخلايا للتمايز العصبي للخلايا الجذعية التي تم إنشاؤها حديثا

1. معطف الأوعية الثقافة مع بولي-L-ornithine واللامينين لنمو الخلايا العصبية.
2. ضع الأغطية الزجاجية في لوحات 4-جيدا ومعطف مع 1:5 المخفف بولي-L-ornithine (0.1 ملغ/مل في ddH₂O) في DDH₂O. وضع الأغطية في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم يغسل مع DDH₂O.
3. تذوب ببطء صفح (0.5-2.0 ملغ / مل) وإضافة إلى الجزء العلوي من coverlips. احتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
4. إعداد الحث العصبي متوسط N2 تتكون من 49 مل من D-MEM/F12, 500 ميكرولتر من N2 الملحق, 400 ميكرولتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA), الحل الأساسي FGF في 20 نانوغرام / مل التركيز النهائي (أعدت من 100 ميكروغرام / مل محلول الأسهم), وهيبارين في 2 نانوغرام / مل التركيز النهائي.
5. إزالة صفح الزائدة عن طريق pipetting وإضافة N2 الخلايا العصبية المتوسطة إلى أطباق الثقافة.

5. زراعة خلايا الدم المتمايزة العصبية

1. الثقافة BD المشتقة CD45 الخلايا السلبية على الأغطية الزجاجية المغلفة بالنعناع / ornithine لمدة 2 أيام في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في N2 المتوسطة لبدء التمايز العصبي للخلايا التي ولدتها BD حديثا.
2. خلايا الثقافة كذلك في الوسط التمايز العصبي تتكون من 48 مل من المتوسط العصبي, 500 ميكرولتر من L-الجلوتامين, 1 مل من الملحق B27, 500 ميكرولتر من NEAA, 50 ميكرولتر من العامل العصبي المشتق من الدبقية البشرية المؤتلفة (GDNF) عند 5 ميكروغرام/250 ميكرولتر في PBS/0.1٪ BSA، و50 ميكرولتر من الدماغ البشري المؤتلف عامل الضوائية العصبية المشتقة (BDNF) في 5 ميكروغرام/200 ميكرولتر في PBS/0.1٪ BSA و 50 ميكرولتر من محلول حمض الأسكوربيك 2.9 غرام/50 مل في برنامج تلفزيوني. ضع لوحات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.

6. تحليل المجهر المناعي للخلايا العصبية المشتقة من الدم

1. ثقافة الخلايا كما هو موضح أعلاه لمدة 16 يوما وإزالة وسائل الإعلام.
   1. احتضان مع مثبت قبل الحارة تتكون من 75 مل من الماء العقيم، 4 غرام من بارافورمالديهايد. إضافة 10 N NaOH حسب الحاجة ويحرك حتى ينجلي الحل. ثم أضف 10 مل من 10x PBS، 0.5 مل من MgCl_2، 2 مل من 0.5 M EGTA، و 4 غرام من السكروز. تيترات إلى درجة الحموضة 7.4 مع 6 N HCl، وجلب إلى 100 مل من المياه العقيمة لمدة 15 دقيقة، وفقا لمارسينكو^{وآخرون.}
   2. تجاهل المثبت وغسل الخلايا 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة. إضافة على الفور الطازجة 0.3٪ تريتون X-الحل و permeabilize الخلايا لمدة 5 دقائق. غسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة حل حظر التي أدلى بها برنامج تلفزيوني و 5٪ BSA.
   3. منع الخلايا في درجة حرارة الغرفة على لوحة الروك لمدة 1 ساعة.
   4. إعداد التخفيف المناسب من الأجسام المضادة في 1٪ BSA / PBS واحتضان الخلايا مع تخفيف الأجسام المضادة على لوحة الروك لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما، واحتضان الخلايا مع DAPI وجبل coverlips مع وسائل الإعلام المتصاعدة للتصور على المجهر.
      ملاحظة: يتم سرد الأجسام المضادة المسماة مباشرة المستخدمة في هذه التجربة في جدول المواد.

7. تحليل المجهر الإلكتروني انتقال الخلايا التي تم إنشاؤها حديثا

1. بذور الخلايا لTEM في الشرائح غرفة 8-جيدا.
2. إصلاح الخلايا في 3.5٪ الجلوتارالدهيد لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية، بعد الإصلاح في 2٪ OsO₄ لمدة ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة ووصمة عار في خلات أورانيل 2٪ في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة 30 دقيقة.
3. وأخيرا، شطف الخلايا في الماء المقطر، وتجفيفه في الإيثانول وتضمينها في راتنج الايبوكسي بين عشية وضحاها. في اليوم التالي نقل العينات إلى فرن 70 درجة مئوية لمدة 72 ساعة لتصلب الراتنج.
4. فصل ثقافات الخلايا المضمنة من الشريحة غرفة والغراء لكتل araldite.
5. قطع أقسام شبه رقيقة المسلسل (1.5 ميكرومتر) مع آلة، جبل على الزجاج الشرائح وصمة عار طفيفة مع الأزرق toluidine 1٪.
6. الغراء المقاطع المحددة شبه رقيقة لكتل araldite وفصلها عن الشريحة الزجاجية عن طريق تجميد المتكررة (في النيتروجين السائل) وذوبان الجليد.
7. إعداد أقسام ultrathin (0.06-0.08 ميكرومتر) مع آلة ومزيد من التباين مع سترات الرصاص.
8. الحصول على ميكروجراف باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي مع الكاميرا الرقمية.

النتائج

تقدم النتائج أدلة على أن هذه الطريقة الجديدة الخالية من جنرال موتورز قادرة على إعادة خلايا سلف الدم إلى حالتها الأكثر بدائية دون العمل مباشرة على الجينوم البشري.

لقد أظهرنا سابقا أن البروتين المرتبط ب GPI يبدأ الربط المتبادل بين الأجسام المضادة المحددة عبر PLCа/IP3K/Akt/mTOR/PTE...

Discussion

تعتمد طريقة إعادة برمجة الخلايا البشرية غير المعدلة وراثيا الموصوفة في هذا العمل على تنشيط الغشاء إلى النواة لآلات الإشارات (الآلات) وراء بروتين الغشاء البشري المرتبط ب GPI الذي يبدأ عملية التمايز مما يؤدي إلى توليد الجسم الحي السابق وتوسيع PSCs ذاتية التجديد التي يتم الحصول عليها من ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400