خلية واحدة Electroporation عبر مختلف الثقافة شريحة Organotypic من الإثارة فرس النهر الماوس والخلايا العصبية المثبطة فئة محددة

Summary

يقدم هنا بروتوكول للكهرومporation أحادي الخلية التي يمكن أن توفر الجينات في كل من الخلايا العصبية مثير ومثبطة عبر مجموعة من الأعمار ثقافة شريحة فرس النهر في المختبر. يوفر نهجنا تعبيرا دقيقا وفعالا عن الجينات في الخلايا الفردية ، والتي يمكن استخدامها لفحص الوظائف المستقلة للخلايا وبين الخلايا.

Abstract

وقد أثبت الكهربوجين نفسه كطريقة حاسمة لنقل جينات محددة إلى خلايا لفهم وظيفتها. هنا، ونحن نصف تقنية الكهرومporation خلية واحدة أن يزيد من كفاءة (~ 80٪) من العدوى الجينية في المختبر في الخلايا العصبية المثبطة مثير وفئة محددة في ثقافة شريحة فرس النهر الجهازية الماوس. باستخدام أقطاب زجاجية كبيرة، السائل النخاعي الاصطناعي المحتوي على التيترودوتوشين والبقوليات الكهربائية الخفيفة، قدمنا جين ا مهما في الخلايا العصبية الهرمية المثقفة من فرس النهر CA1 والخلايا العصبية المثبطة. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء الكهرومporation في شرائح فرس النهر المستزرعة تصل إلى 21 يوما في المختبر مع عدم وجود انخفاض في كفاءة العدوى، مما يسمح لدراسة مراحل مختلفة زراعة شريحة التنمية. مع تزايد الاهتمام بدراسة الوظائف الجزيئية للجينات عبر مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، توضح طريقتنا نهجا موثوقا ومباشرا لإصابة الجينات المختبرية في أنسجة دماغ الماوس التي يمكن إجراؤها باستخدام معدات وتقنيات الفيزيولوجيا الكهربية الحالية.

Introduction

في البيولوجيا الجزيئية، أحد أهم الاعتبارات للمحقق هو كيفية تقديم جين مهم إلى خلية أو مجموعة من الخلايا لتوضيح وظيفتها. يمكن تصنيف طرق التسليم المختلفة إما بيولوجية (على سبيل المثال، ناقل فيروسي)، أو مادة كيميائية (مثل فوسفات الكالسيوم أو الدهون)، أو فيزيائية (مثل الكهرومporation، أو الميكرويكشن، أو الليسيتيك الحيوي)^1،2. الأساليب البيولوجية هي فعالة للغاية ويمكن أن تكون خلية نوع محدد ولكن محدودة من خلال تطوير أدوات وراثية محددة. النهج الكيميائية قوية جدا في المختبر، ولكن الترافيكتوفيكات عشوائية عموما. علاوة على ذلك، يتم حجز هذه النهج في الغالب للخلايا الأساسية فقط. من النهج الفيزيائية ، biolistics هو أبسط وأسهل من وجهة نظر تقنية ، ولكن مرة أخرى تنتج نتائج العدوى العشوائية بكفاءة منخفضة نسبيا. للتطبيقات التي تتطلب نقل إلى خلايا محددة دون الحاجة إلى تطوير الأدوات الوراثية، ونحن نتطلع نحو كهربائية خلية واحدة^3،4.

في حين أن الكهرومporation المستخدمة للإشارة فقط إلى الكهرومporation الميداني ، على مدى السنوات العشرين الماضية ، تم تطوير بروتوكولات متعددة في المختبر وفي الجسم الحي للكهرومporation أحادي الخلية لتحسين التحديد والكفاءة^5و6و7، مما يدل على أنه يمكن استخدام الكهرومporation لنقل الجينات إلى خلايا فردية ، وبالتالي ، يمكن أن يكون دقيقا للغاية. ومع ذلك، فإن الإجراءات صعبة تقنيا، وتستغرق وقتا طويلا، وغير فعالة نسبيا. في الواقع ، حققت أوراق أحدث في جدوى منصات الكهرومporation الآلية^8،9 ، والتي يمكن أن تساعد في إزالة العديد من هذه الحواجز للمحققين المهتمين بتركيب مثل هذه^{الروبوتات.} ولكن بالنسبة لأولئك الذين يبحثون عن وسائل أبسط، فإن مشاكل الصعق الكهربائي، أي موت الخلايا، وفشل العدوى، وانسداد الماصة، لا تزال مصدر قلق.

لقد طورنا مؤخرا طريقة للتكهربائية تستخدم ماصة زجاجية ذات رؤوس أكبر، معلمات نبض كهربائي أكثر اعتدالا، وخطوة فريدة من نوعها ركوب الدراجات الضغط، والتي ولدت كفاءة العدوى أعلى بكثير في الخلايا العصبية مثير من الأساليب السابقة، ومكننا للمرة الأولى لtransfect الجينات في interneurons المثبطة، بما في ذلك الخلايا الداخلية المثبطة التعبير عن سوماتوستاتين في منطقة CA1 فرس النهر من ثقافة شريحة العضوية الماوس¹⁰. ومع ذلك ، لم يتم تناول موثوقية طريقة الكهربوين في أنواع مختلفة من الخلايا العصبية ومراحل نمو الخلايا العصبية. هنا، أثبتنا أن تقنية الكهربوئة هذه قادرة على نقل الجينات إلى كل من الخلايا العصبية المثيرة وفئات مختلفة من الخلايا الداخلية. الأهم من ذلك، كانت كفاءة العدوى عالية بغض النظر عن الأيام في المختبر (DIV) شريحة العمر الثقافة اختبارها. يوصى بشدة بهذه التقنية الراسخة والصديقة للمستخدم لأي محقق مهتم باستخدام الكهرومporation أحادي الخلية لأنواع مختلفة من الخلايا في سياق أنسجة دماغ الماوس المختبري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم مراجعة جميع بروتوكولات الحيوان والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس. إعداد ثقافة شريحة، إعداد البلازميد، والكهرومporation هي أيضا مفصلة في أساليبنا المنشورة سابقا، ويمكن أن يشار إليها للحصول على معلومات إضافية¹⁰.

1. إعداد ثقافة شريحة

1. إعداد الفئران organotypic فرس النهر شريحة الثقافات كما هو موضح سابقا¹¹, باستخدام الفئران بعد الولادة 6-7 أيام من العمر من أي من الجنسين.
   1. إعداد وسائل الإعلام تشريح لثقافة شريحة organotypic تتكون من (في mM): 238 السكروز, 2.5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄, و 11 الجلوكوز في الماء deionized, ثم الغاز مع 5٪ CO₂/95٪ O₂ إلى درجة الحموضة من 7.4.
   2. إعداد شريحة organotypic وسائل الإعلام الثقافية تتكون من: 78.8٪ (v/v) الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسية، 20٪ (v/v) مصل الحصان، 17.9 mM NaHCO₃، 26.6 mM الجلوكوز، 2 M CaCl₂، 2 M MgSO₄، 30 mM HEPES، الأنسولين (1 ميكروغرام / مل)، و 0.06 mM حمض الأسكوربيك، درجة الحموضة المعدلة إلى 7.3. ضبط osmolarity إلى 310-330 osmol باستخدام جهاز قياس التناضح.
   3. تشريح فرس النهر من الدماغ كله باستخدام ملعقتين، وشريحة (400 ميكرومتر) باستخدام مروحية الأنسجة. شرائح منفصلة باستخدام اثنين من ملقط ونقلها إلى 30 ملم إدراج ثقافة الخلية في لوحة بئر 6 مليئة وسائل الإعلام الثقافة (950 ميكرولتر) تحت إدراج.
2. تخزين الثقافات شريحة organotypic في حاضنة زراعة الأنسجة (35 درجة مئوية، 5٪ CO₂₎وتغيير وسائل الإعلام ثقافة شريحة كل يومين.

2. إعداد بلازميد

1. إعداد البلازميد لجين الفائدة.
   1. سوبكلون تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) الجينات في ناقلات pCAG.
   2. تنقية pCAG-EGFP plasmid مع مجموعة تنقية خالية من السموم الداخلية وتذوب في محلول داخلي يتكون من المياه المعالجة بالبيروكربونات ديثيل التي تحتوي على 140 mM K-methanesulfonate، 0.2 م م EGTA، 2 م مغ كل_2،و10 م م HEPES، معدلة إلى درجة الحموضة 7.3 مع KOH (تركيز البلازميد: 0.1 ميكروغرام/ميكرولتر).

3. إعداد ماصة الزجاج

1. سحب ماصة الزجاج borosilicate (4.5 – 8 MΩ) على سحب micropipette (الشكل 1A).
   ملاحظة: ماصة الزجاج المستخدمة لتسجيلات المشبك التصحيح كامل الخلية مثالية ل electroporation.
2. خبز ماصة الزجاج بين عشية وضحاها في 200 درجة مئوية لتعقيم.
3. تحقق من حجم طرف ماصة تحت مجهر تشريح لتقريب المقاومة الكهربائية.
   1. اختياري: تحقق من مقاومة ماصة عن طريق ربط ماصة إلى القطب الكهربائي واستخدام micromanipulator للمناورة طرف ماصة في السائل النخاعي الاصطناعي المعقم تصفية (aCSF) التي تحتوي على (في mM): 119 NaCl، 2.5 KCl, 0.5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ و 11 الجلوكوز في الماء المؤين, الغاز مع 5٪ CO₂/95٪ O₂ إلى درجة الحموضة من 7.4. تأكيد المقاومة الفعلية باستخدام قراءات على الكهربائي.
      ملاحظة: كلما كان طرف المواصة أكثر حدة، كلما كانت المقاومة الكهربائية أكبر. يجب أن تكون مقاومة ماصة أقل من 10 MΩ. ماصة الزجاج مع مقاومة ماصة عالية (الشكل 1B) تسد في كثير من الأحيان في طرف أثناء الكهربائي المتكررة.

4. إعداد جهاز الحفر الكهربائي

1. قم بتركيب جهاز الكهروبورتورات على جهاز قياس الفيزيولوجيا الكهربية القياسي للخلايا الكاملة، المجهز بمجهر مستقيم مثبت على طاولة متغيرة مع مضخة ميكرومانيبولاتور وعلانية.
2. تثبيت headstage من electroporator على micromanipulator وربط زوج من مكبرات الصوت إلى الكهربائي. توصيل الكهربائي إلى دواسة القدم التي يمكن استخدامها لإرسال نبض عندما تكون جاهزة.
   ملاحظة: تنبعث من مكبرات الصوت نغمة عند تشغيلها، وهو مؤشر على المقاومة الكهربائية عند القطب الكهربائي. وهذا يجعل من الممكن تحديد التغيرات النسبية في المقاومة دون سحب الانتباه بعيدا عن الإجراء.

5. إعداد الكهرومبوريشن

1. نقل شريحة الثقافة إدراج من 6 لوحات بئر إلى 3 سم أطباق بيتري محملة 900 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة وتخزينها في حاضنة CO₂ الطاولة حتى على استعداد لأداء electroporation.
   1. Preincubate إدراج الثقافة الطازجة مع شريحة الثقافة وسائل الإعلام (1 مل) لمدة 30 دقيقة على الأقل في طبق بيتري 3.5 سم لشرائح الثقافة بعد electroporation.
2. تنظيف وإعداد تلاعب ل electroporation.
   1. Perfuse خطوط مع تبييض 10٪ لمدة 5 دقائق لتعقيم الأنابيب وغرفة قبل بدء التجربة لهذا اليوم.
   2. Perfuse خطوط مع الماء autoclaved deionized لمدة 30 دقيقة على الأقل لشطف تماما.
   3. Perfuse خطوط مع مرشح معقمة aCSF تحتوي على 0.001 mM tetrodotoxin (TTX).
      ملاحظة: TTX يقلل من سمية الخلوية والموت بسبب الإفراط في التحدث الداخلي¹⁰.
3. تعيين معلمات نبض الكهربائي: سعة -5 V، نبض مربع، قطار 500 مللي ثانية، تردد 50 هرتز، وعرض نبضة 500 ميكرومتر.
4. ملء ماصة الزجاج مع 5 ميكرولتر من محلول داخلي يحتوي على البلازميد.
   1. إزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين من طرف ماصة عن طريق النقر والتنصت بلطف تلميح عدة مرات.
   2. تحقق من طرف للضرر عن طريق تصور تحت المجهر تشريح أو عن طريق تكرار الخطوة 3.3.1 للتحقق من مقاومة ماصة.
      ملاحظة: إذا تلف طرف، يجب تجاهل ماصة الزجاج، ويجب تكرار هذه الخطوة مع ماصة زجاجية جديدة أعدت مسبقا في الخطوة 3.
5. قم بتوصيل طرف ماصة إلى القطب الكهربائي بشكل آمن ثم قم بتشغيل السماعات. سجل القراءة (مقاومة المصصة) للمزلق الكهربائي عندما يكون الطرف قد أجرى اتصالا مع وسيط aCSF.
6. قطع الثقافة إدراج غشاء باستخدام شفرة حادة وعزل ثقافة شريحة واحدة. نقل بعناية ثقافة شريحة إلى غرفة الكهربوكربوه باستخدام ملقط حاد الزاوية وإصلاح موقفها مع مرساة شريحة.
   1. لا تبقي ثقافة شريحة خارج الحاضنة لأكثر من 30 دقيقة في وقت واحد لمنع الآثار الجانبية مثل التغيرات في صحة الخلايا العصبية أو^{وظيفة 12}.

6. الخلايا الكهربائية ذات الاهتمام

1. تطبيق ضغط إيجابي على ماصة مع الفم أو باستخدام حقنة 1 مل (0.2 - 0.5 مل ضغط) تعلق على الأنابيب.
2. استخدام الضوابط مقبض micromanipulator 3 الأبعاد للمناورة طرف ماصة بالقرب من سطح ثقافة شريحة.
3. اختر الخلية المستهدفة واقترب منها، مع الحفاظ على الضغط الإيجابي المطبق حتى تتشكل الدمل على سطح الخلية، مرئية على المجهر.
4. أداء دورات الضغط.
   1. تطبيق سريع ضغط سلبي خفيف عن طريق الفم بحيث ختم فضفاضة أشكال بين طرف ماصة وغشاء البلازما، وأشار بصريا من قبل الغشاء الصعود إلى طرف ماصة إلى حد ما. لاحظ زيادة (~ 2.5x المقاومة الأولية) في مقاومة ماصة من خلال الاستماع لزيادة في لهجة قادمة من مكبرات الصوت. بسرعة إعادة تطبيق الضغط الإيجابي بحيث الدمل إعادة تشكيل.
   2. أكمل فورا دورتين ضغط إضافيتين على الأقل دون توقف، ثم اضغط ضغطا سلبيا لمدة 1 s.
      ملاحظة: التوقف بين الدورات، أو ممارسة ضغط أكثر من اللازم، أو الضغط السلبي لفترة طويلة جدا يمكن أن يسبب تلفا كبيرا في الخلايا وربما يتسبب في موت الخلية أثناء الكهرومporation.
5. نبض بسرعة الكهربائي مرة واحدة باستخدام دواسة القدم عندما تصل لهجة من مكبرات الصوت قمة مستقرة في الملعب، مما يدل على ذروة المقاومة الكهربائية. لا تنتظر في ذروة المقاومة لأكثر من 1 ثانية قبل إرسال النبض.
   ملاحظة: لقد لاحظنا أية electroporation خارج الهدف عند استخدام هذا البروتوكول¹⁰. فقط الخلايا التي كانت على اتصال مع ماصة الزجاج خلال دورات الضغط كانت مصابة. وضع ماصة بالقرب من الخلايا العصبية الأخرى لا يؤدي إلى نقل الجينات.
6. سحب بلطف ماصة ما يقرب من 100 ميكرومتر من الخلية دون تطبيق الضغط.
7. إعادة تطبيق الضغط الإيجابي، والتحقق من أن المقاومة مشابهة للقراءة المسجلة في الخطوة 5.5، ثم الاقتراب من الخلية التالية.
   1. إزالة القباقيب المحتملة، وأشار بصريا أو من قبل زيادة كبيرة (>15٪ أعلى) مقاومة ماصة بعد الكهربائي، عن طريق تطبيق الضغط الإيجابي.
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك تسد مرئية والمقاومة لا يزال أعلى بشكل ملحوظ تجاهل ماصة واستخدام واحدة جديدة. في المتوسط ، يمكن استخدام ماصة لأحداث تصل إلى 20 electroporation إذا كان المستخدم حذرا¹⁰.
8. بعد الكهربوه، نقل ثقافة شريحة على إدراج ثقافة جديدة، واحتضان في 35 درجة مئوية في الحاضنة لمدة تصل إلى 3 أيام.

7. تثبيت, تلطيخ والتصوير من الثقافات شريحة فرس النهر organotypic

1. إصلاح الثقافات شريحة organotypic electroporated 2 - 3 أيام بعد transfection مع 4٪ paraformaldehyde و 4٪ السكروز في 0.01 M فوسفات عازلة المالحة (1x PBS) لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
2. إزالة شرائح مثبتة واحتضان في السكروز 30٪ في 0.1 M الفوسفات العازلة (1x PB) لمدة 2 ساعة.
3. وضع شرائح على زجاج الشريحة وتجميدها عن طريق وضع الزجاج الشريحة على رأس الجليد الجاف سحقت. إذابة شرائح في درجة حرارة الغرفة ونقلها إلى لوحة بئر 6 مليئة 1x PBS.
4. وصمة عار شرائح مع الماوس المضادة لGFP والأرنب المضادة لل RFP الأجسام المضادة في GDB العازلة (0.1٪ الجيلاتين، 0.3٪ تريتون X-100، 450 mM NaCl، و 32٪ 1x PB، درجة الحموضة 7.4) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
5. اغسل الشرائح مع 1x PBS ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لكل غسل.
6. حضانة شرائح مع المضادة للفأرة اليكسا 488-المقترنة الأجسام المضادة الثانوية ومكافحة أرنب اليكسا 594-اقتران الأجسام المضادة الثانوية في مخزن GDB العازلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. احتضان شرائح مع DAPI (4 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
7. اغسل الشرائح مع 1x PBS ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق لكل غسل.
8. شرائح جبل على الشرائح الزجاجية باستخدام تركيب المتوسطة وإجراء التصوير مضان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لدينا كهربية خلية واحدة قادرة على تقديم الجينات بدقة في الخلايا العصبية المثيرة والمثبطة التي تم تحديدها بصريا. نحن electroporated ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في ثلاث نقاط زمنية مختلفة. بارفالبومين (الكهروضوئية) أو الغلوتامات المركبات نوع 3 (VGT3) التعبير عن الخلايا العصبية تم تصورها عن ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نحن نصف هنا طريقة الكهرومporation التي تنقل كل من الخلايا العصبية المثيرة والمثبطة بكفاءة عالية ودقة. لدينا بروتوكول الكهربوجين الأمثل لديه ثلاثة اختراقات مبتكرة لتحقيق نقل الجينات عالية الكفاءة. وكان التعديل الأول لزيادة حجم ماصة مقارنة مع البروتوكولات المنشورة سابقا^3،<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710