قطع العصب البصري الحافظ على الغمد في الفئران لتقييم تجديد المحور العصبي والتدخلات التي تستهدف محور خلية العقدة الشبكية

Summary

يصف هذا البروتوكول قطع العصب البصري الذي يحافظ على غمد العصب البصري في الفئران. يولد الضغط الهيدروستاتيكي من الحقن المجهري في العصب البصري قطعا كاملا ، مما يسمح بإعادة التجميع بدون خياطة لنهايات العصب البصري المنقولة والاستهداف المباشر للحجرة المحورية في نموذج القطع.

Abstract

تتلاقى محاور الخلايا العقدية الشبكية (RGC) عند رأس العصب البصري لنقل المعلومات المرئية من شبكية العين إلى الدماغ. الأمراض مثل الجلوكوما والصدمات والاعتلالات العصبية البصرية الإقفارية تصيب محاور RGC ، وتعطل انتقال المحفزات البصرية ، وتسبب فقدان البصر. تشمل النماذج الحيوانية التي تحاكي إصابة المحور العصبي RGC نماذج سحق العصب البصري والقطع. كل من هذه النماذج له مزايا وعيوب متأصلة. يكون سحق العصب البصري بشكل عام أقل حدة من القطع ويمكن استخدامه لفحص تجديد المحور العصبي عبر موقع الآفة. ومع ذلك ، يمكن أن تؤثر الاختلافات في قوة التكسير ومدتها على استجابات الأنسجة ، مما يؤدي إلى استنساخ متغير واكتمال الآفة. مع قطع العصب البصري ، هناك إصابة شديدة وقابلة للتكرار تصيب جميع المحاور تماما. ومع ذلك ، فإن عبور العصب البصري يغير بشكل كبير الحاجز الدموي الدماغي عن طريق انتهاك غمد العصب البصري ، مما يعرض العصب البصري للبيئة الطرفية. علاوة على ذلك ، لا يمكن تقييم التجديد خارج موقع القطع دون إعادة تشكيل نهايات العصب المقطوعة. علاوة على ذلك ، يتم تنشيط التغيرات التنكسية المميزة والمسارات الخلوية إما عن طريق السحق أو إصابة القطع.

تتضمن الطريقة الموضحة هنا مزايا كل من نماذج سحق العصب البصري والقطع مع التخفيف من العيوب. الضغط الهيدروستاتيكي الذي يتم توصيله إلى العصب البصري عن طريق الحقن المجهري يعبر العصب البصري تماما مع الحفاظ على سلامة غمد العصب البصري. يتم إعادة حصاد نهايات العصب البصري المنقولة للسماح بفحوصات تجديد المحور العصبي. أحد القيود المحتملة لهذه الطريقة هو عدم القدرة على تصور المقطع الكامل ، وهو مصدر محتمل للتباين. ومع ذلك ، فإن التأكيد البصري على أن الجزء المرئي من العصب البصري قد تم نقله يدل على قطع العصب البصري الكامل بنجاح 90-95٪. يمكن تطبيق هذه الطريقة لتقييم استراتيجيات تعزيز تجديد المحور العصبي في نموذج القطع أو التحقيق في التدخلات التي تستهدف المقصورات المحورية.

Introduction

تحدث الإصابة المحورية والتنكس في الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) بعد الصدمة أو في الأمراض التنكسية العصبية مثل الجلوكوما^1،2. يؤدي فقدان RGCs وتعطيل نتوءات طرد الشبكية إلى فقدان البصر الدائم³. لفهم المسارات الجزيئية المسؤولة عن العمليات التنكسية وتطوير استراتيجيات للتخفيف من فقدان المحور العصبي و RGC أو لتجديد محاور RGC ، تم استخدام نماذج حيوانية تجريبية لمحاكاة إصابة العصب البصري ، بما في ذلك سحق العصب البصري ونماذج قطع العصب البصري. عند اختيار نموذج تجريبي ، يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار مزايا وعيوب كل نهج بالإضافة إلى المسارات الجزيئية التي يتم تنشيطها بواسطة الإصابة⁴.

الأساس المنطقي لتطوير الطريقة الموضحة هنا هو الاستفادة من مزايا نماذج سحق العصب البصري⁵ والمقطع⁶ مع التخفيف من العيوب. كانت أهداف هذه الطريقة هي توليد إصابة عصب بصري قابلة للتكرار حيث يتم نقل جميع المحاور بشكل لا شك فيه وبشكل كامل ، ويتم تقليل التعرض لجهاز المناعة المحيطي ، ويتم إعادة حصاد الأطراف المنقولة للعصب البصري بسهولة للسماح بتقييم تجديد RGC. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير الطريقة للسماح بالوصول المجزأ إلى الجزء المحوري من RGCs المصابة وتقديم تدخلات محددة للمحور العصبي (على سبيل المثال ، العوامل العصبية ، الزرع الخلوي) محليا إلى العصب البصري خلف الحجاج.

هناك مزايا متعددة لهذه التقنية على الطرق البديلة. بالمقارنة مع سحق العصب البصري ، فإن هذه الطريقة تعبر العصب البصري بشكل كامل وموثوق. يعالج هذا مشكلة محتملة تتمثل في تجنيب 7 محاور^عصبي غير مرغوب فيه. بالإضافة إلى ذلك ، تتسبب الطريقة الموصوفة في إصابة محورية شديدة لا تعتمد على مقدار ومدة القوة التي يمارسها المشغل كما هو الحال في إصابة السحق ، وبالتالي تقليل التباين⁸. على عكس الطرق المعمول بها لنقل العصب البصري ، يحافظ النهج المفصل في هذا البروتوكول على سلامة غمد العصب البصري. من مزايا الحفاظ على غمد العصب البصري أنه يمنع العصب البصري من التعرض لجهاز المناعة المحيطي. علاوة على ذلك ، فإن القوى الميكانيكية التي يمارسها غمد العصب البصري على العصب البصري المتقاطع تعيد استخدام نهايات العصب المقطوع دون الحاجة إلى تحدي التلاعب بالجراحة^{المجهرية 9،10،11}. أخيرا ، مع سلامة غمد العصب البصري ، تنتج الطريقة مسافة مادية بين جذوع العصب البصري حيث يمكن إدخال الخلايا الجذعية أو العوامل العصبية أو البوليمرات إلى محاور RGC الآفة مباشرة.

سحق العصب البصري هو النموذج القياسي الذهبي الذي يتم فيه تقييم استراتيجيات تجديد العصب البصري لتحديد فعالية العلاجات. يحد حجم العصب البصري للقوارض من التلاعب المحتمل ، وخاصة قطع العصب وإعادة تكيفه. ومع ذلك ، في مجال إصابة الحبل الشوكي وتجديده ، هناك إجماع على أن القطع الكامل هو النموذج المثالي للتمييز بين التجديد المحوري والمحور العصبي¹² المحفوظ. تقلل الطريقة الموضحة هنا من الحواجز التقنية لتقييم الاستراتيجيات التجديدية في نموذج قطع العصب البصري. على هذا النحو ، يمكن استخدام هذا النموذج للتحقق من صحة الاستراتيجيات الواعدة المحددة في نماذج سحق العصب البصري مع قطع العصب البصري. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن هذا النموذج يستهدف بشكل مباشر الحجرة المحورية ، فإنه يتيح إجراء دراسات التدخلات على محاور RGC البالغة المصابة والآليات المسؤولة عن العمليات التنكسية والتجديدية المحورية.

نموذج قطع العصب البصري الموصوف في هذه الدراسة يعبر العصب البصري تماما مع الحفاظ على غمد العصب البصري. هذا النهج الجديد مناسب للتجارب التي تهدف إلى تقييم تجديد المحور العصبي في نموذج القطع دون الحاجة إلى العملية الصعبة تقنيا لإعادة تصميم نهايات العصب البصري. تتشابه جوانب هذه التقنية مع إجراء سحق العصب البصري. لذلك ، يمكن تنفيذ هذا النهج من قبل المشغلين ذوي الخبرة في سحق العصب البصري. لا يتطلب النهج الجراحي أدوات مصممة خصيصا ويمكن إكماله بأدوات جراحية متاحة بسهولة ونظام حقن مجهري ، مما يجعله متاحا واقتصاديا.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات التي تنطوي على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) التابعة لنظام الرعاية الصحية لشؤون المحاربين القدامى في سان دييغو. تم تعقيم الأدوات والمحاليل الجراحية قبل الجراحة للحد من الالتهابات والمضاعفات بعد الجراحة.

1. التقنية الجراحية

1. إجراء التجارب باستخدام تقنيات التعقيم ووفقا لبروتوكولات استخدام الخاصة بالمؤسسة.
2. تعقيم الأدوات والمواد التي تلامس الأنسجة الحية لمنع العدوى ، وتجنب التأثير سلبا على رفاهية ، وتقليل التأثيرات السلبية المحتملة على الدراسة. نظف الأدوات الجراحية جيدا بالماء والمنظفات أو المنتجات الأنزيمية لإزالة المواد الغريبة وتعقيمها بالبخار أو التعقيم السريع.
3. Aliquot السوائل في حاويات معقمة في غطاء زراعة الأنسجة. قم بتعقيم حقنة الميكرولتر عن طريق غسلها بنسبة 70٪ من الإيثانول وشطفها بمحلول ملحي معقم بفوسفات (PBS).

2. التخدير

1. تخدير الفئران باستخدام نظام مبخر الأيزوفلوران. تبخير الأيزوفلوران بتركيز 4.5٪ باستخدام الأكسجين الطبي بمعدل 1 لتر / دقيقة في صندوق تخدير مرفق. ضع في صندوق التخدير حتى يتباطأ التنفس ويتم تخدير.
   ملاحظة: هذه الخطوة الأولية باستخدام التخدير بمخدر الغاز ليست ضرورية إذا كان المشغل مرتاحا ومعتادا على إعطاء التخدير عن طريق الحقن للحيوانات غير المخدرة.
2. اسحب كمية كافية من كوكتيل مخدر مكون من الكيتامين (50 ملغم/كغ) وزيلازين (2.6 ملغم/كغ) وأسيبرومازين (0.5 ملغم/كغ) في حقنة توبركولين 30 جم. قم بإزالة المخدر من صندوق التخدير. قم بحقن التخدير داخل الصفاق لتحقيق عمق ثابت من التخدير طوال العملية وإعادة إلى قفصه.
3. ابدأ الإجراء عندما تفشل قرصة إصبع القدم في إثارة الاستجابة. قم بتقييم لمعرفة عمق ومعدل التنفس وبقرصة إصبع القدم كل 5 دقائق طوال العملية لضمان عدم وجود ألم.
4. عند الانتهاء من الجراحة ، قم بإزالة من الإطار التجسيمي. يجب إعطاء حقنة تحت الجلد من المحلول الملحي (3 مل) والأمبيسلين (0.15-0.2 ملغم/كغ) والبانامين (2.5-5 ملغم/كغ) لتوفير تسكين الألم ودعم السوائل. انقل إلى حاضنة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.

3. النهج الجراحي

1. ضع الجرذ (7-8 أسابيع من العمر ، سلالة فيشر 344) في إطار تجسيمي للرأس وفوق وسادة ساخنة. ضع الإطار التجسيمي بحيث يكون رأس الجرذ مواجها ليسار الجراح ووسط المدار الأيسر في مجال الرؤية الجراحي.
2. على العين اليسرى ، ضع قطرة من البروباراكايين ونظف العين عن طريق وضع 5٪ من بوفيدون اليود على الجفن والعين. انشر مرهم العين على قرنية كلتا العينين للحفاظ على رطوبة القرنية ومنع تكون إعتام عدسة العين.
3. مرر خياطة 4-0 بولي جلكتين عبر بشرة الجفن العلوي إلى الجانب المركزي من هامش الجفن ، باستخدام هذه الخيطة لإجراء خياطة مؤقتة في الخطوات اللاحقة. استخدم الخيط لكسر الجفن وفضح القب العلوي.
4. قم بلصق خياطة البوليجلكتين على الإطار التجسيمي لتطبيق الجر والتعرض المستمرين. تجنب الجر المفرط لأن هذا يمكن أن يحد من التعرض للمحتويات خلف الحجاج.
5. باستخدام ملقط Colibri ، ارفع الملتحمة العلوية وشق الملتحمة على طول الحافة باستخدام زوج من مقص Vannas. قم بإجراء استئصال الصفاق في الساعة 4 على طول الطرف العلوي.
6. ضع قوة جر أقل طفيفا على الكرة الأرضية عن طريق وضع خياطة من مادة البولي بروبلين الحلقية على طول الطرف العلوي مع الأطراف الحرة أسفل الكرة الأرضية. الأنسجة المتبقية على طول الطرف العلوي بعد استئصال الصفاق كافية لتوفير الجر على حلقة الخيط دون الحاجة إلى تمرير الخيط عبر الصلبة أو الليمفا.
   1. قم بتأمين نهايات الحلقة بمشبك البلدغ واترك المشبك يتدلى بحرية في الهواء. سيطبق وزن المشبك قوة جر رديئة على الكرة الأرضية ويكشف المزيد من الفضاء خلف الحجاج.
7. تشريح حاد باستخدام مقص Vannas على طول الصلبة بعد الجانب الخلفي من الكرة الأرضية وتحت المستقيم العلوي. قم بفك عضلات المستقيم العلوية من الكرة الأرضية عن طريق قطع وتر العضلات بمقص Vannas للوصول إلى الفضاء الرجعي.

4. الوصول إلى العصب البصري

1. تشريح حاد باستخدام ملقط Dumont # 5/45 على طول الجانب الزمني للكرة الأرضية الخلفية وتحديد الوريد الدوامة الجانبية العلوية. مزيد من تشريح الأنف بشكل حاد إلى الوريد الدوامة الجانبي العلوي لفضح مخروط العضلات المدارية حول العصب البصري وتجنب إتلاف العصب البصري قبل الأوان. تجنب إصابة الوريد الدوامي لأن ذلك قد يسبب نزيفا حادا. في حالة حدوث نزيف ، يمكن وضع قضيب طرف قطني حتى يتوقف النزيف.
2. باستخدام ملقط Dumont # 5/45 ، أدخل الطرف بعناية في الجانب الصدغي لمخروط العضلات المدارية وافتح الملقط الموازي لمسار الألياف العضلية للكشف عن العصب البصري. استخدم الملقط لإزاحة ألياف العضلات التي تغطي العصب البصري بشكل جانبي وفضح العصب بالكامل. تأكد من أن غمد العصب البصري فقط هو الذي يغطي العصب البصري لأن ألياف العضلات المتبقية ستمنع الماصة الزجاجية الشعرية المسحوبة من الاختراق بسهولة في العصب البصري.
3. حافظ على تعرض العصب عن طريق وضع ملقطين من Dumont # 5/45 على طول كلا الجانبين الجانبيين للعصب وفتح الملقط. يجب أن يسمح مقدار التعرض بسحق العصب البصري بمقدار 1.5-2.0 مم خلف الكرة الأرضية وإدخال ماصة شعرية زجاجية مسحوبة في العصب البصري من الجانب الظهري.

5. نقل العصب البصري داخل غمد البصر

1. باستخدام ملقط Dumont # 5/45 ، ضع الأطراف على جانبي العصب البصري على الأقل 1.5-2.0 مم خلف الكرة الأرضية. تأكد من أن أطراف الملقط تمتد على قطر العصب. أغلق الملقط تماما لمدة 5 ثوان لسحق العصب البصري وتدوين موضع موقع السحق.
2. باستخدام حقنة ميكرولتر ، املأ ماصة شعرية مسحوبة بزجاج ب 1-2 ميكرولتر من PBS وقم بتوصيل الماصة بحامل الماصة. قم بتركيب حامل الماصة على معالج دقيق وقم بتوصيل المعالج الدقيق بالإطار التجسيمي.
3. اضبط نظام الحقن الدقيق لتقديم نبضة واحدة مدتها 4 مللي ثانية عند ضغط 20 رطل لكل بوصة مربعة مع كل ضغطة على الزر. ضع الماصة في المجال الجراحي.
4. تحت النطاق الجراحي ، استخدم زوجا من الملقط # 55 لكسر طرف الماصة وشطفه بحجم (~ 20-30 ميكرومتر قطر) قادر على توصيل حجم صغير ولكنه كبير بما يكفي لتوفير صلابة كافية لاختراق غمد العصب البصري. تأكد من سالكية طرف الماصة عن طريق إعطاء نبضة واحدة ومراقبة السوائل الموجودة في طرف الماصة.
5. قم بتنقيح موضع طرف الماصة فوق موقع سحق العصب البصري مباشرة في وسط العصب البصري وعند ملامسته لغمد العصب البصري. لاحظ الوضع الرأسي للماصة على المعالج الدقيق لتحديد عمق 200 ميكرومتر لاحقا.
6. اخفض الماصة مع مراقبة الطرف الموجود أسفل المنظار الجراحي حتى تدخل الماصة إلى العصب البصري. إذا انحني طرف الماصة ويفتقر إلى الصلابة اللازمة لاختراق غمد العصب البصري، فقم بسحب الماصة واستخدم زوجا من ملقط #55 لتقليل الطول وزيادة قطر طرف الماصة. بمجرد إجراء التعديلات على طرف الماصة، أعد محاولة اختراق غمد العصب البصري باستخدام الماصة.
7. عند الدخول إلى العصب البصري باستخدام طرف الماصة ، اسحب الماصة إذا لزم الأمر. يجب أن يكون موضع طرف الماصة، كما هو موضح في المعالج الدقيق التجسيمي، 200 ميكرومتر تحت سطح العصب البصري من الموضع الأولي المذكور في الخطوة 5.5.
8. أثناء مراقبة العصب البصري تحت النطاق الجراحي ، قم بتطبيق نبضات الضغط الهيدروستاتيكي باستخدام نظام الحقن المجهري. عند تطبيق النبضات ، يجب ملاحظة الفصل الخطي بين الأطراف البعيدة والقريبة من العصب البصري للتحقق من قطع العصب البصري.
   ملاحظة: حجم الحقن من 250-500 نانولتر كاف بشكل عام لتوفير القوة اللازمة لعبور العصب البصري. قد تشير الحقن التي تتطلب أكثر من 1 ميكرولتر إلى الحاجة إلى تغيير موضع الحقن. قد لا تتسبب الأحجام الأكبر التي يتم حقنها في الحمة السليمة في تلف RGC إضافي نظرا لأن الطريقة تتقاطع تماما مع العصب البصري ولكن من المرجح أن تتعقب على طول حزم العصب البصري. من المحتمل أن يشير عدم ملاحظة القطع الخطي للعصب البصري على الرغم من حقن حجم سائل كاف إلى وضع خاطئ للماصة في موقع التكسير والحاجة إلى إعادة التوضع. قد يكون من الضروري أيضا زيادة بنسبة 50٪ في ضغط الحقن.

6. الإغلاق والتعافي

1. اسحب الماصة وقم بإزالة ملقط Dumont # 5/45 المتراجع . أعد العين إلى وضع محايد عن طريق إزالة مشبك البلدغ وخياطة البولي بروبلين الحلقية من الكرة الأرضية.
2. أعد وضع الملتحمة إلى طيفي القرنية ، مع ضمان إطلاق أي ملتحمة مقلوبة للسماح بوضع الأنسجة والشفاء. ضع مرهم مضاد حيوي موضعي للعيون على العين.
3. قم بإزالة الشريط من خياطة الجفن 4-0 بولي جلكتين وحافظ على الخيط في مكانه لاستخدامه في tarsorrhaphy مؤقت. مرر الخيط عبر هامش الجفن السفلي ، عبر المنطقة تحت الجلد السفلية ، والخروج من خلال البشرة. اربط الخيط بضغط كاف لإغلاق العين.
4. إدارة مسكنات ما بعد الجراحة وفقا للبروتوكولات المؤسسية وإرشادات هيئة رعاية. ضع بشكل مستقل في قفص ساخن للتعافي بعد الجراحة. لا تضع الفراش في قفص الاسترداد لمنع الشفط العرضي.

النتائج

عادة ما يؤدي قطع العصب البصري إلى فقدان موت الخلايا المبرمج ل 80-90٪ من RGCs المصابة في غضون 14 يوما بعد الإصابة. تعمل التقنية الموصوفة على عكس العصب البصري مع الحفاظ على سلامة غمد العصب البصري (الشكل 1). درجة فقدان RGC قابلة للمقارنة مع نماذج قطع العصب البصري التقليدية وسحق العصب البصري مع ميزة أن نهايات العصب المقطوع يتم وضعها بسهولة بعد القطع بالطريقة الموضحة هنا (الشكل 2). تتيح إعادة توصيل نهايات العصب البصري المقطوع بهذه الطريقة تقييم التجديد المحوري RGC في نموذج القطع من خلال توفير ركيزة قد تنمو عليها المحاور ودون الحاجة إلى التلاعب بالجراحة المجهرية لإعادة توصيل نهايات العصب المقطوعة (الشكل 3). يوضح التتبع الأمامي لمحاور RGC مع الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (CTB) أن المحاور الإيجابية CTB يتم نقلها بالكامل بعد قطع العصب البصري الذي يحافظ على غمد (الشكل 4). يؤدي الحفاظ على غمد العصب البصري أثناء عبور العصب البصري أيضا إلى إنشاء مساحة مغلقة يمكن فيها توصيل مواد التحقيق ، مثل العوامل أو الخلايا العصبية ، إلى محاور RGC المصابة بالآفة والحفاظ عليها في موضعها (الشكل 5). خلال المراحل الأولى من التدريب ، هناك معدل نجاح متوقع بنسبة 60-70٪ للقطع الكلي. مع الخبرة ، يبلغ معدل نجاح القطع الكلي حوالي 90-95٪.

الشكل 1: عبور العصب البصري مع الحفاظ على غمد العصب البصري. (أ) صورة للمجال الجراحي توضح التعرض للعصب البصري السليم قبل القطع. (ب) صورة للعصب البصري بعد القطع. اخترقت ماصة زجاجية دقيقة غمد العصب البصري في موقع القطع وسلمت تعليقا خلويا (محلول عكر) في الفراغ بين نهايات العصب البصري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: فقدان الخلايا العقدية الشبكية بعد غمد العصب البصري الذي يحافظ على قطع العصب البصري. تصاعد شبكية العين الكاملة التمثيلية المسطحة من العيون مع (أ) عصب بصري سليم ، (ب) غمد العصب البصري الذي يحافظ على قطع العصب البصري ، (ج) قطع العصب البصري التقليدي ، أو (د) سحق العصب البصري قبل 14 يوما تم تصنيفها مناعية لجاما سينوكلين (SNCG). تم الحصول على الصور من مجهر مضان باستخدام هدف 10x ، وتم تصحيحها للتظليل ، وخياطتها لإنشاء صورة واحدة. كان فقدان أجسام الخلايا العقدية الشبكية (RGC) واضحا في جميع أنحاء شبكية العين في العيون المصابة. تظهر الإدخالات صورا تكبير أعلى لشبكية العين وتظهر خسارة كبيرة في RGCs بعد إصابات العصب البصري. (ه) يوضح القياس الكمي لبقاء RGC خسارة كبيرة في RGC بعد إصابات العصب البصري مقارنة بالتحكم في الأعصاب البصرية السليمة. * p< 0.05 مقارنة بالسليمة ؛ ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey اللاحق. ن = 3 لكل مجموعة ؛ تمثل أشرطة الخطأ SD. SP-ONT ، قطع العصب البصري الذي يحافظ على الغمد. ONT, قطع العصب البصري; ONC ، سحق العصب البصري. أشرطة المقياس = 1,000 ميكرومتر. أشرطة المقياس في الأجزاء الداخلية = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: أقسام الأعصاب البصرية بعد إصابات العصب البصري. صور تمثيلية للمقطع الطولي من خلال الأعصاب البصرية بعد 14 يوما من (AC) غمد العصب البصري الذي يحافظ على القطع ، (D-F) قطع العصب البصري التقليدي ، أو (G-I) سحق العصب البصري. (أ ، د ، ز) يحدد وضع العلامات المناعية للبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) مدى الآفة بينما يوضح وضع العلامات على الحمض النووي (B ، E ، H) باستخدام 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) الخلوية المتجاورة على طول العصب البصري وداخل موقع الآفة. (ج ، و ، أنا) الصور المدمجة التي توضح توطين الأنسجة العصبية الإيجابية ل GFAP والخلوية في موقع الآفة. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: قسم من العصب البصري بعد غمد العصب البصري يحافظ على قطع العصب البصري. صور تمثيلية لقسم طولي من خلال عصب بصري بعد 14 يوما من غمد العصب البصري الذي يحافظ على المقطع مع تتبع المحور العصبي الأمامي مع حقن الوحدة الفرعية B لتوكسين الكوليرا داخل الجسم الزجاجي (CTB). (أ) يمكن ملاحظة آفة كاملة لمحاور RGC المسماة CTB الممتدة من الكرة الأرضية (يسار) باتجاه الدماغ (يمين). (ب) يحدد وضع العلامات المناعية للبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) آفة واسعة النطاق تشمل قطر العصب البصري بالكامل. (ج) يوضح وضع العلامات على الحمض النووي باستخدام 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) الخلوية داخل موقع الآفة. (د) صورة مدمجة توضح توطين المحاور المسماة ب CTB ، والأنسجة العصبية الإيجابية ل GFAP ، والخلوية في موقع الآفة. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: القسم الطولي للعصب البصري المتقاطع الذي تلقى طعما خليا. صور تمثيلية لمقطع طولي من خلال العصب البصري بعد 14 يوما من غمد العصب البصري الذي يحافظ على قطع وزرع الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) التي تعبر عن البروتين الفلوري tdTomato. (أ) أظهر وضع العلامات المناعية للبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) انفصالا كاملا لنهايات العصب البصري المنقولة. (ب) تم احتواء NSCs التي تعبر عن tdTomato داخل المساحة التي تم إنشاؤها بواسطة التقنية الموصوفة واستمرت في البقاء على قيد الحياة بعد الزرع. (ج) تم وضع الخلايا العصبية العصبية المطعمة مباشرة على طرفي العصب البصري المقطوع. قضبان المقياس ، 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

تم نشر العمليات الجراحية التي تصف نموذج قطع العصب البصري سابقا⁶. ومع ذلك ، فإن التقنيات المفصلة في تلك البروتوكولات تتضمن شق غمد السحيا لعبور العصب البصري. علاوة على ذلك ، من أجل تقييم تجديد محور RGC في نماذج القطع السابقة ، كانت هناك حاجة إلى التلاعب الجراحي المجهري الصعب إما لتعيين نهايات العصب البصري المقطوع أو ترقيع العصب المحيطي إلى جذع العصب البصري القريب^10،13. يعطل البروتوكول الموصوف هنا غمد العصب البصري بشكل طفيف أثناء عبور العصب البصري ويسمح بتقييمات تجديد محور عصبي RGC في نموذج القطع دون الحاجة إلى التلاعب الجراحي المجهري من الناحية الفنية.

هناك عدة خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. يجب توخي الحذر لتجنب إتلاف الشريان العيني والأوعية الدموية التي تغذي رأس العصب البصري. لذلك ، يجب إكمال الخطوة 5.1 على الأقل 1.5-2.0 مم خلف الكرة الأرضية. في حالة حدوث تلف في الشريان العيني وتعطيل إمدادات الدم في الشبكية ، يجب استبعاد العين من المزيد من التجارب حيث من المحتمل أن يتبع ذلك. خلال الخطوات 5.4-5.6 ، من المهم الحفاظ على سلامة غمد العصب البصري وتقليل حجم الفتحة التي تدخل من خلالها الماصة الزجاجية إلى العصب البصري. يؤدي القيام بذلك إلى تشكيل ختم محكم حول طرف الماصة لتقليل ارتجاع السوائل ويسمح بتوليد ضغط هيدروستاتيكي كاف لعبور العصب البصري. سيؤدي شطف طرف الماصات الزجاجية إلى تحسين سهولة دخول الماصة إلى العصب البصري دون التسبب في أضرار جانبية.

هناك تعديلات محتملة يمكن للمشغلين إجراؤها لتحسين إمكانية الوصول إلى هذه الطريقة. تتضمن الإجراءات الموصوفة الحد الأدنى من تشريح وإزالة الأنسجة المدارية مع الحفاظ على العصب الوجهي وثلاثي التوائم. في حين أن هذا يقلل من المراضة ومخاطر النزيف ، إلا أن الأنسجة مثل الدهون المدارية والغدة الدمعية قد تحد من تصور الهياكل الحاسمة. قد تكون الإزالة الدقيقة للأنسجة التي تعيق المجال الجراحي ضرورية لتعزيز التصور ، خاصة في الأكبر سنا. يمكن أيضا استخدام نهج جانبي لتحسين الوصول إلى العصب البصري. ومع ذلك ، فإن التشريح الجانبي يخاطر بتلف الهياكل الإضافية بما في ذلك العصب ثلاثي التوائم ، وهو أكثر تعقيدا ، وقد يمثل تحدياته الخاصة لتوجيه الأجهزة للحقن.

أحد القيود المحتملة لهذه الطريقة هو عدم القدرة على التلاعب مباشرة بالعصب البصري وتصور القطع بالكامل بالكامل. لذلك ، هناك احتمال حدوث قطع غير مكتمل. ومع ذلك ، فقد لاحظنا أن التأكيد البصري للنهايات العصبية التي تنفصل خلال الخطوة 5.8 هو مؤشر موثوق به على القطع الناجح والكامل. إذا فشلت نهايات العصب في الانفصال ، فإن إعادة وضع ماصة الحقن أو زيادة ضغط الحقن بنسبة 50٪ يجب أن يوفر قوة كافية لعبور العصب بالكامل.

فيما يتعلق بالطرق الحالية ، يحافظ هذا النهج على سلامة غمد العصب البصري. في الحفاظ على سلامة غمد العصب البصري ، لا تتعرض نهايات العصب البصري المنقول للبيئة المدارية والجهاز المناعي المحيطي ، مما يحد من التعرض للعوامل المناعية التي يمكن أن تؤثر على استجابات RGC. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحفاظ على سلامة غمد العصب البصري أثناء عبور العصب البصري يخلق مساحة مادية مغلقة تحدها نهايات العصب البصري وغمد العصب البصري. يمكن تحقيق التوصيل الموضعي للعوامل أو الخلايا أو البوليمرات العصبية إلى الحجرة المحورية ل RGCs المصابة عن طريق الحقن في الفضاء المتشكل حديثا. ¹⁴ بدلا من ذلك ، يمكن تقييم تجديد المحور العصبي RGC في نموذج القطع عن طريق السماح لنهايات العصب البصري المنقولة بمفاغرة دون الحاجة إلى تقنيات الجراحة المجهرية الصعبة.

تشمل تطبيقات هذه الطريقة تقييم المقصورة المحورية RGC المصابة مع تدخلات خاصة بمحور عصبي لتحديد المسارات المسؤولة عن التنكس المحوري ومنع فقدان المحور بعد إصابة القطع. علاوة على ذلك ، تجعل هذه الطريقة دراسات تجديد المحور RGC في نموذج القطع في متناول مجتمع البحث الأوسع عن طريق إزالة الحاجة إلى إجراءات مفاغرة العصب البصري الصعبة تقنيا. يمكن تقييم التدخلات التي تهدف إلى تعزيز تجديد محور RGC باستخدام نموذج الإصابة الشديدة هذا وتقديم نتائج متسقة وقابلة للتكرار دون القلق من المحاور المحفوظة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL