JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا للكشف عن بروتين جنين ذبابة الفاكهة والحمض النووي الريبي وتوطينهما من الجمع إلى التضمين المسبق والتضمين ، والتلطيخ المناعي ، وتهجين الحمض النووي الريبوزي المرسال في الموقع .

Abstract

تلعب إشارات إطلاق الكالسيوم المستحثة بالكالسيوم (CICR) دورا حاسما في العديد من العمليات البيولوجية. ارتبط كل نشاط خلوي من تكاثر الخلايا وموت الخلايا المبرمج ، والتطور والشيخوخة ، إلى اللدونة المشبكية العصبية والتجديد بمستقبلات ريانودين (RyRs). على الرغم من أهمية إشارات الكالسيوم ، فإن الآلية الدقيقة لوظيفتها في التطور المبكر غير واضحة. ككائن حي مع فترة حمل قصيرة ، فإن أجنة ذبابة الفاكهة هي مواضيع الدراسة الرئيسية للتحقيق في توزيع وتوطين البروتينات المرتبطة ب CICR ومنظميها أثناء التطور. ومع ذلك ، بسبب أجنة غنية بالدهون وكوريون غني بالكيتين ، فإن فائدتها محدودة بسبب صعوبة تركيب الأجنة على الأسطح الزجاجية. في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا عمليا يعزز بشكل كبير ارتباط جنين ذبابة الفاكهة بالشرائح ويفصل الطرق لنجاح الكيمياء النسيجية والكيمياء المناعية والتهجين في الموقع. تزيد طريقة طلاء شرائح الجيلاتين بالشبة المصنوعة من الكروم وطريقة التضمين المسبق للأجنة بشكل كبير من العائد في دراسة بروتين جنين ذبابة الفاكهة وتعبير الحمض النووي الريبي. لإثبات هذا النهج ، درسنا DmFKBP12 / Calstabin ، وهو منظم معروف ل RyR خلال التطور الجنيني المبكر لذبابة الفاكهة الميلانوغاستر. حددنا DmFKBP12 في وقت مبكر من مرحلة الأديم الأرومي المخلوي وأبلغنا عن نمط التعبير الديناميكي ل DmFKBP12 أثناء التطوير: في البداية كبروتين موزع بالتساوي في الأديم الأرومي المخلوي ، ثم توطين مبدئي إلى الطبقة السفلية من القشرة أثناء الأديم الأرومي الخلوي ، قبل توزيعه في بنية الخلايا العصبية والهضم البدائية خلال مرحلة الطبقات الثلاث أحجار كريمة في المعدة المبكرة. قد يفسر هذا التوزيع الدور الحاسم الذي يلعبه RyR في أنظمة الأعضاء الحيوية التي تنشأ من هذه الطبقات: العقدة تحت المريء وفوق المريء ، والجهاز العصبي البطني ، والجهاز العضلي الهيكلي.

Introduction

تلعب إشارات إطلاق الكالسيوم المستحثة بالكالسيوم (CICR) دورا حاسما في العديد من العمليات البيولوجية ، مثل الهيكل العظمي / العضلات الملساء ووظيفة الأوعية الدموية القلبية ، وتكاثر الخلايا وموت الخلايا المبرمج ، والتنمية ، والشيخوخة ، واللدونة المشبكية العصبية ، والتجديد1،2،3،4،5،6 . مستقبلات الرايانودين (RyRs) ومستقبلات الإينوزيتول 1,4,5-trisphosphate (IP3Rs) هي لاعبين رئيسيين في مسار إشارات الكالسيوم الذي تسيطر عليه منظماتها بروتين كيناز A (PKA) ، كيناز البروتين المعتمد على Ca2 + / calmodulin II (CaMKII) ، بروتينات ربط FK506 (FKBPs) ، calsequestrin (CSQ) ، triadin ، و junctin1,2,3,4,5,6 . يمكن أن يؤدي التعبير البشري غير الطبيعي والطفرات في هذه البروتينات إلى فسيولوجيا مرضية مثل عدم انتظام ضربات القلب7 والانتشار الورمي8,9.

تنظم FKBPs إطلاق الكالسيوم من الشبكة الإندوبلازمية (ER) بواسطة RyRs. هذه العملية ضرورية لآلية الانكماش ، وبالتالي فهي مسؤولة عن جميع الحركات الميكانيكية الناتجة عن تقلص الميوسين أكتين من خلال إطلاق الكالسيوم الناجم عن الكالسيوم جنبا إلى جنب مع RyRs1,2 الجنيني. في نماذج الفئران ، يكون نقص RyR2 ومنظمه FKBP12 / Calstabin قاتلا دائما ، إما أثناء التطور الجنيني أو في فترة ما بعد الولادة المبكرة10،11،12. تظهر الفئران القاضية FKBP12 / Calstabin عيوبا قلبية حرجة مع اقتران الانقباض غير المنتظم للإثارة (EC) والوذمة الدماغية أثناء التطور الجنيني. وهذا يشير إلى أن FKBP12/Calstabin يلعب دورا أساسيا في تنظيم التعبير عن قناة RyR2، وهو أمر مهم لكل من تطور القلب والدماغ10.

تم اكتشاف شرارات الكالسيوم التي أجراها RyR في البداية في مرحلة تكوين الزيجوت لبيض ميداكا المخصب13,14. ومع ذلك ، تم إجراء عدد قليل من التحقيقات حول وظيفة إشارات الكالسيوم في التطور الجنيني المبكر. في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، توفر النتائج التي تم الحصول عليها من طفرات DmFKBP12 S107 أدلة قوية تدعم أهمية هذا الجين لتطور اليرقات وعمر صحي ، والذي يعزى إلى وظيفته ضد الإجهاد التأكسدي15,16. في الآونة الأخيرة ، حددنا التوطين الديناميكي لبروتين FKBP12 / Calstabin والحمض النووي الريبي الرسول خلال تطوير ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر المبكرة17. باستخدام الأساليب الموضحة في هذه المنهجية ، تمكنا من تتبع التعبير عن FKBP12 / Calstabin في D. melanogaster خلال الأديم الأرومي المخلوي (0-2 h) ، والأديم الأرومي الخلوي (2-3 h) ، و gastrula المبكر (3-12 h) ، و gastrula المتأخر (12-24 h). في هذه الورقة ، نقدم البروتوكولات التفصيلية لكل نهج في الدراسة السابقة ، بما في ذلك التضمين قبل الجنين لتقسيم البارافين الكلاسيكي ، ومعالجة شرائح ما قبل الطلاء للأقسام الجنينية ، وتلطيخ الكيمياء النسيجية والتلطيخ المناعي ، وتهجين mRNA في الموقع لتحديد التعبير الجيني.

Protocol

1. إعداد أطباق عصير العنب أجار

  1. أضف 5 غرام من الأجار و 5 غرام من السكروز إلى 150 مل من الماء المقطر. اغليها باستخدام الميكروويف حتى يذوب الأجار والسكروز بالكامل. اخلطي 50 مل من عصير العنب 100٪ والمحلول معا.
  2. أضف 1 مل من حمض البروبيونيك 100٪ لجعل التركيز النهائي إلى 0.5٪ حمض البروبيونيك. صب 25 مل من المحلول المحضر في كل طبق. بعد تصلب الأجار ، قم بتخزين الوسائط في 4 درجات مئوية.

2. طلاء الشرائح

  1. عالج الشرائح مسبقا بالمنظفات. اغسل الشرائح 3 مرات بماء الصنبور ومرة واحدة بالماء المقطر. ثم جفف الشرائح في فرن 45 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  2. اغمر الشرائح في حوالي 450 مل من محلول حمض الكبريتيك ثنائي كرومات البوتاسيوم (20 جم من ثنائي كرومات البوتاسيوم ، و 40 مل من الماء المقطر ، و 400 مل من حمض الكبريتيك المركز) لمدة 24 ساعة. اغسل الشرائح 3 مرات بماء الصنبور ومرة واحدة بالماء المقطر.
    1. جفف الشرائح في فرن 45 درجة مئوية لمدة ساعتين. انغمس في 95٪ من الإيثانول لأكثر من 2 ساعة.
  3. أضف 0.5 جم من كبريتات البوتاسيوم الكروم و 5 جم من الجيلاتين إلى 1 لتر من الماء المقطر. يذوب في حمام مائي 60 درجة مئوية قبل الاستخدام. يمكن تخزين جيلاتين شبة الكروم عند 4 درجات مئوية لفترات طويلة.
  4. أسقط 10 ميكرولتر من جيلاتين شبة الكروم على الشريحة وقم بتغطية سطح الشريحة بالكامل وبشكل متساو باستخدام المحلول. ضع الشريحة مع جانب الجيلاتين لأعلى في فرن على درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. يمكن تخزين الشرائح المعدة عند 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.
    ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. الطلاء الكامل ضروري. بالنسبة لذبابة الفاكهة وجنينها ، يبدو نهج طلاء الشرائح هذا أكثر كفاءة من طلاء البولي ليسين.

3. تضمين جنين ذبابة الفاكهة

  1. جمع أجنة ذبابة الفاكهة
    ملاحظة: جمعنا أجنة ذبابة الفاكهة في أربع فترات من 0-2 ساعة (الأديم الأرومي المخلوي) ، 2-3 ساعات (الأديم الأرومي الخلوي) ، 3-12 ساعة (المعدة المبكرة) و 12-24 ساعة (أواخر المعدة)18. ويبين الجدول 1 نسبة أنواع الأجنة الرئيسية في كل فترة.
    1. ضع 400-500 ذباب في زجاجة تجميع بلاستيكية وقم بتغطية الزجاجة بطبق أجار عصير العنب الذي يحتوي على مستخلص الخميرة. يتم وضع أجنة ذبابة الفاكهة على عصير العنب أجار في درجة حرارة الغرفة.
    2. اجمع أربع فترات من الأجنة ، وأضف بلطف 2 مل من PBS (137 mM NaCl ، 2.7 mM KCL ، 10 mM Na2HPO4 ، 2 mM KH2PO4 ، pH 7.4) إلى كل لوحة لتعويم الأجنة. انقل حوالي 200 جنين إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل واحتفظ به على الجليد لمدة دقيقتين ليستقر الأجنة.
  2. التضمين المسبق
    1. نقل 200 جنين ذبابة الفاكهة إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 مل. احتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 2 دقيقة لتسوية الأجنة ، ثم تخلص من السوبرناتانت باستخدام الماصة بعناية. أضف 1 مل من المبيض بنسبة 50٪ في الأنبوب ورجه بلطف لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يكون المبيض طازجا ، ويمكن أن تختلف كمية المبيض اعتمادا على كمية الأجنة التي تم جمعها.
    2. جمع الأجنة بلطف عن طريق صب على ورق الترشيح وغسلها 3 مرات مع 1 مل من PBS في كل مرة.
    3. انقل الأجنة بورق الترشيح إلى حوالي 5 مل من n-heptane.
    4. انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل. أضف 1 مل من الميثانول ورجه بلطف. جمع الأجنة بعد الترسيب.
    5. إزالة supernatant وغسل الأجنة في 1 مل من PBS 3-5 مرات.
    6. إصلاح الأجنة مع 400 ميكرولتر من محلول بوين (71 ٪ حمض البيكريك المشبع ، 24 ٪ الفورمالين ، 5 ٪ حمض الخليك) لمدة 30 دقيقة. اغسل الأجنة الثابتة 3 مرات في 1 مل من PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
    7. لتجميع الأجنة ، انقل العينات إلى سدادة مطاطية وقم بإزالة PBS.
    8. تحضير محلول agarose-PBS بنسبة 1.2٪ والحفاظ على المحلول عند 60 درجة مئوية. أضف 200 ميكرولتر من محلول الأغاروز-PBS بنسبة 1.2٪ على الأجنة لإصلاحها في كتلة أجار.
    9. أخرج الكتلة من السدادة وخزنها في PBS.
      ملاحظة: أثناء نهج ما قبل التضمين ، يعد دعم الاحترار أمرا بالغ الأهمية لتحقيق النجاح. نقترح بشدة أن تكون أنابيب الطرد المركزي ونصائح الماصة الدقيقة ، والتي سيتم استخدامها في هذه الخطوة ، دافئة تماما قبل التشغيل.
  3. تضمين البارافين
    1. اغمر كتلة الأجار المضمنة مسبقا في 35٪ إيثانول و 50٪ إيثانول و 75٪ إيثانول و 85٪ إيثانول لمدة 15 دقيقة لكل منهما. ثم تراجع 2 مرات في 95 ٪ من الإيثانول و 100 ٪ من الإيثانول.
      ملاحظات: حوالي 5-10x من حجم الكتلة لكل منها متبوعا بمثبت متدرج لمدة 15-30 دقيقة ضروري اعتمادا على عدد الأجنة في الكتلة.
    2. اغمر كتلة الأجنة في محلول الإيثانول والزيلين بنسبة 100٪ (نسبة 1: 1) لمدة 15 دقيقة.
    3. انقل الكتلة إلى الزيلين لمدة 1 دقيقة لجعل أنسجة الجنين شفافة.
    4. اغمر الكتلة في الزيلين والبارافين (نسبة 1: 1) لمدة 30 دقيقة.
    5. غمر الكتلة في البارافين الأول والبارافين الثاني والبارافين الثالث لمدة 2 ساعة في كل مرة.
    6. املأ صندوق التضمين بالبارافين مسبقا ، ثم انقل الكتلة بلطف وأفقيا إلى أسفل مربع التضمين. بعد تصلب البارافين بشكل طبيعي ، يمكن تخزين كتلة البارافين الصلبة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظات: يمكن استخدام العينة المضمنة مسبقا في التقسيم بالتبريد باتباع الخطوات التالية. بعد أن يتم تضمين الأجنة مسبقا مع الأغاروز كما هو موضح أعلاه ، يتم تضمين العينات ببساطة في مركب OCT. بعد ذلك ، يمكن إجراء التشريح بالتبريد وفقا لبروتوكول الاستئصال بالتبريد الروتيني. في وقت لاحق ، يمكن استخدام أساليب تلطيخ منتظمة على الأقسام.

4. تلطيخ الهيماتوكسيلين إيوسين

  1. تحضير أقسام جنين ذبابة الفاكهة . ضع المقاطع المحضرة في فرن على درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم اغمر الأقسام في الزيلين مرتين لمدة 10 دقائق لكل منها. اغمر الأقسام مرة واحدة في 100٪ من الإيثانول والزيلين (نسبة 1: 1) لمدة دقيقتين.
  2. قم بترطيب الأقسام بنسبة 100٪ إيثانول I ، و 100٪ إيثانول II ، و 95٪ إيثانول ، و 85٪ إيثانول ، و 75٪ إيثانول ، و 50٪ إيثانول ، وفي ماء مقطر لمدة 3 دقائق.
  3. قم بتلطيخ الأقسام بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة. اغمس الشرائح في محلول كحول حمضي بنسبة 1٪ (1 مل من حمض الهيدروكلوريك ، 100 مل من الإيثانول بنسبة 70٪) بسرعة واغسل الشرائح في الماء المقطر.
  4. اغمس الشرائح في 50٪ إيثانول ، و 75٪ إيثانول ، و 85٪ إيثانول ، و 95٪ إيثانول بالتتابع.
  5. قم بتلطيخ الأقسام بمحلول eosin لمدة 1 دقيقة.
  6. تجفيف الشرائح في 95٪ الإيثانول الأول ، 95٪ الإيثانول الثاني ، 95٪ الإيثانول الثالث ، 100٪ الإيثانول الأول ، 100٪ الإيثانول الثاني و 100٪ الإيثانول الثالث لمدة 1 دقيقة في كل مرة.
  7. قم بمسح الشرائح بنسبة 100٪ زيلين I و 100٪ xylene II و 100٪ xylene III لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  8. قم بتركيب الشرائح ببلسم محايد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

5. تلطيخ الحمض والفضة الدورية ميثينامين

  1. قم بإزالة البارافين وترطيب أقسام البارافين من جنين ذبابة الفاكهة إلى الماء المقطر.
  2. أكسدة الأقسام في حمض دوري 1٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. شطف الشرائح في الماء المقطر 3 مرات لمدة 1 دقيقة لكل منهما.
  4. احتضن الشرائح في حوالي 40 مل من محلول عمل الميثينامين الفضي المصفى حديثا (3٪ ميثينامين ، نترات الفضة 5٪ ، محلول بورات الصوديوم 5٪) لمدة 1 ساعة و 20 دقيقة عند 60 درجة مئوية. ثم شطف الشرائح في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة.
  5. قم بتنغيم الشرائح في كلوريد الذهب بنسبة 0.2٪ لمدة دقيقتين ثم اشطف الشرائح في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة.
  6. ضع الشرائح في 3٪ ثيوسلفات الصوديوم لمدة 3 دقائق ثم اشطف الشرائح في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة.
  7. قم بتلطيخ الشرائح في الهيماتوكسيلين لمدة 30 ثانية. اغسل الشرائح في ماء الصنبور الجاري لمدة 3-5 دقائق.
  8. تجفيف الشرائح في 70٪ الإيثانول ، 80٪ الإيثانول ، 95٪ الإيثانول الأول ، 95٪ الإيثانول الثاني ، 95٪ الإيثانول الثالث ، 100٪ الإيثانول الأول ، و 100٪ الإيثانول الثاني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  9. قم بمسح الشرائح بنسبة 100٪ xylene I و 100٪ xylene II و 100٪ xylene III لمدة 5 دقائق لكل منها.
  10. قم بتركيب الشرائح في بلسم محايد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

6. الكيمياء النسيجية المناعية

  1. إزالة البارافين وإعادة ترطيب أقسام البارافين من جنين ذبابة الفاكهة إلى PBS باتباع البروتوكول القياسي19.
  2. عالج الشرائح بنسبة 0.3٪ H2O2 في الميثانول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجنب الضوء.
  3. قم بتسخين المخزن المؤقت المناسب لاسترجاع المستضد مسبقا لتقارب 100 درجة مئوية في حاوية مع الشرائح الموجودة في باخرة الخضار. يجب أن يكون للحاوية أيضا غطاء. ضع الشرائح في الحاوية. أغلق غطاء الباخرة.
    1. احتفظ بالحاوية في الباخرة لمدة 20 دقيقة من هذه النقطة. لاحظ أنه لا ينبغي تشديد غطاء حاوية الشريحة بالكامل حتى يتمكن بخار الماء من الدخول أثناء عملية التبخير.
  4. اسمح للشرائح بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة قبل شطفها بلطف في PBS-T (PBS مع Tween-20 ، الرقم الهيدروجيني 7.2) 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ، ثم اشطف الشرائح في PBS 3 مرات لمدة 1 دقيقة لكل منها.
  5. قم بحظر الشرائح باستخدام ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 1٪ في PBS لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. احتضن الشرائح بالأجسام المضادة الأولية (anti-FKBP12 في الساعة 1:1000) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات.
  7. اغسل الشرائح في PBS-T 4 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
  8. ضع الشرائح مع البوليمر المسمى HRP مقترنا بالأجسام المضادة الثانوية (anti-Rabbit ، 1: 5000) لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. افعل ذلك في الظلام لتجنب تبييض الصور.
  9. اغسل الشرائح في PBS-T 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
  10. احتضن الشرائح بنسبة 5٪ 3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) لمدة 2-10 دقائق حتى يصبح لون منتجات التفاعل مناسبا تحت المجهر.
  11. قم بتلطيخ الشرائح في الهيماتوكسيلين لمدة 30 ثانية واغسل الشرائح في الماء المقطر 2 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  12. تجفيف الشرائح في 50 ٪ من الإيثانول ، و 70 ٪ من الإيثانول ، و 90 ٪ من الإيثانول ، و 95 ٪ من الإيثانول ، و 100 ٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة لكل منهما.
  13. قم بمسح الشرائح بنسبة 100٪ xylene I و 100٪ xylene II و 100٪ xylene III لمدة 5 دقائق لكل منها.
  14. قم بتركيب الشرائح في بلسم محايد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

7. التهجين في الموقع

ملاحظة: تم تحضير أقسام جنين ذبابة الفاكهة بالماء المعالج بنسبة 0.01٪ من ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC). جميع الملحقات المستخدمة في التهجين في الموقع تطبق علاج DEPC بين عشية وضحاها مقدما.

  1. إعداد ريبوبروب
    1. قم بخطي الحمض النووي للقالب عن طريق القطع في موقع إنزيم تقييد في اتجاه المصب من الإدراج المستنسخ باستخدام إنزيم تقييد يخلق 5 'متدليات. بعد الخطية ، قم بتنقية الحمض النووي للقالب عن طريق استخراج الفينول / الكلوروفورم ، وهطول الأمطار اللاحق للإيثانول. استخدم البروتوكولات القياسية.
    2. أضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي للقالب النقي إلى أنبوب طرد مركزي خال من RNase. ضع أنبوب الطرد المركزي على الجليد. أضف ما يكفي من المياه المعالجة ب DEPC إلى الحجم الإجمالي 13 ميكرولتر.
      1. ثم أضف الكواشف التالية بالترتيب: 2 ميكرولتر من خليط وضع العلامات 10x NTP ، 2 ميكرولتر من مخزن النسخ المخزن المؤقت 10x ، 1 ميكرولتر من مثبط RNase الواقي ، 2 ميكرولتر من RNA Polymerase SP6 أو RNA Polymerase T7.
    3. امزج التفاعل عن طريق السحب وأجهزة الطرد المركزي قريبا. احتضن لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: الحضانات الأطول لا تزيد من إنتاجية الحمض النووي الريبي الموسوم. يعد الدوران القصير (~ 800 دورة في الدقيقة) المطبق على أنبوب التفاعل ضروريا قبل المتابعة إلى الخطوة التالية. سيسمح هذا الدوران لجميع المحتويات ، التي يمكن أن تولد من الحضانة ، بالوصول إلى أسفل الأنبوب.
    4. أضف 2 ميكرولتر من DNase I الخالي من RNase لإزالة الحمض النووي للقالب واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    5. أضف 2 ميكرولتر من 200 مللي متر EDTA (الرقم الهيدروجيني 8.0) لإيقاف التفاعل.
      ملاحظة: يمكن تخزين مجسات الحمض النووي الريبي التي تحمل علامة الحفر عند -15 إلى -25 درجة مئوية في الإيثانول لمدة عام واحد.
  2. ما قبل التهجين من قسم جنين ذبابة الفاكهة
    1. ضع أجزاء من جنين ذبابة الفاكهة في فرن 42 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    2. قم بإزالة البارافين من الشرائح بنسبة 100٪ من الزيلين لمدة 10 دقائق مرتين.
    3. قم بترطيب الشرائح عن طريق الغمر بالتتابع في 100٪ إيثانول ، و 95٪ إيثانول ، و 90٪ إيثانول ، و 70٪ إيثانول ، و 50٪ إيثانول لمدة 5 دقائق.
    4. احتضان الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق 3 مرات لإزالة محلول التثبيت / محلول بوين من الأنسجة.
    5. اغسل الشرائح بمحلول جليسين / PBS 100 مليمول / لتر 2 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    6. اغسل الشرائح باستخدام PBS 2 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
    7. احتضان الشرائح بنسبة 0.3٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة لاختراق الأغشية.
    8. اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
    9. احتضن الشرائح في 15 ميكروغرام / مل من بروتين K الخالي من RNase لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    10. احتضان الشرائح مع 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 3 دقائق لوقف الهضم.
    11. اغسل الشرائح باستخدام PBS 2 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
    12. احتضان الشرائح في 100 mM ثلاثي إيثانولامين العازلة (الرقم الهيدروجيني 8.0) مع 0.25٪ (v / v) أنهيدريد الخليك 2 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    13. أضف ماء DEPC إلى غرفة رطوبة الشريحة. أضف 20 ميكرولتر من محلول ما قبل التهجين (الذي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من الحمض النووي للحيوانات المنوية للسلمون) على الشرائح. ضع الشرائح في غرفة رطوبة الشريحة. احتضان الشرائح عند 42 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
      ملاحظة: من الضروري التأكد من ضيق غطاء الصندوق الرطب وأن الصندوق الرطب يتم الاحتفاظ به دائما في وضع أفقي لمنع التطاير والانحراف عن أنسجة محلول ما قبل التهجين ومحلول التهجين التالي.
  3. تهجين قسم جنين ذبابة الفاكهة
    1. قم بإزالة محلول ما قبل التهجين واغسل الشرائح باستخدام 0.2x SSC (150 mM chloride sodium ، 15 mM sodium citrate ، pH 7.0) 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. امسح 0.2x SSC الزائد حول عينات الأنسجة.
    2. ضع 30 ميكرولتر من محلول تهجين المسبار (الذي يحتوي على 2-6 نانوغرام من مسبار الحمض النووي الريبي المسمى بالديجوكسين عن طريق التخفيف في محلول ما قبل التهجين) باستخدام ماصة. احتضن الشرائح في غرفة رطوبة الشريحة عند 42 درجة مئوية لمدة 20 ساعة تقريبا.
      ملاحظة: تأكد من ضيق الغطاء كاقتراح للملاحظة الأخيرة. خلاف ذلك ، فإن الجفاف الناجم عن تسرب إما ما قبل التهجين أو ما قبل التهجين سيولد خلفية قذرة بما في ذلك الإيجابية الزائفة في الشرائح.
  4. التهجين
    1. قم بإزالة محلول التهجين واغسل الشرائح بمحلول SSC 4x 4 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها عند 37 درجة مئوية.
    2. اغسل الشرائح في محلول SSC 2x باستخدام 20 ميكروغرام / مل من RNase A لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. اغسل الشرائح في محلول 1x SSC لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. اغسل الشرائح في محلول SSC بمعدل 0.5 مرة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    5. اغسل الشرائح في محلول SSC 0.1x لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    6. اغسل الشرائح باستخدام PBS 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
    7. اغسل الشرائح في مخزن الغسيل المؤقت (100 ملليمتر حمض الماليك ، 150 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، 0.3٪ (v / v) Tween 20 ، الرقم الهيدروجيني 7.5) لمدة 1 دقيقة.
    8. احتضن الشرائح في 100 مل من محلول الحجب الطازج (مصل الأغنام 2٪ في مخزن حمض الماليك المخزن المؤقت بدون Tween 20) لمدة 30 دقيقة.
    9. احتضن الشرائح في 20 مل من محلول الأجسام المضادة لمدة 45 دقيقة.
      1. قم بالطرد المركزي للجسم المضاد لمدة 5 دقائق عند 10000 دورة في الدقيقة في القارورة الأصلية قبل كل استخدام ، وقم بسحب الكمية اللازمة بعناية من السطح. تمييع مضاد الديجوكسيجينين-AP 1:5000 (150 mU / mL) في محلول الحظر.
    10. اغسل الشرائح في 100 مل من مخزن الغسيل المؤقت مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما لإزالة اقتران الأجسام المضادة غير المقيد.
    11. قم بموازنة الشرائح في 20 مل من المخزن المؤقت للكشف (100 mM Tris-HCl ، 100 mM NaCl ، الرقم الهيدروجيني 9.5) لمدة 2-5 دقائق.
    12. احتضن الشرائح ب 10 مل من محلول الركيزة الملونة المحضر حديثا في غرفة رطوبة الشريحة. يبدأ التفاعل في غضون بضع دقائق ويكتمل بعد 16 ساعة. لا تهتز أو تخلط أثناء تطور اللون.
    13. اغسل الشرائح ب 50 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لوقف التفاعل.
    14. جفف العينة بين عشية وضحاها في الظلام.
    15. تجفيف الشرائح في 70٪ الإيثانول ، 80٪ الإيثانول ، 90٪ الإيثانول ، 95٪ الإيثانول ، 100٪ الإيثانول I و 100٪ الإيثانول II لمدة 3 دقائق لكل منهما.
    16. قم بمسح الشرائح بنسبة 100٪ زيلين I و 100٪ xylene II و 100٪ xylene III لمدة 20 دقيقة لكل منها.
    17. قم بتركيب الشرائح ببلسم محايد.
    18. قم بتوثيق الصور وتحليلها باستخدام المجهر المقلوب وبرنامج الشركة المصنعة. قم بإجراء تحليل التوزيع باستخدام ImageJ وفقا لكثافة الإشارة الموجبة إما على طول المحور الطولي أو داخل المنطقة التفاضلية للأجنة.
      ملاحظة: أثناء الحضانة باستخدام محلول الركيزة اللونية المعد حديثا في الخطوة 7.4.12 ، يمكن رؤية لون التفاعل حتى بالعين العارية. هذه الملاحظة حول كيفية فحص تطور اللون تحت المجسم. بمجرد أن يصبح لون التفاعل معقولا ويمكن تنفيذ الخطوة 7.4.13 لوقف التفاعل.

النتائج

وتصف الأرقام البروتوكولات المستخدمة للتغلب على التحدي المتمثل في ربط أجنة ذبابة الفاكهة المحتوية على الدهون العالية والكيتين (الجدول 1) بسطح الشريحة الزجاجية للفحص والتجريب. باستخدام طريقة طلاء شرائح الجيلاتين بالشبة الكروم الموضحة في الشكل 1 ، قمنا بتعزيز ...

Discussion

تعد إشارات الكالسيوم بوساطة RyRs و IP3Rs مسارا أساسيا في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية لكل من الحيوانات الفقارية واللافقارية1،2،3،4. في البشر ، تؤدي الطفرات النقطية ، مثل طفرة R4496C المرتبطة ب CPVT ، في جين RyR2 إلى تسرب ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (#31771377 / 31571273 / 31371256) ، وبرنامج العلماء المتميزين الأجانب من وزارة التعليم الوطنية (#MS2014SXSF038) ، وصندوق أبحاث الجامعات المركزية التابع للإدارة الوطنية للتعليم (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) ، ويدعم XZ صندوق أطروحة الدكتوراه المتميز (#2019TS082 / 2019TS079) ، والبرنامج الرئيسي لإدارة التعليم في مقاطعة شنشي (#20JS138) ، مشروع شباب برنامج البحوث الأساسية للعلوم الطبيعية التابع لإدارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة شنشي (#2020JQ-885).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
-20°C RefrigeratorMeiling Biology &MedicalDW-YL270Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigeratorThermoForma 90 SeriesUsed for regent storage
AgarSigma-AldrichWXBB6360VPreparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsRoche11093274910For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubatorShanghai Bluepard InstrumentsLRH-250In-situ Hybridization
Bouin's solutionSinopharm Chemical Reagent at Beijing69945460Drosophila Embryo Embedding
CentrifugeEppendorf540BH07808In-situ Hybridization
Centrifuge tubeDenvilleC-2170Drosophila Embryo Collection
Chrome AlumSinopharm Chemical Reagent at Beijing10001018Coating Slides
Constant temperature water bathJintan Henfeng InstrumentsKW-1000DCHematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection SystemDakoK5007In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPCSigma-AldrichD5758In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling KitRoche11093274910RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogasterBloomington Stock CenterBDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying ovenTianjin Taiste Instruments101-0ABFor coating slides and paraffin embedding
EosinSigma-Aldrich230251Hematoxylin-Eosin Staining
EthanolSinopharm Chemical Reagent at Beijing100092680Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
GelatinSinopharm Chemical Reagent at Beijing10010328Coating Slides
Gold chlorideSigma-Aldrich379948Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
HematoxylinSigma-AldrichH3136Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification KitRoche11732668001For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity boxNingbo Jiangnan InstrumentsHWSFor fly maintenance
LE AgaroseHyAgarose14190108029Pre-embedding
MethanolSinopharm Chemical Reagent at Beijing10014108Drosophila Embryo Collection
MicroscopeZEISSObserver.A1Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope SlidesMeVid Labware ManufacturingP105-2001Coating Slides
Neutral GumSinopharm Chemical Reagent at Beijing10004160Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptaneSinopharm Chemical Reagent at Beijing40026768Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicerHuahai science instrumentHH-2508IIIIn-situ Hybridization
ParaffinSinopharm Chemical Reagent at Beijing69019461Paraffin Embedding
pH/mV MeterSartoriusPB-10For determing the pH value of a solution
Silver nitrateSinopharm Chemical Reagent at Beijing10018461Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meterThermoAFXI-0501-PIn-situ Hybridization
XyleneSinopharm Chemical Reagent at Beijing10023418Paraffin Embedding

References

  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
  3. Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
  4. Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
  5. Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
  6. George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
  7. Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  8. Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
  9. Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  10. Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
  11. Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
  12. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  13. Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
  14. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
  15. Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
  16. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  17. Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
  19. Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
  20. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  21. Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
  22. Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
  23. Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
  24. Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
  25. Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183 DmFKBP12 Calstabin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved