استخدام تحليل الصور القائم على الكمبيوتر لتحسين القياس الكمي لنقائل الرئة في نموذج سرطان الثدي 4T1

Summary

نحن نصف طريقة أكثر اتساقا وسرعة لتحديد الانبثاث الرئوي في نموذج سرطان الثدي 4T1 باستخدام فيجي-ImageJ.

Abstract

يعد سرطان الثدي من الأمراض الخبيثة المدمرة، حيث يمثل 40,000 حالة وفاة للإناث و30٪ من تشخيصات سرطان الإناث الجديدة في الولايات المتحدة في عام 2019 وحده. السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بسرطان الثدي هو العبء النقيلي. ولذلك، تحتاج النماذج قبل السريرية لسرطان الثدي لتحليل العبء النقيلي لتكون ذات صلة سريريا. نموذج سرطان الثدي 4T1 يوفر نموذج الماوس تلقائيا- الانبثاث, كميا للمرحلة الرابعة سرطان الثدي البشري. ومع ذلك، فإن معظم بروتوكولات 4T1 تحدد العبء النقيلي من خلال عد المستعمرات الملطخة يدويًا على لوحات زراعة الأنسجة. في حين أن هذا يكفي للأنسجة ذات العبء النقيلي المنخفض ، فإن الخطأ البشري في العد اليدوي يسبب نتائج غير متناسقة ومتغيرة عندما تكون اللوحات نقاشًا ويصعب عدها. تقدم هذه الطريقة حلاً يستند إلى الكمبيوتر إلى خطأ العد البشري. هنا، نقوم بتقييم البروتوكول باستخدام الرئة، وهو نسيج النقيلي للغاية في نموذج 4T1. يتم الحصول على صور للوحات الميثيلين ذات اللون الأزرق وتحميلها للتحليل في فيجي -ImageJ. ثم يحدد Fiji-ImageJ النسبة المئوية للمنطقة المحددة من الصورة التي تكون زرقاء، وتمثل النسبة المئوية للصفيحة ذات العبء النقيلي. هذا النهج القائم على الكمبيوتر يقدم نتائج أكثر اتساقا وأسرع من العد اليدوي أو التقييم الهسجولوجي للأنسجة النقيلي عالية. يعتمد اتساق نتائج فيجي-ImageJ على جودة الصورة. يمكن أن تحدث اختلافات طفيفة في النتائج بين الصور ، وبالتالي يوصى بأن يتم التقاط صور متعددة ومتوسط النتائج. على الرغم من الحد الأدنى من القيود، وهذا الأسلوب هو تحسين لتحديد حجم العبء النقيلي في الرئة من خلال تقديم نتائج متسقة وسريعة.

Introduction

وسيتم تشخيص واحدة من كل ثماني نساء بسرطان الثدي في حياتها, وحتى الآن على الرغم من خيارات العلاج المتعددة سرطان الثدي هو السبب الرئيسي الثاني للوفيات المرتبطة بالسرطان في النساء الأميركيات¹. هؤلاء النساء لا يموتون من الورم الأساسي في ثديهم. بدلا من ذلك، فإن العبء النقيلي هو المسؤول عن وفيات هذا المرض لأنه ينتشر عادة إلى الرئة والعظام والدماغ والكبد والغدد الليمفاوية². وبسبب هذا، تحتاج نماذج سرطان الثدي إلى تقييم الانبثاث للمساهمة في الحد من وفيات هذا المرض. نموذج سرطان الثدي 4T1 مورين هو بروتوكول رائع لتحقيق ذلك. الطريقة الموصوفة هنا تقدم تحسنا لنموذج 4T1 باستخدام فيجي-ImageJ لتحديد ورم خبيث الرئة، مما يؤدي إلى نتائج متسقة وسريعة.

نموذج 4T1 هو راسخ, مع معظم مختبرات استخدام بروتوكولات مثل تلك التي وصفها بولاسكي و Ostrand روزنبرغ في 2001³. خط الخلية 4T1 هو 6-Thioguanine (6TG) مقاومة وممثل للمرحلة الرابعة، وسرطان الثدي الثلاثي السلبية^3،4،5. وهو ذو صلة سريريا كما هو نموذج تقويم العظام و الانبثاث تلقائيا إلى نفس الأجهزة كما هو الحال في سرطان الثدي البشري^3,4. الخلايا 4T1 تلقائياً نقّل بمعدل يمكن التنبؤ به استناداً إلى كمية الخلايا المحقونة^3,4. والأهم من ذلك، أن الاختلافات الجينية بين الفئران المستخدمة هنا تسببت في حدوث تقلب متوقع بين الأفراد في العبء النقيلي. لتقييم الانبثاث، يتم حصاد الأنسجة لجمع وتحديد الخلايا السرطانية في مواقع بعيدة باستخدام اختيار 6TG وتلطيخ الميثيلين الأزرق. والنتيجة هي مجموعة من لوحات ثقافة الأنسجة مع النقاط الزرقاء التي تمثل المستعمرات النقيلي. ومع ذلك، فإن بروتوكول بولاسكي وأوستراند روزنبرغ يحددان كمياً المستعمرات النقيلية عن طريق عدها يدوياً، وبالتالي كان هذا هو الوسيلة القياسية لتقييم الانبثاث في هذا النموذج. في حين أن هذا سهل للأنسجة ذات العبء النقيلي المنخفض ، فإن الأنسجة مثل الرئتين غالباً ما تكون محملة بالنقائل. كما يمكن أن تكون لوحات الرئة اثقا جدا، بدقة ودقة تحديد حجم المستعمرات النقيلي عن طريق العد اليدوي من الصعب وعرضة للخطأ البشري. لقياس العبء النقيلي بشكل أفضل، فإننا نصف استخدام فيجي-ImageJ لحل يستند إلى الكمبيوتر لخطأ العد البشري. تحليل الهستوباتولوجي مع الدم و eosin (H & E) تلطيخ وسيلة أخرى لتحديد الانبثاث الرئة، ومن المثير للاهتمام كما تم تحسين مع فيجي-ImageJ البرمجيات^6،7. ومع ذلك، لأن التحليل الهستوولوجي يلاحظ شريحة واحدة من الرئة، يمكن أن تكون غير دقيقة وغير تمثيلية. وذلك لأن نموذج 4T1 يسبب العديد من الآفات النقيلي في جميع أنحاء الجهاز التي لا توزع بالتساوي. في حين أن الاتجاهات العامة بين التحليل الهدولوجي والعد اليدوي يمكن أن تكون مماثلة⁸، يمكن أن تختلف القيم الفردية ، وبالتالي لا ينبغي استخدام التحليل الهستوولوجي كوسيلة وحيدة للكمية. نحن نبرهن على الفائدة مقارنة مع التحليل الهستوولوجي والتناقضات في العد اليدوي بين العدادات المختلفة ، مع إظهار اتساق استخدام فيجي ImageJ. بالإضافة إلى ذلك، نُظهر أن هذه الطريقة يمكن أن تقلل وقت الحضانة من 10-14 يومًا إلى 5 أيام، مما يعني أن الباحثين يمكنهم تحليل البيانات من دراستهم في وقت أقرب بكثير من الاعتماد على العد اليدوي.

هذه الطريقة هي مجموعة من التعديلات البسيطة على بروتوكول بولاسكي وأوستراند روزنبرغ³. نظرًا لأن نموذج 4T1 مستخدم على نطاق واسع ، ولأن الانبثاث الرئوي هو معلمة حاسمة لقياس في النماذج قبل الظهر ، نعتقد أن هذه الطريقة يمكن استخدامها على نطاق واسع وذات قيمة عالية للباحثين في سرطان الثدي. الإمدادات الإضافية الوحيدة اللازمة هي الكاميرا والوصول إلى جهاز كمبيوتر مع فيجي ImageJ، وهو برنامج مجاني يستخدم بشكل متكرر في تحليل الصور⁹. تركز هذه الطريقة على وجه التحديد على الانبثاث الرئوي، ولكن يمكن استخدامه للأنسجة الأخرى ذات العبء النقيلي الكبير.

Protocol

وقد وافقت على جميع الأساليب المذكورة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في جامعة فرجينيا للتكنولوجيا، ووفقا للدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. ويتطلب تنفيذ هذا البروتوكول إذنا من المؤسسات المناسبة والالتزام بجميع المبادئ التوجيهية المناسبة.

1. خلية ثقافة

1. جعل وسائل الإعلام ثقافة كاملة (دورة في الدقيقة + 10٪ مصل البقرة الجنينية +1٪ القلم). إحياء خلايا 4T1 وفقا لبروتوكول ATCC¹⁰ واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في قارورة T-25 حتى التقاء. تغيير وسائل الإعلام في اليوم التالي إحياء لإزالة الخلايا الميتة، ومرة أخرى إذا كان يتم إنفاق الوسائط قبل الخلايا هي التقاء بما فيه الكفاية للمرور.
2. مرة واحدة في قارورة T-25 هو التقاء, مرور الخلايا إلى قارورة T-75 عن طريق التخلص من وسائل الإعلام, غسل قارورة مع 5 مل من 1x الفوسفات الفوسفات المالحة (DPBS), وإضافة 500 ميكرولتر من تريبسين-EDTA. احتضان لمدة 5-10 دقائق في 37 درجة مئوية حتى الخلايا فصل.
   1. بمجرد فصل، إضافة 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة كاملة الدافئة إلى الخلايا. التعرق ونقل 5 مل إلى قارورة T-75 تحتوي على 15 مل من وسائل الإعلام ثقافة كاملة الدافئة.
3. خلايا المرور في قارورة T-75 أربع مرات على الأقل. القيام بذلك مرة واحدة يتم التقاء القارورة عن طريق الغسيل مع 8 مل من 1X DPBS، مضيفا 1 مل من تريبسين-EDTA لفصل الخلايا، مضيفا 10 مل من وسائل الإعلام الدافئة إلى الخلايا، وتمييع 1:6-1:8 في قارورة T-75 جديدة تحتوي على 20 مل من وسائل الإعلام الثقافة كاملة الدافئة.
4. الخلايا ممر يصل إلى العدد المناسب من قارورة T-150 التي تحتوي على 40 مل من وسائل الإعلام ثقافة كاملة الدافئة لعدد الفئران التي سيتم حقنها. معظم الدراسات تتطلب قارورة T-150 متعددة لضمان خلايا كافية للحقن.
5. عندما الفئران على استعداد للحقن (8 أسابيع من العمر أو وزنها أكثر من 20 غرام، اعتمادا على IACUC أو بروتوكولات مؤسسية)، حصاد الخلايا عن طريق التخلص من وسائل الإعلام، وغسل كل قارورة مع 10 مل من 1X DPBS وإضافة 2 مل من تريبسين-EDTA. احتضان لمدة 5-10 دقائق في 37 درجة مئوية حتى الخلايا فصل.
6. غسل قارورة مع 10 مل من وسائل الإعلام كاملة ونقل جميع المحتويات (10 مل من وسائل الإعلام + 2 مل من تريبسين-EDTA خلية الخليط) إلى القارورة المقبل. الاستمرار في غسل وجمع الخلايا من كل قارورة باستخدام نفس 10 مل من وسائل الإعلام لتجنب استخدام كمية مفرطة من وسائل الإعلام.
   1. بمجرد أن يتم جمع جميع القارورة، قم بنقل المحتويات إلى أنبوب طرد مركزي 50 مل. جمع عينة 10 ميكرولتر للعد في أنبوب microcentrifuge والطرد المركزي أنبوب مخروطي 50 مل في 125 × ز لمدة 5 دقائق.
7. في حين يجري الطرد من الخلايا، إضافة 10 ميكرولتر من الأزرق Trypan إلى 10 ميكرولتر من عينة الخلية. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. وبمجرد تحديد العدد الإجمالي للخلايا، حساب تركيز الخلايا اللازمة لحقن الفئران ل1.2 × 10⁶ خلايا لكل فأر (لكل 100 ميكرولتر).
8. بعد الطرد المركزي، وسائل الإعلام decant و resuspend بيليه خلية في كمية صحيحة من DPBS 1x العقيمة ل1.2 × 10⁶ الخلايا لكل 100 ميكرولتر. انقسام خلية / DPBS خليط في أنابيب microcentrifuge لسهولة الوصول مع حقنة عند خلايا التعرق للحقن. إبقاء الخلايا على الجليد وحقن قريبا بعد ذلك كما الخلايا سوف تبدأ في الموت بعد أن يجري على الجليد لفترات طويلة من الزمن.

2. الحقن

1. إعداد الخلايا للحقن عن طريق التنصت أو خلط بلطف أنبوب microcentrifuge لثني الخلايا، ومن ثم pirate 600 ميكرولتر في حقنة 1 مل. بدوره حقنة صعودا وسحب المكبس إلى أسفل لجلب الخلايا بعيدا عن فتح الحقنة. اضغط على حقنة لتخليصه من فقاعات الهواء.
2. قم بتوصيل الإبرة المشطوة إلى الأعلى وينال الخلايا مرة أخرى إلى أنبوب الطرد الدقيق حتى يبقى 500 ميكرولتر فقط في الحقنة. وضع حقنة مسطحة على الجليد.
   ملاحظة: تسقط خلايا 4T1 من التعليق بسرعة. ولذلك، فمن المهم لخلط الخلايا مرة أخرى إلى تعليق عن طريق التنصت في كثير من الأحيان.
3. تخدير 8 أسابيع من العمر / > 20 ز أنثى BALB / ج الماوس باستخدام ايزوفلوران أو غيرها من وكيل التخدير المعتمدة. مراقبة التنفس الماوس لتقييم عمق التخدير.
4. مرة واحدة يتم تخدير الماوس بشكل صحيح كما هو مبين من عدم وجود انعكاس القرنية، ووضع الماوس على ظهره. باستخدام الإبهام، المؤشر، والإصبع الأوسط، اضغط برفق باستمرار على الماوس. استخدم المؤشر والأصابع الوسطى للاحتفاظ بأعلى جسم الماوس وإبهامه لساقه اليسرى الخلفية. كن لطيفًا ولكن حازمًا.
5. مع شطبة من الإبرة، وحقن 100 ميكرولتر من الخلايا تحت الجلد في لوحة الدهون الثديية في البطن الأيسر للماوس. مراقبة لبليب جيدة وأي تسرب، وضمان الماوس يستيقظ ويتحرك بسهولة بعد الحقن.
   1. تغيير الإبر بين كل فأر.
      ملاحظة: لا تسمح الإبرة لدخول تجويف البريتوني. وهذا من شأنه أن يسبب السرطان ينتشر بسرعة وليس ممثل النموذج. لضمان الحقن تحت الجلد، اسحب بلطف إلى أعلى على الإبرة عند إدخالها في وسادة الدهون الثديية في البطن الأيسر. إذا تم رفع الإبرة بسهولة إلى الأعلى ، يتم وضعها بشكل صحيح تحت الجلد.

3- الرصد

1. مراقبة الفئران على الأقل 3 مرات في الأسبوع للوزن، ودرجة حالة الجسم، وحجم الورم، وحالة الورم، والتنفس، ومستوى النشاط، والمظهر، والحركة. بمجرد أن يصل الورم إلى 0.7-0.8 سم في القطر ، ابدأ في المراقبة يوميًا.
   1. النظر في القتل الرحيم عندما يصل حجم الورم إلى 1.5 سم، أو فقدان الوزن يصل إلى 20٪، أو الانخفاض السريري الشديد في درجة حالة الجسم، حالة الورم، التنفس، مستوى النشاط، المظهر، أو الحركة لوحظ استنادا إلى المبادئ التوجيهية المؤسسية.
      ملاحظة: درجة حالة الجسم أمر بالغ الأهمية لمراقبة وزن الجسم قد يزيد مع زيادة الورم في الحجم، مما يلغي فقدان حالة الجسم بسبب عبء المرض. وستعتمد بروتوكولات الرصد الدقيق على البروتوكولات المعتمدة أو على البروتوكولات المؤسسية.

4. نكروبسى

1. القتل الرحيم الماوس باستخدام CO₂ اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية.
2. رش الماوس مع 70٪ الإيثانول لتطهير. جعل شق يصل خط الوسط البطني من الماوس لفضح تجويف الجسم.
3. إزالة الكلى. استمر في قطع خط الوسط حتى يظهر الحجاب الحاجز. استخدم المقص لثقب الحجاب الحاجز لتفريغ الرئتين. تقليم الحجاب الحاجز للحصول على وصول أفضل إلى تجويف.
4. استخدام مقص حاد لقطع مركز القفص الصدري. دبوس القفص الصدري مرة أخرى لفضح الرئة والقلب.
5. اثقب القلب بـ 2 مل من 1x DPBS غير المعقم عن طريق إدخال إبرة في قمة القلب حتى تتجمع في تجويف البطن حيث تمت إزالة الكلى.
6. لإزالة القلب والرئتين، استخدم المقص الحاد لقطع المريء والقصبة الهوائية فوق القلب مباشرة. باستخدام ملقط، تبدأ لسحب القلب بعيدا عن الجسم وقطع بعيدا في أي نسيج الضام حفظه تعلق. الرئتين سوف يخرج مع القلب.
7. تحديد الرئتين المتعددة الفصوص (يمين) والفردية الفصوص (اليسرى). إبقاء القلب تعلق للرجوع اليها، ولكن بمجرد تحديد الرئتين، وقطع القلب بعيدا.
8. تسمية لوحة 12 بئر تحتوي على 1x هانك محلول ملحي متوازن (HBSS) في كل بئر. كل فأر يحتاج 2 آبار. ضع الرئة متعددة الفصوص (يمين) في لوحة 12 بئرًا لتقييم الانبثاث والاحتفاظ بالجليد. إبقاء المجاورة فارغة جيدا في الوقت الراهن.
   ملاحظة: من المهم استخدام نفس الرئة (متعددة الفصوص) من كل فأرة لضمان أن يكون حجم كل عينة قريباً. ويمكن بعد ذلك استخدام الرئة المفردة في تحليل آخر، مثل علم الأنسجة.
   ملاحظة: العينات مستقرة على الجليد أو عند 4 درجات مئوية لبضع ساعات.

5. تجهيز الأنسجة

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ كافة الخطوات في هذا المقطع باستخدام تقنية معقمة.

1. تسمية 15 مل أنبوب مخروطي لكل ماوس وإضافة 2.5 مل من نوع IV الكولاجين خليط و 30 وحدة من elastase إلى كل أنبوب. لجعل خليط الكولاجين من النوع الرابع، تذوب 2 ملغ من الكولاجين من النوع الرابع لكل مل 1x HBSS ومرشح معقمة. ويمكن تخزين هذا حتى 12 شهرا في -20 درجة مئوية وذوبانها عند الحاجة.
2. نقل الرئة إلى الثانية، نظيفة HBSS 1x جيدا لتلك العينة. دوامة باستخدام ملقط لإزالة أي الدم المتبقية. نقل رئة نظيفة إلى فارغة 3.5 سم لوحة ثقافة الأنسجة. رئة مفرومة بمقص. شطف لوحة مع 2.5 مل من 1x HBSS، ونقل 1x HBSS وقطع الرئة في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي بالفعل على كوكتيل الكولاجين /elastase (5 مل مجموع).
3. احتضان لمدة 75 دقيقة عند 4 درجة مئوية. مواصلة خلط العينات خلال هذا الوقت، حتى وضع أنابيب على عجلة الروك أو الدورية. خلال هذه الخطوة الحضانة، تسمية أنابيب أجهزة الطرد المركزي 50 مل و 10 سم لوحات ثقافة الأنسجة لكل فأرة. إذا كان القيام تخفيف, تسمية ما يكفي من 10 لوحات ثقافة الأنسجة سم لتخفيف.
   ملاحظة: تسمية غطاء لوحات زراعة الأنسجة. إذا وضع علامة على اللوحة نفسها ، فإن الكتابة ستتداخل مع تحليل Fiji-ImageJ.
4. جلب حجم كل أنبوب يصل إلى 10 مل مجموع مع 1X HBSS. صب محتويات على مصفاة 70 ميكرومتر خلية في أنبوب مخروطي 50 مل لكل عينة. استخدام المكبس من حقنة 1 مل لطحن بلطف العينة من خلال مصفاة للسماح لمزيد من الخلايا لتصفية من خلال.
5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 350 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT). تجاهل افرا وغسل بيليه مع 10 مل من 1x HBSS. كرر هذه الخطوة مرتين.
6. Resuspend بيليه في 10 مل من 60 μM 6TG وسائل الإعلام ثقافة كاملة، إما RPMI أو IMDM. عينات لوحة في 10 سم لوحات ثقافة الخلية، وذلك باستخدام مخطط التخفيف إذا رغبت في ذلك. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ لمدة 5 أيام.
   ملاحظة: 1:2، 1: 10، و 1:100 هي التخفيفات الشائعة التي سوف تحتاج إلى أن يتم تحديد تجريبيا استنادا إلى معلمات الدراسة.
   تنبيه: 6TG سام. توخ الحذر عند التعامل مع جميع إرشادات الصحة والسلامة البيئية للتخلص منها.

6. تلطيخ لوحات

1. صب وسائل الإعلام الثقافة قبالة لوحات في حاوية النفايات المناسبة. قم بإصلاح الخلايا بإضافة 5 مل من الميثانول غير المخفف لكل لوحة واحتضان لمدة 5 دقائق في RT ، مع التأكد من دوامة الميثانول بحيث يغطي اللوحة بأكملها.
   تنبيه: الميثانول خطير إذا تم تناوله أو استنشاقه أو على الجلد. استخدام غطاء الدخان لهذه الخطوة.
2. صب الميثانول قبالة لوحات في حاوية النفايات المناسبة. شطف لوحات مع 5 مل من الماء المقطر في كل لوحة وصب الماء في حاوية النفايات المناسبة. إضافة 5 مل من 0.03٪ الميثيلين الأزرق لكل لوحة واحتضان لمدة 5 دقائق في RT، مع التأكد من دوامة الميثيلين حل الأزرق بحيث يغطي لوحة كاملة.
3. صب الميثيلين الأزرق في حاوية النفايات المناسبة. شطف لوحات مرة أخرى مع 5 مل من الماء المقطر في لوحة. بدوره لوحات رأسا على عقب ولطخة ضد منشفة ورقية لإزالة السائل الزائد. ضع لوحة على غطاءها ودع الهواء يجف بين عشية وضحاها في RT.
   ملاحظة: ستكون المستعمرات النقيلي زرقاء. مرة واحدة يتم تجفيف لوحات، ويمكن تخزينها في RT إلى أجل غير مسمى.

7. تحليل الصور

1. إزالة الأغطية المسمى من لوحات، مع الحرص على ضمان تحديد واضح للعينات. صف جميع لوحات الرئة الملطخة على سطح نظيف وخفيف لالتقاط صورة لجميع اللوحات في صورة واحدة.
2. التقاط صورة من مجموعة من لوحات في منطقة مضاءة جيدا، مع التأكد من تقليل انعكاسات لوحات هي عاكسة جدا. سوف انعكاسات في لوحات تؤثر على تحليل الصورة، وبالتالي يجب تجنبها.
   ملاحظة: لدى Fiji-ImageJ حد أعلى من 2 جيجابكسل. معظم الهواتف الذكية الحديثة لديها كاميرات كافية. لا تستخدم كاميرا أقل من 8 ميغابكسل. كانت الكاميرا المستخدمة في هذه التجربة 12.2 ميجابيكسل على Google Pixel 2.
3. احصد الصورة لتضمين اللوحات، لكن استبعد الأغطية أو أي شيء آخر في خلفية الصورة. تحميل الصورة المقتصة في فيجي-ImageJ.
4. تغيير الصورة إلى بالأسود والأبيض باستخدام الأوامر التالية: صورة، ضبط، لون عتبة، أسلوب العتبة: الافتراضي، لون العتبة: B&W، مساحة العتبة: Lab. إلغاء تحديد مربع الخلفية الداكنة. يجب أن تكون الصورة الآن بالأبيض والأسود. يمثل الأسود خلفية الضوء، والأبيض يمثل المستعمرات النقيلي الأزرق.
5. باستخدام أداة Circle على شريط أدوات Fiji-ImageJ، حدد المنطقة التي سيتم تحليلها. رسم دائرة واحدة لاستخدامها لجميع لوحات لضمان تحليل كل لوحة للمنطقة ذات الحجم نفسه. اختر حجمًا يزيد من المساحة التي تم تحليلها على اللوحات مع تقليل الضوضاء الخلفية التي تظهر على حافة اللوحات. يظهر الحجم في شريط الأدوات كما يتم رسمها، لذلك فمن الممكن لجعل دائرة مثالية عن طريق مراقبة الارتفاع والعرض كما يتم رسم الدائرة.
6. تحليل الدائرة المحددة لتحديد النسبة المئوية للمنطقة البيضاء، والتي تمثل مساحة اللوحة التي تحتوي على مستعمرات نقائل زرقاء. استخدم الأوامر التالية:
   تحليل، تحليل الجسيمات، الحجم (بكسل^2):0-اللانهاية، دائري: 0.00-1.00، إظهار: لا شيء، والتحقق من مربع تلخيص. ضرب موافق.
7. تسجيل نتيجة ٪ناحية. هذه هي النسبة المئوية للمنطقة المحددة التي تكون بيضاء، وبالتالي تمثل العبء النقيلي.
   ملاحظة: من المستحسن إما حفظ النتائج في Fiji-ImageJ أو نسخ/لصق صفحة النتائج بأكملها في مستند منفصل. إذا كانت نسبة ٪ من نتائج المنطقة غير متوقعة أو مريبة، فمن الممكن معرفة ما إذا كان أي من القياسات الأخرى مريبًا أيضًا أو إذا تم تسجيل ٪ Area بشكل غير صحيح.
8. تحريك الدائرة ، دون تغيير حجمها عن طريق الاستيلاء عليها في وسطها ، إلى لوحة المقبل في الصورة. كرر الخطوتين 7.6 و 7.7 لكافة اللوحات في الصورة.
9. كرر الخطوات من 7.1 إلى 7.8 على صورتين إضافيتين على الأقل. بمجرد تحليل جميع اللوحات والصور، متوسط نسبة النتائج بين الصور المختلفة لكل لوحة للتخفيف من أي تناقضات بين الصور.

النتائج

هذه الطريقة تحتوي على تعديلات بسيطة من بولاسكي وأوستراند روزنبرغ 4T1 بروتوكول³ ويمكن تصورها في الشكل 1. عندما 3 الباحثين منفصلة عد يدويا مستعمرات النقيلي ل 12 لوحات الرئة (1:10 تخفيف)، وكانت النتائج غير متناسقة جدا بين عدادات مختلفة (الشكل 2A). تم توجي...

Discussion

كما هو موضح، يمكن أن يكون عد المستعمرات النقيلي يدويا على كل صفيحة الرئة طريقة غير دقيقة وغير دقيقة لتحديد نسل الرئة، مما يدل على الحاجة إلى وسيلة أفضل للقياس الكمي(الشكل 2). اختلف التحليل الهدولوجي قليلاً عن كل من الفرز اليدوي وتحليل فيجي-ImageJ(الشكل 2B و4D...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia chamber	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Anesthetic agent	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
BALB/c Female Mice	The Jackson Laboratory	000651
Blunt scissors	Roboz	RS-6700
Calculator	Any	Any
Camera	Any	Any	Minimum of 8 megapixels
Centrifuge	Any	Any	Needs to be capable of 125 x g and 300 x g
CO2 euthanasia setup	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Cold room, refrigerator, cold storage	Any	Any
Computer with Fiji-ImageJ	Any	Any	Needs to be capable of running Fiji-ImageJ
Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-10
Curved scissors	Roboz	RS-5859
Distilled water	Any	Any
Elastase	MP Biomedicals	100617
Electronic scale	Any	Any
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11150
Forceps	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubator	See comments	See comments	Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methylene blue	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillin Streptomycin	ATCC	30-2300
Pins or needles	Any	Any	For pinning down mice during necropsy
Plastic calipers	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Rocker or rotating wheel	Any	Any
Sharp scissors	Roboz	RS-6702
Sterile disposable filter with PES membrane	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flasks	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flasks	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flasks	Fisher Scientific	13-680-65
Tri-cornered plastic beaker	Fisher Scientific	14-955-111F	Used to weigh mice
Trypan blue	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Type IV collagenase	Sigma-Aldrich	C5138
3.5 cm tissue culture plates	Nunclon	153066
1 mL syringe	BD	309659
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
10 cm tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-22
12 well plate	Corning	3512
15 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 in needles	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM cell strainer	Fisher Scientific	22-363-548
70% ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Dilute to 70% with DI water